抗人胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备胃癌相关蛋白GCRG224的多克隆抗体,为进一步深入研究其生物学功能及其在胃癌发生发展中的作用奠定基础.方法 在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰兔,制备抗GCRG224的多克隆抗体.分别用ELISA、Western blot法鉴定抗体的效价及特异性.结果 在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约为16.8kD的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品.制备了抗GCRG224多克隆抗体.ELISA法检测抗体的效价达到1∶256 000,Western blot证实该抗体可与原核表达的GCRG224蛋白特异性结合.结论 成功地制备了胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体.     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法 将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,按正向、反向克隆人真核表达载体pcDNA3．1（＋）。测序正确的重组子pcDNA3．1-a（含GCRG213正向克隆）、pcDNA3．1-b（含GCRG213反向克隆）和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,采用半定量RT-PCR及Western blot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,Annexin VFITC／PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。与对应的空载体比较,转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35．4%,蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32．1％,蛋白的表达下调50．3％。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快,凋亡率下降,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢,凋亡率增加。结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞凋亡,可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。     

人睫状神经营养因子的克隆与原核表达

目的：克隆人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，并探索其在大肠杆菌中高效表达。方法：提取总ＲＮＡ，逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），序列测定正确后原核表达并用制备电泳纯化。结果：克隆了人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达量至少达到２６％，制备电泳纯化后，重组蛋白纯度达到９５％。结论：从胎儿坐骨神经组织中克隆到人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，制备电泳纯化出高纯度的重组蛋白     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

目的：在大肠杆菌系统中表达有活性的人β-防御素3(hBD3)。方法：从pGE-T-hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因，插入pGEX-4T-1构建pGEX-4T-1-hBD3融合表达载体，转化E．coli DH5α宿主菌，进行IPTG诱导，诱导菌经超声裂解后获得包涵体，包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST-hBD3融合蛋白，再经凝血酶切割。获得纯化的重组hBD3(rhBD3)。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果：以与GST融合表达的方式，运用pGEX-4T-1系统在大肠杆菌中表达了hBD3，融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使删释放出来，其对金黄色葡萄球菌的MIC为4μg/ml；对大肠杆菌的MIC为8μg／ml。结论：采用pGEX-4T-1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。     

恙虫病东方体Karp株主要外膜蛋白基因的克隆与表达

目的：表达恙虫病东方体(Orientia tsutsugomushi)Karp株56000表面蛋白，探索其作为诊断抗原的可能性。方法：采用PCR方法，从Ot．Karp株菌种基因组DNA中扩增出56000成熟蛋白基因片段，将该片段克隆于原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30／56，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测目的蛋白的表达。结果：(1)获得长约l500bp的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因；(2)SDS-PAGE电泳和免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子质量约为56000的独特蛋白带；(3)表达后菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在；(4)重组表达质粒序列分析结果显示，pQE30／56中插入的基因片段的序列与已报道的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因序列基本一致。结论：获得了Ot．Karp56000蛋白基因，并在大肠杆菌中实现了表达，表达的重组蛋白具有免疫反应性。     

青霉素结合蛋白2a C-末端在大肠杆菌M15中的表达、纯化及鉴定

目的构建含目的基因mecA C末端的重组子并在大肠杆菌M15中进行蛋白表达。方法采用PCR方法扩增mecA C末端DNA，将其与表达载体pQE30连接；再通过PCR及双酶切鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒转化大肠杆菌M15后，用1mmol／L的IPTG进行诱导表达。应用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pQE30-mecA重组表达质粒，转化大肠杆菌M15，经IPTG诱导表达，亲和层析纯化获得分子量为39．7kDa的蛋白；Western blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论在大肠杆菌内成功表达具有活性的PBP2a，为后期研究和开发抗MRSA药物奠定了基础。     

