RNA干扰靶向沉默EGFR基因对卵巢癌耐药细胞凋亡影响的实验观察

目的:探讨RNA干扰表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP凋亡的影响。方法:利用基因重组技术构建携带EGFR小发夹干扰RNA(pEGFR-shRNA)的重组质粒表达载体,脂质体法转染SKOV3/DDP细胞。实验分组:对照组(不进行干扰)、S1组(转染非特异性质粒)、S2组(转染特异性质粒)。用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学法(ICC)检测转染后细胞内EGFRmRNA和蛋白的表达,流式细胞仪(FCM)分析细胞周期和凋亡率。结果:与对照组相比,S2组细胞EGFRmRNA的表达明显受抑制,抑制率达57%(P<0.01)。蛋白质的表达水平显著降低(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,顺铂作用24h后,特异性转染组细胞周期分布发生明显改变,G0/G1期细胞比例增多,而S期细胞比例减少,凋亡率显著升高(P<0.01)。结论:RNA干扰EGFR基因通过抑制SKOV3/DDP细胞中EGFR基因的表达,恢复细胞对顺铂的敏感性。     

RNA干扰沉默EGFR基因对卵巢癌细胞侵袭力的影响

[目的]通过小于扰RNA（siRNA）沉默EGFR基因的表达，探讨其对卵巢癌SKOV3细胞体外侵袭力的影响。[方法]体外构建靶向EGFR基因的siRNA质粒和阴性对照质粒，Lipofectamine2000介导转染到SKOV3细胞中。实验分3组：空白对照组、非特异性转染组、特异性转染组。RT-PCR和免疫细胞化学法检测EGFR基因和蛋白水平表达。平板克隆形成法检测细胞生长增殖能力，Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力。[结果]特异性转染组细胞EGFR基因mRNA和蛋白表达的抑制率分别为52．3％和51．8％．克隆形成抑制率和侵袭抑制率分别为47．4％和40．1％。[结论]siRNA可以有效抑制SKOV3细胞EGFR基因的表达，抑制其增殖能力和体外侵袭能力。     

靶向EGFR的RNA干扰诱导非小细胞肺癌细胞A549凋亡的研究

目的:探讨短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的靶向EGFR基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549的凋亡诱导作用。方法:构建靶向人EGFR基因的表达shRNA的质粒(pShEGFR),转染A549细胞,应用RT-PCR分析EGFR mRNA的表达情况,采用MTT法检测A549细胞的生长状况,通过流式细胞仪以及PI染色法进行细胞凋亡的定量检测和形态学分析。结果:pShEGFR转染组A549细胞中EGFR mRNA的表达水平,较转染同一载体连接无关序列的对照组(pShNEG组)、单纯脂质体组及PBS阴性对照组A549细胞均明显降低,F=425.640,P=0.000,其中较PBS阴性对照组细胞降低了74.5%。转染pShEGFR的A549细胞与3种不同对照组细胞相比,生长受到明显抑制,F=107.428,P=0.000,生长抑制率达54.9%,而转染pShNEG组和单纯脂质体组的A549细胞生长抑制率则分别为20%和3.1%。流式细胞仪检测结果显示,pShEGFR组细胞存在32.8%的凋亡率,PI荧光染色可见pShEGFR组细胞呈现出典型的凋亡形态学变化。结论:质粒介导的靶向人EGFR基因的pShEGFR能够有效地干扰NSCLC细胞系A549中EGFR基因的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长,诱导肿瘤细胞的凋亡。     

RNA干扰抑制人结肠癌SW480细胞EGFR的表达及其对体外生长情况影响的研究

目的研究利用RNA干扰技术抑制人结肠癌SW480细胞表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,并观察受抑制后SW480细胞体外生长情况的改变。方法利用脂质体将siRNA转染进入SW480细胞(野生型K-ras基因表达阳性),在细胞内形成双链siRNA,识别并降解EGFR mRNA。通过荧光定量RT-PCR检测EGFR mRNA的表达水平,Western blot检测EGFR蛋白的表达,MTT法检测SW480细胞的增殖抑制情况,流式细胞学检测细胞凋亡情况。结果转染EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA的SW480细胞其EGFRmRNA及蛋白表达均较对照组明显降低(P<0.05);转染EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA的SW480细胞增殖率较对照组降低(P<0.05),凋亡率增高(P<0.05)。结论 siRNA能有效抑制SW480细胞EGFR基因的表达,具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。     

卵巢癌耐药相关微小RNA的研究进展

越来越多的证据表明,微小RNA(miRNA)的异常表达与肿瘤发生发展、转移及预后等密切相关.最近研究发现,异常表达的miRNA与卵巢癌化疗抵抗相关,提示miRNA将可能成为卵巢癌治疗的新靶点.进一步阐明miRNA与卵巢癌耐药的相关机制将有利于miRNA靶向治疗的研究.     

