新城疫病毒对Hep-2肿瘤细胞的抑制效应

目的探讨新城疫病毒(newcastlediseasevirus,NDV)对Hep-2肿瘤细胞的杀伤效应及其免疫刺激作用。方法采用考马斯亮兰染色法观察NDV感染对Hep-2肿瘤细胞细胞骨架的影响。运用甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)染色法检测NDV感染致Hep-2肿瘤细胞死亡的杀伤率。通过免疫荧光结合流式细胞仪(flowcytometer,FCM)检测Hep-2肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(majorhistocompabilitycomplexclassImolecules,MHC-I)的表达情况。另外,分离人外周血淋巴细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)作为效应细胞,以NDV感染的Hep-2肿瘤细胞作为靶细胞,同时设空白细胞对照,通过特异性细胞毒T淋巴细胞实验,探讨NDV所介导的抑瘤作用。结果NDV可致Hep-2肿瘤细胞的细胞骨架发生改变,对体外培养Hep-2肿瘤细胞的杀伤率达77.7%,可上调其表面MHC-I类分子的表达,并且能够刺激增强人外周血淋巴细胞中肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)活性,杀伤率为23.54%。结论NDV可有效杀伤Hep-2肿瘤细胞,并刺激产生特异性抗肿瘤免疫反应。     

pVVP3IL-18HN核酸疫苗的构建及其对喉癌细胞杀伤作用的研究

目的通过构建共表达凋亡素基因、新城疫病毒HN基因和白介素18（interleukin-18，IL-18）基因的核酸疫苗，观察联合应用此三种基因对喉癌细胞的杀伤效应。方法在真核表达质粒pVAX1中的CMV启动子下游插入凋亡素基因和含有IL-18HN嵌合基因并携带IRES启动子的基因片段，构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pVVP3IL-18HN，经RT—PCR、间接免疫荧光和Western—blot法检测外源基因的表达。采用脂质体介导法将构建的重组质粒pVVP3IL-18HN体外转染Hep-2细胞，运用MTT法检测不同质粒浓度、不同作用时间，该重组质粒对喉癌细胞Hep-2的杀伤率。结果pVVP3IL-18HN可有效杀伤喉癌细胞，且在作用72h、质粒浓度为20μg／ml时杀伤率最高，达61．9％。结论重组质粒pVVP3IL-18HN能有效杀伤Hep-2细胞，可用于喉癌的治疗和研究。     

新城疫病毒抗人喉癌的实验研究

目的探索喉癌生物治疗新方法。方法用新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）在体外培养人喉癌细胞进行抗人喉癌细胞实验。建立人喉癌裸鼠模型,瘤内注射NDV,在裸鼠体内进行抗人喉癌实验,对实验后的裸鼠多种组织进行病理学检查、病毒分离实验、血清酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）实验。结果 NDV可在Hep-2细胞内复制、增殖,并引起细胞死亡,NDV可明显降低Hep-2细胞的独立生存与增殖能力。动物实验,在实验组与对照组之间经校正t检验,裸鼠质量t′=2.397（P<0.05）,肿瘤质量t′=2.852（P<0.05）,瘤体积t′=6.058（P<0.01）,裸鼠质量、肿瘤质量、瘤体积的差异都有显著性,抑瘤率达84.856％;病毒分离实验只有肿瘤组织中分离到病毒;ELISA实验组呈阳性;光镜和电镜下可见肿瘤细胞的坏死与凋亡及炎性细胞浸润。结论新城疫病毒能够杀伤体外培养人喉癌细胞,能够抑制裸鼠体内肿瘤的生长和转移,且不侵犯正常组织。     