HER-2/neu配体结合区蛋白的表达、纯化及复性研究

目的：将HER-2/neu配体结合区(RLD)基因重组，并在大肠杆菌中表达，对以包涵体形式表达的融合蛋白进行变性和复性的研究。方法：采用PCR技术将皿R-2／neuRLD的两段基因分别扩增，并利用基因片段末端的共同酶切位点将两段基因相连接，连接产物插入原核表达载体，在大肠杆菌中实现融合蛋白的表达。表达产物经SDS-PAGE和Westem印迹检测后，进行蛋白质的变性、纯化和复性等处理。结果与结论：在大肠杆菌中实现了融合蛋白的高效表达，表达产物可被特异性抗体识别。经SDS-PAGE分析，表达产物以包涵体形式存在，通过变性、纯化和复性等处理，获得了含两个RID的融合蛋白，从而为HER-2／neu肿瘤疫苗的研究打下了基础。     

人CD147胞内结构域蛋白的表达与纯化

目的 构建人CD147胞内结构域（CD147 intracellular domain,CD147ICD）融合蛋白质粒,表达、提取、纯化CD147ICD蛋白并进行蛋白质互作分析。方法 将CD147ICD的cDNA片段插入pET-32a(+)质粒载体后,转化大肠杆菌Origami B(DE3)感受态细胞,大量培养后用异丙基硫代-β-d-半乳糖苷诱导蛋白表达,超声破碎法裂解细胞,采用Ni-Sepharose FF预装柱纯化TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白,经凝血酶酶切、超滤后获得CD147ICD蛋白。结果 CD147ICD融合蛋白质粒经测序比对后表明构建成功;采用Ni-Sepharose FF预装柱纯化的TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白纯度和浓度均较高,经凝血酶酶切、超滤后获得的CD147ICD蛋白纯度在95%以上,蛋白浓度为0.74 mg/mL。结论 纯化出了高纯度的、具有生物学活性的CD147ICD蛋白,为CD147ICD互作分子的鉴定及结构解析奠定了基础。     

人宫颈癌细胞辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接新亚型的表达及多克隆抗体制备

目的 制备宫颈鳞癌细胞中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)选择性剪接新亚型NRDRBl多克隆抗体,为NRDRBl的功能研究奠定基础.方法 扩增NRDRBl开放阅读框,重组入Gateway原核表达系统pDEST14,并在大肠杆菌BL21-AI中诱导表达,制备NRDRBl包涵体,使用从SDS-PAGE凝胶中回收的NRDRB1重组蛋白作为免疫原,经肩胛骨下注射免疫新西兰白兔.斑点杂交测定抗血清效价,HiTrap Protein G柱纯化兔IgG,免疫印迹和免疫组织化学鉴定抗体特异性.结果 NRDRB1在大肠杆菌B121-AI中高效表达,回收的NRDRB1蛋白溶液浓度为0.42mg/ml.所有免疫的动物在第2次追加免疫之后都产生了高效价的抗血清.血清效价为1∶2 000,对NRDRB1蛋白的检测极限是6.40g.纯化后的NRDRB1抗体具有较高的免疫活性和特异性.结论 NRDRB1原核表达载体的构建、蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备为今后研究该蛋白的功能奠定了良好的基础.     

NK细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL1胞外区的表达及纯化

目的 表达并纯化NK细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL1胞外区.方法 以pUC57-KIR3DL1为模板,PCR扩增KIR3DL1胞外区序列,与pGEM-T载体进行A-T克隆;测序正确后,采用定向克隆的方法将KIR3DL11胞外区基因连接到pET28a-DsbA载体上,成功构建了pET28a-DsbA/KIR3DL1重组质粒.将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导DsbA-KIR3DL1融合蛋白表达,溶解于8mol/L尿素中的包涵体经Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,成功进行复性,再经Superdex 75凝胶层析柱进一步纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的 蛋白的表达及纯化.结果 表达产物呈部分可溶性表达,包涵体纯化后证实获得纯度95%以上的DsbA-KIR3DS1融合蛋白.结论 KIR3DL1胞外区的成功表达及纯化为进一步研究KIR3DL1与相应配体之间的相互作用奠定了基础.     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