靶向ERCC1 RNA干扰对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转

目的:探讨利用RNA干扰技术切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-completion gene 1,ERCC1)逆转耐顺铂(cisplatin,CDDP)人肺腺癌细胞A549/CDDP的耐药性。方法:(1)常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的ERCC1-siRNA转染细胞,转染浓度分别为100、200、300 nmol/L,并设空白转染、Lip转染对照组,观察转染效果。(2)采用免疫组化SABC法及RT-PCR法分别检测肿瘤细胞转染siRNA后ERCC1基因和蛋白的表达。(3)MTT法检测肿瘤细胞耐药指数,观察ERCC1靶向siRNA逆转A549/CDDP细胞顺铂耐药的效果。结果:(1)Lip组、siRNA-neg组转染效率分别为(56.38±9.82)%、(63.54±4.87)%,SiRNA-ERCC1①组、siRNA-ERCC1②组、siRNA-ERCC1③组转染效率分别为(43.62±6.08)%、(65.85±9.61)%和(78.93±4.86)%。(2)针对ERCC1的siRNA转染A549/CDDP后,细胞ERCC1 mRNA及蛋白表达均下调,siRNA-ERCC1(300 nmol/L)组效应最强,分别下降至(11.19±6.82)%和(20.88±6.57)%(P<0.01)。(3)A549/CDDP细胞转染后耐药倍数减为6.05、4.64、2.94,空载体对照组细胞的耐药倍数为9.6。结论:RNA干扰技术封闭ERCC1基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性,且呈一定的浓度依赖性;ERCC1基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点。     

siRNA靶向沉默COX-2对宫颈癌细胞VEGF、EGFR表达的影响

目的 探讨siRNA靶向沉默环氧合酶-2(COX-2)基因对宫颈癌HeLa细胞血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响.方法 以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象,采用COX-2 siRNA转染HeLa细胞作为转染组,以未转染的HeLa细胞作为空白对照组,以阴性对照siRNA转染HeLa细胞作为阴性对照组.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2、VEGF、EGFR基因的表达水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测COX-2、VEGF、EGFR蛋白的表达水平,MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,Tran-swell小室检测细胞的迁移和侵袭能力.结果 RT-PCR结果显示,转染组的COX-2、VEGF、EGFR基因表达水平均低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).Western blot结果显示,转染组的COX-2、VEGF、EGFR蛋白表达水平均低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).MTT检测结果显示,转染组的细胞增殖抑制率高于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).流式细胞仪检测结果显示,转染组的细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).Transwell小室检测结果显示,转染组的细胞穿透率低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).结论siRNA靶向沉默COX-2基因能够抑制HeLa细胞中VEGF和EGFR的基因及蛋白表达水平,促进HeLa细胞凋亡,抑制HeLa细胞增殖,降低HeLa细胞的迁移及侵袭能力.     

RNA干扰沉默AKT基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖与凋亡影响研究

目的：通过小分子干扰RNA（siRNA）技术沉默卵巢癌SKOV3细胞中P13K／AKT信号通路关键基因蛋白激酶B（protein kinase B,PKB／AKT）基因的表达,探讨其对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响。方法：人卵巢癌SKOV3细胞体外培养,随机分为对照组、空白载体组和siRNA干扰组,siRNA干扰组通过脂质体介导AKTsiRNA转染SKOV3细胞。荧光定量PCR法检测AKT在干扰前后AKTmRNA的表达,免疫荧光细胞化学法检测P13K、AKT与PCNA蛋白在各组中的表达,MTT法检测细胞增殖抑制情况,流式细胞仪AnnexinV／pI法检测细胞凋亡率的变化。结果：siRNA干扰组AKTmRNA的表达量为（O．325±0．04）明显抑制,并显著低于对照组,q=58．96,P〈O．001;免疫荧光细胞化学结果示,siRNA干扰组的AKT、PCNA蛋白的荧光强度较对照组与空白载体组明显降低,而P13K蛋白在3组间差异无统计学意义,P=0．637;流式细胞仪AnnexinV／PI法检测结果示,siRNA干扰组细胞凋亡率高达（79．52±2．31）％,较对照组（27．35±2。01）％与空白载体组（28．64±1．96）％明显升高,约是空白载体组（q=60．880,P〈0．001）与对照组（q=58．553,P〈0．001）的3倍,差异有统计学意义。结论：AKTsiRNA可干扰AKT基因的表达,抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,促进其凋亡,有望成为治疗卵巢癌的新方法。     

