抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

A型肉毒毒素轻链多步纯化及其金属蛋白酶活性研究

目的：利用基因工程方法原核表达N－His标签的A型肉毒毒素轻链（ BoNT－ALC）蛋白,多步纯化获得高纯度蛋白,并对其金属蛋白酶活性进行鉴定。方法以A型肉毒毒素为模板,构建重组表达载体pET22b－ALC,转化BL21（DE3）,诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化、阴离子交换以及分子筛纯化获取高纯度目的蛋白;通过体外切割特异性底物SNAP－25实验进行酶活性研究。结果与结论获得高纯度的BoNT－ALC蛋白,对金属蛋白酶活性进行了验证。该纯化方法获得的蛋白纯度高、均一性好,且具有很好的酶活性,为后续研究奠定了基础。     

抗人TNF-α单链抗体rScFvH22原核表达及纯化

目的：应用PET32-c原核表达载体快速、高效地表达及纯化单链抗体。方法：将单链抗体H22基因克隆到PET32-c原核表达载体中，通过酶切及测序鉴定正确后，进行原核诱导表达和纯化。并检测纯化后单链抗体的功能。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳表明，单链抗体基因克隆成功；SDS-PAGE结果表明，单链抗体得到成功表达和纯化；ELISA和Western印迹结果表明，单链抗体H22能够特异性结合人TNF-α。结论：成功地表达及纯化抗人TNF-α单链抗体rSeFvH22。     

A型肉毒毒素保护性抗原在酵母细胞中的表达与抗原性分析

目的：在酵母系统中实现A型肉毒毒素(BoNTa)Hc基因的可溶性分泌表达。方法：将Hc基因克隆入表达载体pPIC9K，用SacⅠ将重组质粒线性化，电转化巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞，筛选G418抗性阳性整合子，进行Mut^ 表型株甲醇快速利用诱导。结果：经过体外高拷贝整合子的筛选和诱导表达条件的优化，毒素Hc在pH6．5培养基BMMY中实现稳定的分泌表达，最终筛选到蛋白表达量占上清蛋白10％的分泌高表达株。免疫印迹和酶联免疫检测结果显示，重组BoNTa Hc可以识别特异抗肉毒马血清并具良好的特异结合活性，可以诱导小鼠产生特异性抗体。结论：酵母系统来源的具有良好免疫原性的重组BoNTa保护性抗原可以作为有效的候选重组疫苗分子。     

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的 从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(BoNT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成BoNT/A LC序列,克隆至pTIG质粒,转化BL21(DE3) plysS感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经“吸附-洗脱-扩增”程序淘选富集抗体并进行特异性筛选.PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性.结果 可溶性表达的BoNT/A LC占全菌蛋白的36.8％,纯化后蛋白纯度达99％.从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合BoNT/A LC蛋白.结论 该研究得到了两株特异性的BoNT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗.     

A型肉毒毒素治疗眼睑痉挛的临床观察

目的观察A型肉毒毒素治疗眼睑痉挛的疗效。方法对40例眼睑痉挛患者进行局部多点注射A型肉毒毒素,评价其疗效。结果40例患者中,32例完全缓解(80%、),6例明显缓解(15%),2例部分缓解(5%),总有效率达100%。药物持续时间为2.5-6个月,无全身不良反应及过敏反应,局部反应轻微,短暂可逆。结论A型肉毒毒素局部注射治疗眼睑痉挛是一种安全、有效、简便、易行的方法。     

重组肉毒毒素B重链结合区片段的表达、纯化及其抗原性分析

目的：克隆、表达并纯化肉毒毒素B重链结合区C端（BoNT/B Hc）保护性抗原片段.方法：采用PCR扩增BoNT/B Hc基因,插入表达载体pET-His,转化E.coli BL21（pLys）细胞获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化.利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT/B Hc的抗原性.结果：表达工程菌BL21/pETHis-BHc于37℃经0.2 mmol/L IPTG诱导6 h后,目的蛋白获得高表达,约占菌体总蛋白的24%.经过Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,rBoNT/B Hc的纯度可达96%以上.Western印迹和间接ELISA均显示其具有良好的抗原性.结论：成功克隆、表达并纯化了BoNT/B Hc片段,并可被抗天然BoNT/B马血清所识别,为建立快速检测方法和制备相应的抗体及亚单位疫苗奠定了基础.     

