丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位重组蛋白体外刺激PBC患者PBMCs实验研究

目的:初步探讨丙酮酸脱氢酶复合物的E2亚单位(PDC-E2)与原发性胆汁性肝硬化(PBC)发病机制间的关系.方法:用纯化的PDC-E2重组蛋白体外刺激PBC患者外周血单个核细胞(PBMCs);3H-TdR掺入法检测PBMCs增殖情况;ELASA法检测细胞上清中TNF-α含量.结果:11例M2抗体阳性和1例AMA阳性的PBC患者中有8例出现不同程度PBMCs增殖,而2例AMA和M2抗体均阴性的PBC患者和4例AIH患者PBMCs均无增殖.11例M2抗体阳性的PBC患者刺激后TNF-α分泌均明显增加.结论:PBC患者外周血中存在针对PDC-E2的自身反应性T细胞;TNF-α可能在PBC的病理损伤中发挥重要作用.     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白(hLN)的单克隆抗体(McAb)。方法用纯化的人层粘连蛋白(hLN)作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株(2A1、3B5、2C4、4D1),培养上清的ELISA效价分别为:1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为:1×106、1×107、1×106、1×105;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

小鼠高迁移率族蛋白1cDNA克隆、原核表达与鉴定

目的:克隆并原核表达小鼠高迁移率族蛋白1(high mobility group box1,HMGB1).方法:从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,应用RT-PCR获得小鼠HMGB1cDNA,经PCR扩增小鼠HMGB1基因;通过T-A克隆将该基因构建到PMD-18T载体中,测序鉴定;将该基因插入pET-28a(+)表达载体,IPTG诱导后,可表达相对分子质量约30 kDa的蛋白.蛋白质印迹鉴定表达的目的蛋白.结果:经RT-PCR扩增得到648 bp的DNA片段,序列分析显示与基因库中报道的已知序列完全一致;构建了含有HMGB1编码序列的原核表达载体,经诱导表达、蛋白质印迹鉴定,获得相对分子质量约30 kDa的融合蛋白.结论:成功克隆和表达了小鼠HMGB1基因,为HMGB1蛋白的功能试验奠定了基础.     

风疹患儿及育龄妇女风疹病毒感染的血清学研究

用酶联免疫吸附试验(ELISA)对沈阳市1988年临床诊断为风疹的患儿,有致畸史或早孕感冒的育龄妇女及1986年正常产妇血清做风疹病毒抗体的测定。风疹患儿急性期血清54份,抗风疹病毒IgM抗体阳性率为27.78%,IgG抗体阳性率为24.07%,与对照组差别有高度统计学意义(P<0.01);2份恢复期血清IgM抗体均阳性,IgG抗体1份阳转,1份效价增高4倍。提示1988年沈阳市确有风疹流行。流行期有致畸史或早孕感冒的育龄妇女血清36份,抗风疹病毒IgM抗体阳性率为16.67%,非流行期正常产妇血清60份,IgM抗体阳性率为1.67%,两者差别有高度统计学意义(P<0.01)。提示流行期有致畸史或早孕感冒的育龄妇女与风疹感染有关。正常产妇血清的抗风疹病毒IgG抗体阴性率为13.33%。说明我国育龄妇女中风疹易感者较多。     

人Aβ42重组抗原的融合表达及Aβ抗体的检测

OBJECTIVE: To clone and express the recombinant amyloid beta-protein (Abeta(42)) antigen and develop a method for detecting Abeta antibody. METHODS: Two partially complementary fragments of Abeta(42) gene were chemically synthesized for constructing the Abeta(42) gene by PCR. The resultant Abeta(42) gene fragment was subcloned into pGEX-2T expression vector for inducing the expression of GST-Abeta(42) fusion protein, which was purified by affinity chromatography. The antigen specificity and reactivity of the purified GST-Abeta(42) fusion protein to Abeta monoclonal antibody were identified with Western blotting. Using either GST-Abeta(42) fusion protein or Abeta(42) peptide as the coating antigen, an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established for detecting Abeta antibodies in the serum of Abeta(42) polypeptide-immunized SD rats. RESULTS: GST-Abeta(42) fusion protein was successfully expressed as an soluble protein, which, after purification, was found to have a relative molecular mass of 31 kD. About 800 mg of GST-Abeta(42) fusion protein were obtained from l L cell culture with a purity over 95%. Western blotting demonstrated specific reaction of this purified GST-Abeta(42) fusion protein with Abeta monoclonal antibody. The sensitivity of the indirect ELISA for detecting Abeta antibody was about 2 ng/ml using GST-Abeta(42) fusion protein as the coating antigen. There was no significant difference in the results of Abeta antibody detection using either GST-Abeta(42) or Abeta(42) as the coating antigen (P>0.05). CONCLUSION: GST-Abeta(42) fusion protein may serve as a substitute for the expensive Abeta(42) peptide for detecting Abeta antibody.     