新预测的Ⅲ型分泌系统毒力蛋白Z3672的基因克隆、表达及纯化

目的：克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7新预测毒力蛋白Z3672,以进一步开展其结构与功能的研究。方法：利用PCR方法从EHECO157：H7基因组中扩增出基因z3672,构建重组表达质粒,经测序证实后,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现诱导表达,采用质谱分析法和Western印迹试验进行鉴定,通过洗涤包涵体纯化目的蛋白。结果：构建了pET-24a-z3672重组质粒,经酶切及测序鉴定与预期序列一致,实现了目的蛋白的融合表达,并且对蛋白条带的质谱分析证实了表达蛋白即为Z3672蛋白。纯化后目的蛋白的纯度〉90％。结论：得到了新预测的毒力蛋白Z3672,为下一步研究蛋白功能,并进一步研究EHECO157：H7的致病机制奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒（sARSCoV）N蛋白的DNA,构建原核表达质粒pGEX-2T／N,并诱导表达。方法采用RT-PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌中表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS-CoV抗体阳性血清做Western blot。结果获得N基因片段;GST-N融合蛋白以可溶形式表达;Western blot检测表明,其与抗SARS-CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论成功地构建原核表达质粒pGEX-2T／N,并表达GST-N融合蛋白,为下一步的研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌外毒素A表达载体的构建及可溶性表达

目的 实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的可溶性表达。方法 用基因重组技术构建pMAL-PEA原核分泌型表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果 酶切鉴定及测序结果表明pMAL-P2X载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的20％。表达产物经超声处理后,80％的融合蛋白存在于上清液中,说明实现了PEA的可溶性表达。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳,显示为一条蛋白带,分子量约为112kD。结论成功地对PEA全基因进行了可溶性表达和纯化,获得了稳定表达的工程菌,为深入研究：PEA的致病机制和制备用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。     

长双歧杆菌NCC2705 ATP结合蛋白BL0034表达与活性检测

目的克隆长双歧杆菌NCC2705中ATP结合蛋白BL0034的基因,利用大肠杆菌表达并纯化GST-BL0034融合蛋白,测定其结合ATP的活性。方法以长双歧杆菌NCC2705基因组为模板PCR扩增BL0034基因,双酶切后连接到pGEX-4T-1表达载体上,转入大肠杆菌BL21中表达;用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂对可溶性的GST-BL0034融合蛋白进行纯化,并用Western印迹验证。结果将BL0034基因克隆至质粒pGEX-4T-1,构建表达载体pGEX-4T-1-BL0034。BL0034经0.05 mmoL/L IPTG诱导,16℃过夜表达,SDS-PAGE可见相对分子质量约为82×103的可溶性表达条带;亲和纯化GST-BL0034,Western印迹结果为阳性。对纯化后的融合BL0033蛋白结合ATP的能力进行了定量测定,每毫克BL0034蛋白能结合约40 nmol/L ATP。结论成功克隆了BL0034蛋白的基因,表达并纯化GST-BL0034蛋白,证实了BL0034与ATP具有较强的结合能力,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705 BL0034蛋白的功能奠定了基础,为阐明其在果糖ABC转运系统中如何通过水解ATP产生能量提供了前提。     

UROC28基因cDNA的克隆及其原核表达

目的：克隆人UROC28基因cDNA并在原核细胞中表达。方法：用RT-PCR从前列腺癌PC-3细胞系中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中。经测序证实后,用HindⅢ/EcoRI双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E.coliDH5α菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果：①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人UROC28基因cDNA;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-UROC28表达出相对分子质量（Mr）约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符。结论：成功克隆到人UROC28基因cDNA,并在E.coliDH5α中表达出GST-UROC28融合蛋白。     

噬菌体PaP3推定基因tls核酸内切酶活性的初步验证

目的 对BLAST推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的tls基因功能进行实验验证。方法 采用PCR方法从噬菌体PaP3基因组扩增出tls基因,克隆至pMDl8-T载体中,再经酶切纯化后将目的基因插入表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JMl09,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后收集包涵体,并用裂解缓冲液溶解包涵体蛋白。然后利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白,通过透析使H6-TLS复性。最后构建含有末端酶大亚基酶切位点的底物质粒pMD-cos,检测复性蛋白活性。结果 通过上述方法,成功构建了pQE-tls表达载体,融合蛋白H6-TLs表达量占菌体总量的30％。同时成功构建了目的蛋白的底物质粒pMD-cos。经由亲和层析初步纯化及透析复性后,H6-TLS可检测出核酸内切酶的活性,能将底物质粒部分线性化。结论 成功地获得了具有内切酶活性的H6-TLS融合蛋白,为tls基因的认证提供了实验证据,为进一步鉴定和利用该基因奠定了基础。