联合应用VP3和IL-18及HN基因对喉癌细胞抑制效应的研究

目的:探讨核酸疫苗pVVP3IL-18HN对Hep-2肿瘤细胞的杀伤机制和对荷瘤动物模型肿瘤的抑制效应。方法:采用脂质体介导法将核酸疫苗pVVP3IL-18HN体外转染Hep-2细胞,运用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色从细胞形态学角度观察肿瘤细胞的死亡方式,并进一步运用流式细胞仪(FCM)检测肿瘤细胞线粒体跨膜电位、活性氧水平和主要组织相容性复合体I类分子(MHC-I)表达情况。在C57BL/6小鼠右后肢皮下接种H22肿瘤细胞2×105个,荷瘤第7、14和21天,瘤内注射pVVP3IL-18HN,同时设pVVP3、pVIL-18、PVHN和空白对照组,计算抑瘤率,并检测细胞毒T淋巴细胞活性。结果:pVVP3IL-18HN转染可使Hep-2肿瘤细胞皱缩被AO/EB浓染,并上调肿瘤细胞活性氧水平和MHC-I分子表达,下调线粒体跨膜电位;对荷瘤小鼠模型肿瘤的抑瘤率为60.5%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:pVVP3IL-18HN主要通过诱导细胞凋亡杀伤喉癌细胞,并对实体肿瘤有显著的抑制作用。     

慢病毒介导的基质金属蛋白酶2基因沉默抑制喉癌侵袭生长的实验研究

目的 探讨siRNA(小干扰RNA)重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)基因沉默对喉鳞癌侵袭生长的抑制作用.方法 采用RNA干扰技术,将MMP-2基因siRNA的重组慢病毒(MMP-2-RNAi-Lentivirus)转染喉鳞癌Hep-2细胞,并运用蛋白印记法检测Hep-2细胞MMP-2基因的蛋白表达;通过博伊登(Boyden)侵袭小室观察MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后喉癌细胞侵袭能力的变化.构建喉癌移植瘤裸鼠模型,瘤内注射MMP-2-RNAi-Lentivirns,观察抑瘤效果;透射电镜观察肿瘤形态;运用免疫组化方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达,以评估细胞增殖的情况.结果 MMP-2-RNAi-Lentivirus能高效地转染靶细胞,转染效率在90%以上.蛋白印迹法检测显示,转染后的Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达阴性.侵袭实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后的实验组Hep-2细胞中穿过人工基底膜的平均细胞数(x±s,以下同)为(12±4)个,明显少于空载体对照组的(35±6)个(t=14.492,P<0.01).体内实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus瘤内注射后,裸鼠移植瘤平均重量和平均体积均明显小于对照组,抑瘤率为44.2%.透射电镜观察到MMP-2-RNAi-Lentivims治疗组肿瘤细胞侵袭表型降低,治疗组肿瘤增殖细胞核抗原指数(49.588±6.995)也明显小于对照组(71.434±7.043,t=9.573,P<0.01).结论 siRNA重组慢病毒介导的MMP-2基因沉默能有效地抑制喉癌的侵袭、生长及增殖,为喉癌的基因治疗提供一定的实验依据.     

p27、p53和Bcl－2蛋白在喉癌和切缘组织中的表达

目的研究p27、p53和Bcl-2在喉鳞状细胞癌和切缘中的表达及其临床意义。方法用Evision免疫组化两步法检测39例喉鳞状细胞癌和相对应的14例喉癌切缘组织中p27、p53和Bcl-2蛋白的表达情况。结果①39例喉癌组织中p27、p53和Bcl-2的阳性表达率分别为48.7%(19/39)、51.3%(20/39)和7.7%(3/39),且p27、p53和Bcl-2与喉鳞状细胞癌患者的年龄、病理分级、临床分期和预后无明显的相关性;②14例喉癌切缘组织中p27、p53和Bcl-2的阳性表达率分别为57.1%(8/14)、14.3%(2/14)和28.6%(4/14),且切缘中p27、p53和Bcl-2蛋白的表达与喉鳞状细胞癌患者的年龄、病理分级、临床分期无明显的相关性。切缘中p27蛋白的表达与预后相关,而切缘中p53和Bcl-2蛋白的表达与预后无关;③p53蛋白在14例喉癌和喉癌切缘组织中的表达有统计学意义(P=0.001)。Bcl-2蛋白在14例喉癌和切缘组织中的表达有统计学意义(P=0.031);④在喉鳞状细胞癌中p27、p53蛋白的表达无相关性。结论①p27、p53和Bcl-2与喉癌患者的年龄、淋巴结转移、分期等无明显的相关性;②p27在切缘中的表达与预后有一定相关性;③p53、Bcl-2蛋白在喉鳞状细胞癌组织和喉癌切缘中的表达有统计学意义;④在部分喉癌切缘中见p53蛋白表达可能与喉癌术后复发有一定的相关性。Bcl-2可能在分子水平提示正常细胞向喉癌细胞的恶性转化。     