B病毒糖蛋白的原核表达及ELISA检测方法的建立

目的表达B病毒糖蛋白,筛选出具有较好检测敏感性和特异性的抗原或抗原组合,用以检测猴血清中的抗体。方法原核表达B病毒糖蛋白C,D和G,经纯化、复性后用蛋白印记验证其抗原性,建立ELISA法,对方法进行评价。结果3个表达抗原反应特异性较好;以BV-ELISA为标准,各抗原的检测敏感性分别是：BVgC-ELISA84.6％,BVgD-ELISA88.5％,BVgC＋gD-ELISA96.2％,检测特异性分别是：BVgC-ELISA93％,BVgD-ELISA85.7％,BVgC＋gD-ELISA64.3％。结论表达的3个BV重组抗原都具备作为替代抗原检测BV抗体的潜力。     

人Norpeg蛋白的原核表达及其抗体的制备

目的 原核表达Norpeg C端编码区并制备小鼠抗Norpeg多克隆抗体。方法 将Norpeg基因C端编码区克隆进原核表达载体pGEX4T-1中,转化E.coli,以WFG诱导重组蛋白的表达。以纯化的重组目的蛋白作为免疫原免疫小鼠,制备相应的多克隆抗体。结果 成功构建原核表达载体,表达了重组蛋白并制备了小鼠抗Norpeg多克隆抗体。结论 人Norpeg C端编码区能够在体外大肠杆菌中获得融合表达,制备的小鼠抗Norpeg多克隆抗体特异性较高,为下一步深入Norpeg功能研究提供了重要基础。     

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

成人甲状腺肿瘤褪黑素及褪黑素受体蛋白表达异常及意义

目的:研究甲状腺肿瘤患者褪黑素(Mel)及褪黑素受体(MR)蛋白表达的改变及意义。方法:取甲状腺肿瘤(腺瘤及腺癌)患者肿瘤(腺瘤旁1 cm为正常组织对照)匀浆及自身外周血用ELISA方法检测Mel浓度改变;取甲状腺肿瘤(腺瘤及腺癌)组织及瘤旁正常组织,石蜡包埋,切片,以免疫组化SP法检测MR蛋白改变。结果:ELISA方法显示甲状腺肿瘤组织匀浆上清Mel浓度较自身外周血明显增高(P<0.05,P<0.01);各组组织匀浆上清Mel浓度:甲状腺腺癌组高于腺瘤组和瘤旁组织组(P<0.05,P<0.01);甲状腺腺瘤组高于瘤旁组织组,但无统计学差异;免疫组化方法显示:成人甲状腺腺癌细胞细胞膜、细胞质和细胞核中MT2亚型蛋白均呈棕褐色强阳性染色卅,较腺瘤及瘤旁正常甲状腺组织±～+明显增加,mt1受体蛋白亚型表达无差异,均为±～+。结论:成人甲状腺肿瘤组织中Mel浓聚,存在mt1、MT2受体亚型。其中腺癌的细胞膜、细胞质、细胞核内MT2高表达。提示Mel与甲状腺肿瘤有一定关联,可能主要通过MT2受体发挥抗甲状腺腺癌作用。     

乙型肝炎病毒X基因克隆及其表达

目的：构建乙型肝炎病毒X基因原核表达载体,并诱导其表达。方法：从乙肝病人血清中提取HBV DNA;以带有EcoRI和Hind〖KG-*3〗Ⅲ酶切位点的引物,用PCR方法扩增X基因;而后定向克隆到原核表达载体pMAL-C2X上,经酶切鉴定和序列分析;以IPTG诱导X融合蛋白的表达。结果：PCR扩增显示有类似HBV X基因片断大小的条带;构建的原核表达重组体PMAL-C2X-HBV-X经酶切有相应大小的的基因插入片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因;这一重组体在IPTG诱导下有相应大小的X融合蛋白表达。结论：成功构建了HBV X基因原核表达重组体pMAL-C2X-HBV X;在IPTG的诱导下,该重组体在大肠杆菌中可表达X融合蛋白,为进一步纯化HBV X蛋白和研究其生物学作用奠定了基础。     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

人HT036蛋白的原核表达及鉴定

目的 原核表达人HT036蛋白并鉴定其正确性.方法 采用PCR技术,扩增人HT036蛋白编码序列,克隆至原核表达载体pET30a( )中,用IPTG诱导表达,免疫印迹鉴定.结果 PCR扩增得到了目的DNA片段,克隆至原核表达载体后经酶切与测序鉴定正确,并在大肠杆菌中获得高效表达,用抗His抗体鉴定融合蛋白表达正确.结论 成功构建了重组原核表达载体并正确表达了HT036蛋白.     