小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体的表达与纯化

目的：表达并纯化小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体,并初步分析比较两者的体外生物活性。方法;经ＤＮＡ重组的构建重组表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中高表达两种单链抗体,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体后经ＩＭＡＣ纯化表达产物,并用凝血酶切除Ｎ端融合的（Ｈｉｓ）６,纯化的表达产物经复性后ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果：两种单链抗体在大肠杆菌中表达量占全菌蛋白的５０％以上,经变性,纯化后纯度可达９７％     

人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体基因的克隆与表达

目的：克隆和表达人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体。方法：首先依照人源化单链抗体的蛋白序鲁设计并优化人源化单链抗体的核苷酸序列，然后在化学合成１４条人源化单链抗体基因片段的基础上，利用二次ＰＣＲ方法构建完整的人源化单链抗体基因，并把构建的全长人源化单链抗体基因直接克隆到表达载体上，利用表达筛选和测序验证相结合的方法挑选正确的基因，并在大肠杆菌中进行了人源化单链抗体基因的ＩＰＴＧ诱导表达。结果：构建     

A型肉毒毒素治疗面肌痉挛的近远期疗效观察

面肌痉挛又称面部抽搐症,表现为阵发性半侧面部肌肉的不自主抽动,严重影响了病人的社会交往和生活质量。其病因不明,治疗方法众多,但疗效不一。我科自2001年始应用A型肉毒毒素治疗面肌痉挛,经过3年的临床观察及随访取得满意疗效,现报告如下。     

A型肉毒毒素多表位串联体的设计、表达、纯化及鉴定

目的:设计、表达两个A型肉毒毒素多表位串联体.方法:从文献报道的A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A,BoNT/A)的表位及生物信息学方法预测得到的B细胞表位中遴选表位,并加入适当的辅助性元件,设计多表位串联体A、B.对其基因进行优化后,经重叠PCR方法合成串联体A、B的全长基因.分别插入原核表达载体pQE-30,再转化E.coli M15[pREP4]感受态细胞中进行诱导表达,以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白,并进行鉴定.结果与结论:成功设计并构建了两个多表位串联体A、B,并在E.coli中以包涵体形式获得高效表达.Ni-NTA法纯化后分别获得纯度大于92.2%、99%的重组串联体A、B蛋白,并经透析复性法复性.Western印迹和间接ELISA显示纯化、复性后的重组蛋白与抗天然BoNT/A马血清有特异性结合反应.     

E型肉毒神经毒素(BoNT)基因序列分析及其B细胞表位预测

目的：分析不同E型肉毒梭菌的肉毒神经毒素（BoNT）基因序列的同源性，预测E型BoNT的B细胞表位。方法：用LaserGene软件中的MegAlign程序比对GenBank中5株不同E型肉毒梭菌的BoNT基因序列；分别利用BioSun和LaserGene软件分析E型BoNT的表位参数、蛋白质二级结构及氨基酸序列保守性，利用三维结构显示软件Cn3D，分析E型BoNT可能的B细胞表位的空间定位，进而预测E型BoNT的B细胞表位。结果：5个E型BoNT基因核酸序列同源性为97．2％-100％，氨基酸序列同源性为95％-100％；E型BoNT轻链中的62-78，111-127区段，重链中443-465，661-677，693～709，727-743，853-869，1093-1109，1128-1144，1163-1179区段最有可能是其B细胞优势表位。结论：我们利用不同分析软件，结合多参数综合预测出了E型BoNT的多个B细胞表位，为进一步鉴定E型BoNer的B细胞表位及其多表位疫苗的研究奠定了基础。     

人工改造的A型肉毒毒素重链Hc段基因在大肠杆菌中的可溶性表达研究

目的 人工合成A型肉毒毒素Hc段基因,并在大肠杆菌中进行高效表达.方法 人工合成Hc段基因,选择宿主细胞偏爱的同义密码子替换其原有稀有密码子,使AT含量降至57.3%,然后将其克隆入pQE-60表达载体,在大肠杆菌中进行可溶性表达.结果 可溶性表达产物占细菌可溶性蛋白的11.5%左右,表达产物可被A型肉毒毒素马血清抗毒素识别.结论 成功地表达并鉴定了A型肉毒毒素Hc蛋白,为进一步进行A型肉毒毒素的疫苗或抗体研究奠定了基础.     