TFPI-2重组腺病毒抑制喉鳞状细胞癌侵袭的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因转染对喉鳞状细胞癌细胞侵袭的影响.方法:将TFPI-2基因(Ad-TFPI-2)体外转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,运用Western-blot检测Hep-2细胞TFPI-2蛋白表达,运用Boyden小室实验检测Hep-2细胞的侵袭能力的变化,将感染Ad-TFPI-2的Hep-2细胞接种于裸鼠皮下观察其成瘤能力.结果:经酶切、测序等方法的鉴定证实了Ad-TFPI-2的正确性,病毒滴度为2.8×1013PFU/L,Western-blot结果显示TFPI-2蛋白在实验组Hep-2细胞表达增高,Boyden小室实验显示实验组Hep-2细胞的侵袭能力降低,裸鼠成瘤实验显示实验组Hep-2细胞成瘤能力下降.结论:TFPI-2重组腺病毒能够有效地抑制人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的侵袭能力.     

小干扰RNA对喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤增殖细胞核抗原及p53蛋白表达的影响

目的：应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制裸鼠喉癌皮下移植瘤人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨移植瘤中增殖细胞核抗原（PCNA）及p53蛋白表达的变化。方法：根据hTERT cDNA序列构建表达短发夹RNA（shRNA）的、靶向hTERT mRNA的真核表达质粒pshRNA,其载体质粒含荧光素报告基因。建立人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型,将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况。以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的表达;以免疫组织化学SP法检测PCNA及p53蛋白在肿瘤内的表达。结果：所有裸鼠均接种成功,5d后可见皮下肿瘤形成,14d左右肿瘤直径达5～7mm。pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达。病理学检查发现：pshRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂少见,可见大量癌细胞坏死。与注射生理盐水的对照组比较,转染质粒完毕后7d抑瘤率为76．50％,P〈0．01。pshRNA治疗后瘤体内PCNA蛋白表达显著下调（P〈0．05）,p53蛋白表达显著上调（P〈0．05）。结论：靶向hTERT mRNA的shRNA可显著抑制人喉癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能是诱导PCNA下调,促进p53蛋白表达所致。     

Inhibitory effects of cucurbitacin B on laryngeal squamous cell carcinoma

Cucurbitacins are compounds isolated from various plant families, which have been used as folk medicines for centuries in countries such as India and China because of their wide spectrum of pharmacological activities such as cytotoxic, anti-inflammatory, and anticancer effects. Accumulated evidences have shown that cucurbitacin B inhibits the growth of numerous human cancer cell lines and tumor xenografts. To determine whether cucurbitacin B can inhibit the growth of laryngeal squamous cell carcinoma, in the present study we investigated the antitumor effect of cucurbitacin B on Hep-2 cells. Hep-2 cells were treated with different concentrations of cucurbitacin B for different time. Cell proliferation, cell cycle distribution, and cell apoptosis were evaluated using MTT assay, flow cytometry, and fluorescent microscopy. It was found that cucurbitacin B exhibited significant efficacy in growth inhibition, cell cycle arrest at G(2)/M phase, and apoptosis induction in a dose- and time-dependent manner. Measuring the modulation of regulators in the cell cycle, apoptosis and signal transductions by Western blot analysis showed that the effect of cucurbitacin B was due to suppression of the expression of p-STAT3, Bcl-2, and cyclin B1. Moreover, in vivo studies were performed in a mouse xenograft model, where cucurbitacin B inhibited tumor growth in a dose-dependent manner. In conclusion, the antitumor effect of cucurbitacin B on Hep-2 cells was due to the induction of cell cycle arrest as well as apoptosis. The possible mechanisms underlying the action might be attributed to the suppression of STAT3 phosphorylation. This investigation suggests a potential clinical application of cucurbitacin B for the treatment of laryngeal cancer patients.     

