利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的口蹄疫病毒的VP1蛋白是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达VP1基因,为建立O型口蹄疫抗体血清学诊断方法奠定基础.方法将O型口蹄疫病毒VP1基因插入pFastBacHIa载体,构建重组质粒pFast BacHIa-VP1.将该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,VP1基因与Bacmid发生特异性位点转座.经PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到病毒基因组多角体蛋白基因启动子下游,提取阳性质粒转染Sf9昆虫细胞.结果 SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果表明VP1基因成功地在Sf9昆虫细胞中进行了表达,蛋白分子量为26.4kDa.结论 VP1基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为口蹄疫病毒VP1蛋白的抗原性、免疫原性以及免疫抗体水平检测研究奠定了基础.     

小鼠肝炎病毒N蛋白基因在杆状病毒中的表达

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠肝炎病毒N基因. 方法 根据GenBank发表的小鼠肝炎病毒A59株N基因序列（AY700211）,设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出N基因的ORF,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体pFastBHa-N.将重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-N.通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9. 结果 获得了重组杆状病毒rBN,并通过Westernblot和IFA分析表明证实N蛋白在昆虫细胞中获得正确表达,且表达产物具有抗原性. 结论 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小鼠肝炎病毒N蛋白,为进一步进行建立诊断学方法的研究奠定了基础.     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的重组杆状病毒载体.方法 将目的 基因(EGFP和GDNF)克隆人杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达.结果 目的 基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达.结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染SD细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础.     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的重组杆状病毒载体。方法 将目的基因（EGFP和GDNF）克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达。结果 目的基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达。结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染Sf9细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础。     

MPTP慢性帕金森病小鼠纹状体差异蛋白质的研究

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达兔轮状病毒VP7基因.方法 根据GenBank发表的LaRV 308/01 VP7基因序列(AF5028201),设计一对特异性引物,RT-PCR扩增获得VP7基因,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体6pFastBHa-VP7.将重组转移载体转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-VP7,通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9.结果 获得了重组杆状病毒Bacmid-VP7,Westernblot和IFA分析表明VP7蛋白在昆虫细胞中获得正确表达且表达产物具有抗原性.结论 本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达兔轮状病毒VP7蛋白,为进一步建立诊断学方法奠定了实验基础.     

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的形成

目的：在昆虫细胞中同时表达HCV的核心蛋白C和包膜蛋白(E1、E2)以形成病毒样颗粒(VLP)。方法：利用PCR技术得到HCV的核心蛋白和包膜蛋白基因，用基因重组技术分别构建表达HCVC、E1和E2蛋白的重组杆状病毒，用SDS-PAGE电泳分析HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达。电镜观察昆虫细胞内VLP的形成。结果：得到了能表达HCVC蛋白和同时表达E1、E2蛋白的重组杆状病毒reBV／C和reBV／E1、E2。reBV／C和reBV／E1、E2共感染的昆虫细胞同时表达了C、E1和E2蛋白，分子量分别为20kD，35kD和66kD。电镜观察到表达HCV结构蛋白的昆虫细胞质中存在大量的直径为40～60nm的VLP，对照细胞无此结构。结论：在昆虫细胞中表达的HCVC、E1和E2蛋白可自行装配成HCV样颗粒。     

人类偏肺病毒F基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人类偏肺病毒融合蛋白(F)基因的真核表达质粒,并在昆虫细胞sf-9中表达.方法:采用RT-PCR法扩增人类偏肺病毒A亚型CAN97-83 F基因的全长序列,将其插入供体质粒pFastBacHT载体多克隆位点区,经酶切鉴定后转化大肠杆菌DH10bac.供体质粒与受体杆粒(Bacmid)发生位点特异性转座获得重组的杆粒.采用脂质体将重组杆粒转染进昆虫细胞sf-9,包装获得感染性杆状病毒.用此病毒感染sf-9细胞并表达蛋白,经6×His树脂纯化后用免疫印迹法验证表达蛋白.结果:PCR及序列分析证实所获得的重组杆粒包含hMPV全长F基因序列,被重组杆状病毒感染的昆虫细胞sf-9显示典型细胞病变.采用抗6×His单克隆抗体为一抗,免疫印迹法检测到分子量约70ku的较单一的蛋白条带,证实F蛋白表达成功.结论:杆状病毒是一高通量、目标蛋白抗原性保存完好的表达系统.采用这一系统成功表达的hMPV F蛋白,将为我国hMPV血清流行病学和免疫发病机理研究奠定基础.     