人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体基因的克隆与表达1 刘士辉,王国力,黄君健 等.鼠抗人纤维蛋白抗体 Fv 片段的三维结构模建.军事医学科学院院刊,1997,21(2):1202 王 翔,俞炜源.多菌落分组 P C R 法从高背景中筛选重组子.军事医学科学院院刊,1996;20(4):2333 Kutem ri

目的：克隆和表达人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体。方法：首先依照人源化单链抗体的蛋白序列设计并优化人源化单链抗体的核苷酸序列,然后在化学合成 １４ 条人源化单链抗体基因片段的基础上,利用二次 Ｐ Ｃ Ｒ 方法构建完整的人源化单链抗体基因,并把构建的全长人源化单链抗体基因直接克隆到表达载体上,利用表达筛选和测序验证相结合的方法挑选正确的基因,并在大肠杆菌中进行了人源化单链抗体基因的 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达。结果：构建并挑选到序列正确的全长人源化单链抗体基因,而且在大肠杆菌中实现了目的基因的高表达。结论：基因的部分化学合成, Ｐ Ｃ Ｒ构建及表达筛选是克隆基因的一种有效方法。     

A型肉毒毒素联合氟尿嘧啶在瘢痕疙瘩手术治疗中的应用

 目的 探讨A型肉毒毒素联合氟尿嘧啶在瘢痕疙瘩手术治疗中的应用。方法 选取西京医院烧伤与皮肤外科2015-07至2017-07行瘢痕疙瘩手术切除的患者68例,随机分为观察组和对照组,每组34例。其中观察组术后注射A型肉毒毒素联合氟尿嘧啶,对照组术后注射曲安奈德,比较两组患者愈合的瘢痕美容评估与评级(scar cosmesis assessment and rating,SCAR)量表评分、温哥华瘢痕评分、瘢痕疙瘩复发率及患者满意度。结果 在SCAR量表评分[(7.46±1.26)分 vs (11.51±2.33)分]、温哥华瘢痕评分[(6.31±4.16)分 vs (9.37±4.82)分]、瘢痕疙瘩复发率(5.88% vs 23.53%)及患者满意度[(9.17±0.82)分 vs (6.62±1.16)分]方面,观察组均优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 瘢痕疙瘩手术后注射A型肉毒毒素联合5-氟尿嘧啶可减轻术后切口瘢痕,提高手术效果,复发率更低,患者更为满意,值得临床推广。     

重组肉毒毒素E(BoNT/E)重链C端的表达、纯化及其抗原性分析

目的：克隆、表达并纯化肉毒毒素E重链C端(BoNT／EHC2)保护性抗原片段，为BoNT／E的抗体制备和检测方法的建立奠定基础。方法：采用PCR扩增BoNT／EHc2基因，插入表达载体pET28a，转化E．coli BL2l(DE3)pLysS获得表达工程菌株，并对诱导表达条件和纯化条件进行优化。利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT／EHc2的抗原性。结果：表达工程菌pEq28a-EHC2／BL21(DE3)pLysS于37℃用0．2mmol／L IPTG诱导6h，表达的目的蛋白可以达到全茵蛋白的37．9％。经过固定化金属螯合亲和层析一步纯化，rBoNT／EHC2的纯度可达95％以上。Western印迹和间接ELISA显示其具有良好的抗原性。结论：首次克隆、表达并纯化了BoNT／EHC2片段，并可被抗天然BoNT／E马血清所识别，为制备相应的抗体及建立快速检测方法做好了准备。