pQE-EGFP原核表达载体的构建及其表达和鉴定

目的:利用分子克隆技术构建原核表达载体pQE-EGFP,在大肠埃希菌中高效表达与鉴定。方法:以质粒pEGFP-N2为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,将其克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定表达蛋白质。结果:PCR扩增得到了EGFP全长结构基因。所构建的pQE-EGFP重组质粒经酶切及测序鉴定结果与设计序列一致;转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导后,目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量约为28 500,与理论预期值一致。结论:pQE-EGFP重组质粒的成功构建、表达和鉴定为TAT-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

蛋白激酶PRKX在肝癌组织中的表达及意义

目的 研究PRKX在肝癌组织中的表达和临床意义. 方法 收集36例肝癌患者肝癌组织(肝癌组)和癌旁肝组织(对照组).分别采用RT-PCR和Western blot的方法检测PRKX mRNA和蛋白在肝癌组和对照组中的表达. 结果 RT-PCR和Western blot结果显示,PRKX mRNA和蛋白在人肝组织有表达,且在肝癌组的表达显著高于对照组(mRNA肝癌组／mRNA对照组=1.48;蛋白肝癌组／蛋白对照组=1.14). 结论 PRKX在肝癌组织表达高于癌旁肝组织,可能与肝癌发生、发展相关.     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

甲基CpG结合域四聚体蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 在大肠埃希菌中表达甲基CpG结合域四聚体蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法 将重组表达质粒4×MBD-pET30b+转化大肠埃希菌DH5a克隆扩增并测序鉴定后,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后接种于LB 培养基中,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达, 表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达,用此蛋白免疫染色人胚肾细胞后用荧光显微镜观察。结果 克隆质粒测序结果与理论预期完全一致,SDS-PAGE显示在大肠埃希菌中表达出相对分子量为46 000的目标蛋白,Western blot显示目标蛋白带有His融合标签（氨基端）和HA标签（羧基端）。荧光显微镜观察显示MBD蛋白能与细胞内的甲基化CpG基序特异性结合。结论 成功表达并纯化了具有免疫原性的甲基CpG结合域四聚体蛋白,为今后进一步研究DNA甲基化奠定了基础。     

日本血吸虫Nanos样蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

目的 获得日本血吸虫Nanos样蛋白基因的cDNA 序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定.方法 应用PCR法扩增获得日本血吸虫Nanos样基因的完整开放阅读框(ORF),将该基因亚克隆到原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白.用纯化后的蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用 ELISA 和 W...     

PAP-a/CD81-LEL融合蛋白表达载体的构建

目的 探讨将商陆抗病毒蛋白-a（PAP-a）与CD81的胞外大环（CD81-LEL）融合,并在大肠杆菌内表达.方法 采用重叠延伸PCR方法,将PAP-a和CD81-LEL的基因拼接成PAP-a/CD81-LEL融合基因,并在两基因的连接处引入柔性肽段linker（GSGGSG）的核苷酸片断,然后将此融合基因克隆到原核表达载体PET-28a上,并在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 所获得的PAP-a/CD81-LEL融合基因经测序正确,并可以在大肠杆菌BL21中表达,经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量为50 KD.结论 PAP-a/CD81-LEL融合基因表达载体的成功构建与表达为进一步研究生物活性打下基础.     

肌球蛋白结合蛋白C的表达和鉴定

目的：探讨优化原核表达方法以及用亲和层析的方法制备重组人快型肌球蛋白结合蛋白C （MYBPC2）.方法：根据MYBPC2的序列设计一对引物,在上下游引物的5’端分别加上BamHI和HindⅢ酶切位点.以健康人骨骼肌cDNA为模版,扩增第284位至第579位氨基酸残基对应的碱基序列,经双酶切后插入pMalc-5e载体中,测序鉴定重组质粒的序列,将构建好的重组质粒转化大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白MYBPC2-MBP的表达,亲和层析纯化重组蛋白,蛋白电泳法鉴定蛋白的分子量及纯度,测定蛋白浓度并估算蛋白纯化后得率.用商品化的抗MYBPC2抗体证实所表达蛋白序列的正确性.以纯化的蛋白免疫动物获得动物免疫血清,用Western Blot的方法鉴定此蛋白的免疫原性.结果：人MYBPC2蛋白表达载体构建成功,每升大肠杆菌菌液可生产纯化后的重组MYBPC2蛋白约30mg,Western Blot显示重组蛋白与其抗体及抗血清特异结合.结论：本方法可以高效制备生产人MYBPC2蛋白片段,具备良好的抗原特异性和免疫原性.