携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建

目的　构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究。方法　将 MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183胞内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义 MRP的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- ASmrp。结果　成功地构建了携带反义 MRP的重组腺病毒载体系统 ,经测定病毒滴度可达 2 .5× 10 9。结论　构建的重组腺病毒 Ad Easy- GFP-ASm rp可望有效地将反义 MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

结缔组织生长因子的克隆及其重组腺病毒的构建

目的:克隆结缔组织生长因子(CTGF)及制备表达CTGF基因的重组腺病毒.方法:体外克隆出CTGF并将该基因采用定向克隆的方法克隆进入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,进一步采用同源重组方法将该质粒和腺病毒质粒Adeasy-1连接,然后用脂质体介导的方法导入包装细胞HEK293中产生表达目的基因的重组腺病毒,收集病毒液感染HCT116 wt骨软骨肉瘤细胞,通过荧光显微镜观察GFP和Western Blot检测CTGF蛋白的表达.结果:经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带该基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组腺病毒转染后可使HCT116 wt细胞CT-GF蛋白表达明显增加.结论:成功构建了携带CTGF基因的重组腺病毒载体Ad5-CTGF,为探讨CTGF的作用机制、功能及与相关疾病的发生、发展上的进一步研究打下基础.     

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的 为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1) cDNA重组腺病毒载体.方法 以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIM P1的正确性.通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度.结果 经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010 IU/mL.结论 成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础.     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

腺病毒介导酪氨酸羟化酶基因体外治疗大鼠泌乳素瘤

目的 探讨腺病毒介导酪氨酸羟化酶(TH)基因治疗大鼠垂体泌乳素(PRL)瘤的可能性。方法 应用细攻内同源重组法构建携带大鼠TH基因并含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad—GFP—TH和末携带任何外源基因的复制缺陷型空载体腺病毒Ad—GFP,并以大鼠泌乳素瘤细胞株MMQ为靶细胞,探讨腺病毒介导TH基因治疗对MMQ细胞生长和PRL分泌的影响。结果 成功构建重组腺病毒Ad—GFP—TH及Ad—GFP;转染重组腺病毒Ad—GFP—TH后,MMQ细胞的生长和PRL分泌均受到明显的抑制。结论 基因治疗可能成为垂体泌乳素瘤,尤其是侵袭性垂体泌乳素瘤的有效治疗方法之一。     

人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况.方法 用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25 × 1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体.     

人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的: 构建超极化激活环核苷酸门控通道基因(HCN4)重组腺病毒载体. 方法: 采用基因工程技术,将HCN4 cDNA定向克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中,利用pAdeasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果: 测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体,病毒滴度达2.0×1015pfu/L. 结论: 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.     

人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法:双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8-CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrack-CTLA4Ig与AdEasy-1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAd-CTLA4Ig,PacⅠ酶切产生30 kb和4.5 kb 2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109).结论:成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.     

MafA基因重组腺病毒的构建及其对小鼠肝癌细胞的影响

目的利用AdEasy-1系统构建胰岛素转录因子之一的MafA基因重组腺病毒（Ad-MafA）,并观察其对小鼠肝癌细胞的影响。方法将质粒cDNA3/MafA扩增、酶切获得MafADNA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒（CMV）启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-MafA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-MafA,经293细胞包装后得到含MafA全长DNA片段的重组腺病毒AdMafA;将Ad-MafA体外感染小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）,以RT-PCR和Westernblot检测MafA在hepa1-6细胞的表达。结果连接、重组后通过酶切法筛选出pAd-MafA,经293细胞包装,5d后观察到绿色荧光蛋白（GFP）明显表达,通过反复感染HEK细胞扩增得到高滴度的重组腺病毒,Ad-MafA体外感染肝癌细胞1d后,MafA基因表达和蛋白表达明显增加。结论利用新型腺病毒载体AdEasy-1系统可在短期内制备同时表达GFP和MafA的重组腺病毒（Ad-MafA）,Ad-MafA体外感染小鼠肝癌细胞可显著提高MafA的表达,这将为基因治疗糖尿病提供新的手段。     