靶向ERCC1 RNA干扰对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转

目的: 探讨利用RNA干扰技术切除修复交叉互补基因1（excision repair crosscompletion gene 1，ERCC1）逆转耐顺铂 (cisplatin,CDDP)人肺腺癌细胞A549/CDDP的耐药性。方法：(1) 常规体外培养A549/CDDP细胞，以脂质体包裹的ERCC1siRNA转染细胞，转染浓度分别为100、200     

RNA干扰下调RhoA表达对卵巢癌细胞SKOV-3恶性表型的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)下调RhoA表达对卵巢癌细胞SKOV-3恶性表型的影响.方法:构建RhoA基因特异性短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,以脂质体介导转染卵巢癌细胞SKOV-3,RT-PCR和蛋白质印迹法检测RNAi后SKOV-3中RhoA的mRNA及蛋白表达水平变化;Boyden小室体外侵袭和划痕实验观察细胞侵袭和迁移能力,MTT比色法测定转染前后细胞增殖及粘附能力的变化.结果:转染RhoA shRNA的实验组细胞与转染空载体的对照组细胞比较,RhoA mRNA的表达分别为(5.46±2.02)%和(56.37±17.42)%,蛋白质的表达分别为(6.03±2.04)%和(59.03±19.94)%,细胞平均侵袭百分比为(15.84±4.17)%和(33.64±4.64)%,愈合百分比为(44.79±6.21)%和(68.36±4.46)%,增殖能力(A值)分别为0.726±0.166和1.703±0.340,P<0.05(n=3);而粘附能力(A值)分别为0.833±0.137和0.894±0.189,P>0.05(n=3).结论:通过RNAi降低RhoA的表达能降低卵巢癌细胞SKOV-3体外侵袭、迁移和增殖能力.     

RNA干扰技术抗非小细胞肺癌作用的体内实验研究

Objective  

Lung cancer has emerged as a leading cause of cancer death in the world. Current therapies are ineffective, thus new approaches are needed to improve the therapeutic ratio. RNA interference (RNAi) has shown promise in gene silencing in vitro, the potential of which in developing new methods for the therapy of non-small-cell lung cancer (NSCLC) needs to be further tested in vivo. In this study, chemically synthesized double-stranded RNA (dsRNA) targeting epidermal growth factor receptor (EGFR) was transfected into NSCLC cell line SPC-A1 cells and established the tumor burdened athymic nude mice model to investigate whether dsRNA could induce gene silencing in NSCLC cells in vivo.     

吉非替尼联合靶向EGFR DNA疫苗对小鼠Lewis肺癌细胞体内外的抑制作用

目的：探讨吉非替尼（gefitinib）联合靶向EGFR DNA疫苗对小鼠Lewis肺癌体内外的抑制作用。方法：用鸡EGFR与兔IgG Fc段异种融合DNA疫苗pVAX1/cEGFRrFc免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法测定抗血清的效价。MTT法检测Lewis细胞的生长情况。建立Lewis肺癌鼠移植瘤模型,随机分为疫苗组、吉非替尼组、吉非替尼+疫苗组和对照组,观察各组小鼠肿瘤体积、重量及生存情况。结果：pVAX1/cEGFRrFc DNA疫苗免疫小鼠后抗EGFR血清效价为1∶1 000。与抗血清组或吉非替尼组相比,抗血清+吉非替尼组可显著抑制Lewis细胞的生长（P<0.05)。体内实验显示,吉非替尼+疫苗组小鼠移植瘤生长缓慢, 荷留小鼠生存率显著提高（P<0.01） 。结论：以EGFR为靶点的DNA疫苗和靶向药物吉非替尼之间具有协同性抗肿瘤作用,DNA疫苗主动免疫可以提高吉非替尼的疗效。     