日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定

目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多克隆位点下游的6×His·Tag一起扩增出来,插入donor载体pFastBacHTa中,构建重组杆状病毒donor载体pFastBacHTa-Sj16-His,转化大肠杆菌DH10Bac-GFP进行转座,提取重组Bacmid,用Lipofectin法转染昆虫细胞Sf9使其包装成有感染性的重组杆状病毒。结果构建了含日本血吸虫Sj16基因的重组Bacmid-GFP-Sj16-His,转染Sf9细胞后,获得了有感染力的重组杆状病毒。结论成功构建了日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒,为下一步重组Sj16蛋白表达和Sj16基因功能研究打下了基础。     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：建立截短的丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时表达：方法：应用多聚酶链反应（PCR），以HCV-H株全长cDNA序列为模板，扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段，克隆人真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体转染至CHO细胞。结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1-Ct，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3．1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论：成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体，瞬时转染CHO细胞，为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗（BCG）活载体疫苗奠定基础。     

Expression of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus in HepG2 cell line

AlthoughthegenomeofseveralstrainsofhepatitisCvirus(HCV)havebeenclonedandscquenced,theHCVparticleshavenotbeenobservedsofar.Currently,becauseofverylowInfectionefficiency,oneofthemajorimpedimentstothestructuralanalysisofHCVgenomeandgeneticanalysisofviralreplicationisthelackofareliablecellculturesystempermissiveforH(IVreplicanon.Inthisstudy,usingrecomblnantDNAtechnlque,weconstructedarecombinantplasmidbysubcloningcoregenecDNAofChineseH(7VisolateIntoaeukaryoticexpressionvectorPTM3andexpres…     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

庚型肝炎病毒NS3蛋白在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的：利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ ＨＴ杆状病毒系统在Ｓｆ９昆虫细胞中表达庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）ＮＳ３蛋白,并对表达产物的免疫原性进行研究。方法：将ＨＧＶ ＮＳ３基因片段定向克隆至转座载体ｐＥａｓｔＢｓｃ ＨＴａ,转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞,３７℃振荡培养４ｈ使发生转座,用抗生素平皿筛选重组ｂａｃｍｉｄ。脂质体介导转染Ｓｆ９昆虫细胞,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液,将上清液再次感染Ｓｆ９细     

中国人丙型肝炎病毒核心基因cDNA在HepG2细胞中的表达

目的：将中国人丙型肝炎病毒（HCV）核心基因cDNA克隆到真核细胞表达载体pTM3中，并在HepG2细胞中表达HCV核心蛋白．方法：利用DNA重组技术,将HCV／C基因cDNA定向克隆到pTM3中,采用痘苗病毒／噬菌体T7多聚酶短暂表达体系,在Lipofectin介导下将重组质粒转染HepG2细胞。结果：重组质粒转化Top10F＇细菌,随机挑取10个Amp抗性克隆,经EcoRⅠ、PstⅠ酶切鉴定，得到2个pTM3-Q534克隆。HepG2转染细胞以间接免疫荧光法鉴定证实存在HCV核心蛋白的表达．结论：HCV／C基因cDNA在粘粒载体中已获得克隆和初步表达．     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的：为探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因，克隆到pGEM－T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量22000ku左右。结论：HCV核心蛋白在酵母中表达成功。     

HCV结构基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-S的构建、鉴定及表达

目的：构建能表达HCV结构基因（C＋E1＋E2）的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCV结构基因的腺病毒载体做准备,方法：用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCV结构基因上、下游引物,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/BCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV结构基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-S.通过BglⅡ／HindⅢ双酶切、PCV及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定。以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-S在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd.HCV-S插入片段为HCVCE1＋E2区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pAd.HCV-S 可以表达HCV结构基因,为包装表达HCV结构基因的腺病毒载体奠定了基础。     

人睾丸特异表达基因TDRG1 单克隆抗体的制备及鉴定

目的：构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体（mAb）并鉴定其生物学特性。方法：用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体（mAb）。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western 印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。 结果：成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western 印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论：所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。