华蟾素对喉癌细胞凋亡的基础研究

目的 探讨中药华蟾素对体外培养人喉癌Ｈｅｐ－２细胞生长作用及癌基因变化。方法 应用光镜,电镜：ＭＴＴ检测技术;ＳＰ免疫组化技术及流式细胞分析仪,对药物作用后Ｈｅｐ－２细胞的数量,形态,抑癌基因Ｐ５３,癌基因ｃｍｙｃ,Ｂｃｌ－２蛋白的表达以及细胞周期ＤＮＡ含量的改变进行研究。结果 发现华蟾素对Ｈｅｐ－２细胞作用在低浓度短时间时促进细胞分裂、增殖和诱导细胞分化;高浓度长时间则抑制细胞生长,促进细胞凋亡     

Caveolin-1对喉鳞状细胞癌抑制作用的体内外研究

目的探讨caveolin-1对喉鳞状细胞癌（简称鳞癌）细胞生长的影响。方法通过脂质体法转染喉鳞癌细胞株Hep-2细胞，筛选出稳定高表达caveolin-1的克隆，并用实时定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定；用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的体外增殖能力；免疫印迹法检测细胞中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷酸化EGFR、细胞外信号调节激酶1、2（extracellular signal-regulated kinase，Erk1、2）、磷酸化Erk1、2，caveolin-1蛋白的表达；免疫共沉淀法检测caveolin-1和EGFR的结合情况；转染后的细胞接种至裸鼠皮下，观察肿瘤的生长情况，裸鼠移植瘤中caveolin-1、磷酸化EGFR、磷酸化Erk1、2的蛋白表达用免疫组织化学法检测。结果成功筛选到稳定高表达caveolin-1的克隆；与对照组相比，转染后的细胞体外增殖能力明显减弱；细胞接种到裸鼠皮下，未转染组和转染空载组中裸鼠均形成肿瘤（100％，4／4），稳定转染caveolin-1的Hep-2-CAV1-2组中裸鼠未形成实体肿瘤（0％，0／4），Hep-2-CAVl-3组中4只裸鼠中只有3只形成肿瘤（75％，3／4），但肿瘤生长缓慢，最终生成肿瘤的重量与未转染组相比明显减小（t=3．05，P〈0．05）；免疫共沉淀显示caveolin-1与EGFR在Hep-2细胞中是结合的；免疫印迹法和免疫组织化学法发现转染caveolin-1后细胞中EGFR和Erk1、2的磷酸化水平降低。结论caveolin-1能够抑制喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2的生长，抑制EGFR-MAPK信号通路可能与其抑癌作用相关。     

Effect of nimesulide on the growth of human laryngeal squamous cell carcinoma

Purpose

To investigate the effect of nimesulide on the growth of human laryngeal squamous cell carcinoma.

Materials and methods

The effect of NIM on Hep-2 cell proliferation was measured by the MTT assay. Flow cytometry was used to evaluate the cell cycle and apoptosis in Hep-2 cells. A Western blot analysis was used to detect changes in the protein expression levels of COX-2, Survivin and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in Hep-2 cells. A Hep-2 tumor xenograft model was established in nude mice to observe tumor growth. The changes in the xenograft tumors were observed after hematoxylin/eosin staining. The expression levels of COX-2, Survivin and PCNA proteins and mRNA were measured by immunohistochemical analysis and RT-PCR, respectively.

Results

NIM had time- and dose-dependent inhibitory effect on the proliferation of Hep-2 cells. NIM could prevent the progression of the cell cycle. After NIM treatment, COX-2, Survivin and PCNA protein levels were reduced in the Hep-2 cells. The volume and weight of the xenograft tumors in the NIM treatment group were significantly reduced. The NIM treatment group also exhibited significantly reduced expression levels of COX-2, Survivin and PCNA at both the protein and mRNA levels.

Conclusions

Our results suggested that NIM has significant inhibitory effects on the growth of Hep-2 cells and xenograft tumors in nude mice. Selective COX-2 inhibitors could potentially become part of a comprehensive treatment for laryngeal squamous cell carcinoma. Additional research and development will provide new and broader prospects for the prevention and treatment of laryngeal squamous cell carcinoma.     