RNA干扰下调不同肿瘤细胞表皮生长因子受体表达及其意义

背景与目的：表皮生长因子受体在多种上皮源性肿瘤中过表达，与肿瘤的发生、发展密切相关，是肿瘤治疗的重要靶点。本研究采用针对EGFR的小干扰RNA（siRNA），探讨其在不同类型肿瘤细胞A431、HeLa、SPC-A-1中的RNA干扰效应。方法：化学合成针对EGFR的siRNA，转染A431、HeLa、SPC—A-1细胞，通过定量RT-PCR、免疫荧光染色和流式细胞仪检测EGFR表达；通过集落形成实验观察细胞集落形成能力，分析不同类型肿瘤细胞的RNA干扰效应。结果：转染siRNA-EGFR后，3种肿瘤细胞的EGFR表达均明显下调。在A431细胞，其mRNA水平下调73．9％，蛋白水平下调77．0％。在HeLa和SPC-A-1细胞，mRNA水平的下调分别为44．6％和57．7％。蛋白水平下调61．3％和65．2％。EGFR下调后细胞集落形成能力均出现抑制，A431、HeLa和SPC-A-1的集落形成抑制率分别为27．2％、53．9％和59．1％。结论：siRNA-EGFR可在不同类型肿瘤细胞中产生RNA干扰效应。抑制细胞集落形成能力。RNA干扰技术在开发广谱抗肿瘤靶向治疗药物中具有应用价值。     

卵巢癌组织EGFR及下游信号分子的表达及其临床意义

目的:探讨表皮生长因子受体(EG-FR)、蛋白激酶B(PKB/Akt)、Ras相关因子-1(Raf-1)mRNA在上皮性卵巢癌组织中表达的临床意义、相关性及对预后的影响。方法:转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测14例正常卵巢组织、16例卵巢良性肿瘤组织及61例上皮性卵巢癌组织中EGFR、Akt和Raf-1 mRNA的表达,并分析它们与临床病理参数之间的关系及其相关性。结果:卵巢癌组织中EGFR、AKT和Raf-1阳性表达率分别为78.7%(48/61)、80.3%(49/61)和75.4%(46/61),显著高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤组织,P<0.05;三者表达水平均与卵巢癌手术病理分期及淋巴结转移有关,P<0.05;EGFR、Akt表达水平与细胞学分级有关,P<0.05;EGFR与Raf-1及Akt与Raf-1之间的联系有统计学意义,P<0.05。结论:上皮性卵巢癌组织EGFR、Raf-1和Akt的过表达与卵巢癌的发生发展及侵袭有关,可能为多靶点联合治疗提供新方向。     

RNA干扰技术抑制A549细胞表皮生长因子受体表达的研究

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549细胞表皮生长因子受体(EGFR)表达后,对A549细胞生物学特性的影响。方法体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA),用Lipofectamine 2000转染A549细胞,采用Western blot技术和流式细胞仪检测EGFR的表达,并观察A549细胞周期、集落形成、化疗敏感性等生物学特性的改变。结果序列特异性dsRNA-EGFR可显著抑制A549细胞EGFR表达;dsRNA-EGFR组细胞生长抑制率为85．0％,集落形成抑制率63．3％;细胞周期分析结果表明,dsRNA-EGFR组G0～G1期细胞数较对照组增加了12．7％,进入S期的细胞数较对照组减少了6．6％。转染dsRNA-EGFR后,可将A549细胞对顺铂的敏感性提高约4倍。结论dsRNA-EGFR可有效抑制A549细胞EGFR的表达,并将更多的细胞阻滞在G0～G1期,抑制细胞增生,显著增加细胞对顺铂的敏感性。RNAi可能为NSCLC的基因治疗提供新策略。     

表皮生长因子受体靶向抑制剂在食管癌中的应用

食管癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)过度表达与肿瘤恶性程度、侵袭转移等呈正相关.EGFR在食管癌组织中的表达可能对放化疗敏感性有预测作用.初步临床研究显示,EGFR靶向抑制剂有一定疗效,正在进行的Ⅱ、Ⅲ临床试验结果值得期待.