小鼠B7-H4重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasyTM XL system构建携带小鼠B 7-H4基因的重组腺病毒,并鉴定其生物学活性.方法:以RT-PCR方法从C5 7小鼠肺组织中扩增B7-H4全长基因并克隆到T载体,然后测序鉴定.经Xhol Ⅰ和EcoR Ⅴ双 酶切后接入pshuttle-CMV穿梭载体(简称PSC),构建重组腺病毒的穿梭质粒PSC-mB7-H4 ,并电转化至BJ5183-AD-1感受态细菌,经筛选获得携带mB7-H4的重组腺病毒的质粒pmB7 -H4/Ad.将此质粒转化人胚肾细胞(AD-293)产生复制缺陷的重组腺病毒mB7-H4/Ad .以RT-PCR及Western blot方法检测被mB7-H4/Ad感染的AD-293细胞中B7-H4 mRNA和蛋 白的表达,并观察重组腺病毒感染的小鼠成纤维细胞(L929)对T细胞增殖和细胞因子表达的影响. 结果:获得序列准确的mB7-H4基因并成功构建重组腺病毒表达质 粒,转化AD-293细胞获得重组腺病毒;细胞生物学实验证实,该重组腺病毒具有抑制CD3单抗诱导的T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌. 结论:成功构建具有免疫抑制功能的mB7-H4重组腺病毒.     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

SLC基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid organ chemokine, SLC)基因的重组腺病毒.方法 采用PCR技术从含有SLC基因的质粒上扩增出SLC基因,将PCR产物酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将SLC基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带SLC基因的重组腺病毒.结果 成功将SLC基因片段克隆至pAd/CMV/V5- DEST载体上,并经293细胞包装出病毒颗粒;经测定病毒滴度为2.6×108 pfu/mL.结论 构建的重组SLC腺病毒可将SLC基因导入肿瘤细胞或组织内,为进一步研究SLC基因的抗肿瘤作用提供了基础.     

PGEM-T/TIMP-1重组质粒的构建及其在体外转录法合成dsRNA中的作用

日的构建大鼠PGEM-T／TIMP-1重组质粒，获得TIMP-1基因的dsRNA。方法RT-PCR获得TIMP-1cDNA，克隆于PGEM—T载体上，PCR鉴定并进行序列分析；以PGEM—T／TIMP-1重组质粒为模板，PCR获得带有T7启动子的TIMP-1cDNA；体外转录获得TIMP-1dsRNA。结果RT-PCR及测序分析证明成功构建PGEM—T／TIMP-1重组质粒；并获得带有T7启动子的TIMP-1cDNA以及TIMP-1dsRNA。结论成功构建PGEM—T／TIMP-1重组质粒，并获得TIMP-1dsRNA，为RNAi实验奠定了基础。     

重组腺病毒载体pAd-NY-ESO-1-EGFP的构建及鉴定

目的:利用细菌内同源重组法构建含人肿瘤特异性抗原的腺病毒质粒。方法:设计NY-ESO-1 cDNA扩增引物,从pET15b-NY-ESO-1质粒中扩增NY-ESO-1的DNA序列,与pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,PCR和EcoRⅤ酶切鉴定重组质粒pShuttle-NY-ESO-1-EGFP,经Pm eⅠ酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-NY-ESO-1-EGFP;质粒经PacⅠ酶切鉴定,DNA测序。结果:线性化的pShuttle-NY-ESO-1-EGFP转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了340 bp的片段。结论:用细菌内同源重组法成功地构建了含NY-ESO-1的重组腺病毒质粒,为进行表达NY-ESO-1的重组腺病毒的制备及肿瘤特异性抗原NY-ESO-1的核酸疫苗在肿瘤方面的研究奠定了基础。     

p27kip1复制缺陷腺病毒重组体的构建与鉴定

目的 :构建含人细胞周期依赖激酶抑制剂p2 7kip1基因的重组腺病毒载体 ,为采用p2 7kip1cDNA防治肿瘤的研究奠定基础。方法 :将人p2 7kip1cDNA插入到穿梭质粒pACCMVPLPA的CMV启动子之下 ,即pAd p2 7kip1。后者与pJM17通过脂质体共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得含人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒Ad p2 7kip1。结果 :p2 7kip1cDNA成功地插入了pACCMVPLPA载体 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了 2 75bp的p2 7kip1基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad p2 7kip1的正确性。病毒滴度为 1.2 4× 10 1 2 pfu ml。结论 :成功构建了携带人p2 7kip1基因的腺病毒Ad p2 7kip1,为采用p2 7kip1cDNA途径防治消化道肿瘤的在体、离体实验奠定了基础     

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的：制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法：酶切pMD18T-NP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至芽梭载体构建重组pAcTrack-CMV-NP9载体，线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183，通过同源重组得到重组的pAD-NP9病毒载体将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果：酶切鉴定得到阳性pAD-NP9重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(CFP)表达并逐渐增多、增强：结论：成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒，为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。