沉默survivin抑制喉癌细胞Hep-2生长的实验研究

目的 探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法 将重组质粒(psi-survivin)和阴性对照质粒(psi-scramble)用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)从mRNA和蛋白水平检测survivin的表达.四甲基偶氮唑蓝(MTT)观察喉癌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,将psi-survivin和psi-scramble注射于肿瘤周围,观察其抗肿瘤的效果.免疫组化法和Western blot法检测重组质粒对肿瘤Survivin蛋白表达的影响.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术(Tunel)观察肿瘤细胞的凋亡.结果 psi-survivin不仅在mRNA水平(抑制率为54.4%),而且蛋白水平也抑制Survivin表达,抑制率为37.0%.MTT证实psi-survivin明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率达71.7%.流式细胞仪结果显示psi-survivin组细胞凋亡明显增加,凋亡率达(13.05±0.56)%((-x)±s,下同).体内实验表明,质粒注射后第32天,盐水组瘤体积为(1443.9±230.5)mm3,psi-scramble组为(1348.5±198.4)Rim3,而psi-survivin组为(624.6±188.4)mm3,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-5.917,P＜0.01).psi-survivin能明显抑制肿瘤survivin的表达,抑制率为41.8%,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-80.343,P＜0.01).Tunel染色结果显示psi-survivin组肿瘤组织中出现较多凋亡细胞,而对照组未见凋亡细胞.结论 沉默survivin能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长.     

缺氧诱导因子1α反义寡核苷酸对喉鳞状细胞癌的放疗增效作用

目的探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）反义寡核苷酸结合放射对人喉鳞状细胞癌（简称喉癌）裸鼠移植瘤生长抑制敏感性的影响。方法对25只裸鼠建立喉癌裸鼠模型,分为5组：A组（正义放疗）、B组（反义放疗）、C组（空脂质体放疗）、D组（放疗）和E组（空白对照）,治疗期间每3 d测量1次鼠重、瘤体最大长径及最大垂直径,治疗21 d后将实验鼠脱颈处死,瘤体称重后应用流式细胞仪、免疫组化观察抑瘤、凋亡情况及相关蛋白表达。结果反义放疗组瘤重（1.037±0.106）g明显低于其余4组（P〈0.05）,抑瘤率（50.21±8.10）%和凋亡率（34.52±4.159）%明显高于其余4组（P〈0.05）。免疫组化PV法染色显示：HIF-1α正义放疗组胞浆有大量棕色颗粒沉积着色,而反义放疗组表达较少;正义放疗组p53表达于胞核呈棕色颗粒浓染,而反义放疗组表达较少;VEGF正义对照组胞浆有大量棕色颗粒沉积着色,而反义放疗组表达较少。流式细胞仪检测结果显示：反义放疗组的HIF-1α、p53、VEGF蛋白表达的荧光指数（fluorescen-ceindex,FI）分别为0.98±0.28、2.13±0.03、1.09±0.36明显低于其余4组（P〈0.05）。结论 HIF-1α反义寡核苷酸结合放疗可以抑制喉癌异体移植瘤的生长,增加肿瘤细胞凋亡率,其机制之一可能是HIF-1α的下调降低了喉癌组织中p53、VEGF的蛋白表达,因此HIF-1α反义寡核苷酸增加喉癌对放疗的敏感性。     

葫芦素B对喉癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:体内外观察葫芦素B对人喉癌细胞系Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用并探讨其作用机制,为临床应用提供实验依据.方法:用0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24、48和72 h, MTT法检测细胞增殖.用0.1、1.0和10.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24 h或10 μmol/L葫芦素B作用8、12和24 h,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞凋亡.Western blot检测p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.建立喉癌裸鼠移植瘤模型,观察葫芦素B的体内抑瘤作用.结果:MTT结果显示葫芦素B对Hep-2 细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测发现随着葫芦素B浓度增高或作用时间延长,处于G2/M期细胞的比例逐渐升高,同时伴有G0/G1期细胞减少,细胞凋亡率逐渐升高,经统计学分析,各实验组之间及其与对照组之间的均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);荧光显微镜观察可见典型细胞凋亡;Western blot检测显示葫芦素B可剂量依赖性抑制p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.体内实验发现低、中、高剂量组的抑瘤率分别是32.43%、43.24%和70.27%.结论:葫芦素B通过抑制STAT3活化,抑制cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达,引起喉癌细胞G2/M期阻滞、增殖抑制和凋亡,发挥对喉癌的抗癌效应.