芳香族氨基酸脱羧酶转基因骨骼肌细胞脑内移植后对纹状体区多巴胺含量的影响

目的探讨帕金森病(PD)大鼠模型脑内移植人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因对PD的治疗作用及其在左旋多巴(L-dopa)治疗过程中的地位,并检测脑内多巴胺含量的变化.方法将pCDNA3-AADC转染的原代培养的骨骼肌细胞,移植于SD大鼠PD模型毁损侧纹状体,并在此基础上予以外源性 L-dopa 10 mg·kg-1·d-1腹腔内注射,分别观察基因治疗前后以及结合给予外源性L-dopa前后各组动物病理性旋转行为的改善,并行高效液相电化学法检测脑内多巴胺(DA)含量.结果 AADC转基因骨骼肌细胞脑内移植后,实验组PD模型大鼠旋转行为较前明显改善,并可持续15周以上,尤以第11周时最为明显,约为64.6%(P<0.05),结合外源性L-dopa治疗后动物模型的旋转行为有更进一步的改善,达到86.5%;脑内DA含量测定证实,PD模型鼠脑内AADC水平较健康鼠明显降低,仅(2 119.0±47.2) ng/mg,约为健康鼠的31.0%;在补充了AADC后,脑内纹状体区DA含量则显著提高,达到(3 907.5±56.3) ng/mg;结合补充外源性L-dopa后,脑内DA的水平得到进一步提高达(5 443.0±78.7) ng/mg.结论脑内植入AADC转基因骨骼肌细胞,增加了脑内AADC基因的表达,可有效改善帕金森病大鼠的旋转行为,并可通过增加对L-dopa的脱羧作用而提高其治疗效果,有助于在低剂量上长期维持L-dopa的疗效,减轻L-dopa治疗中的不良反应.     

阳离子脂质体介导AADC基因重组体脑内直接注射治疗帕金森病的实验研究

目的　探讨芳香族氨基酸脱羧酶 (AADC)基因脑内移植对帕金森病的治疗作用及其在左旋多巴 (L dopa)治疗过程中的地位 ,并探讨阳离子脂质体介导的基因治疗方法的有效性。 方法　实验组与对照组分别以 pCDNA3 AADC重组体和 pCDNA3空载体进行阳离子脂质体包裹后 ,注射于帕金森病SD大鼠纹状体内 ,观察两组大鼠旋转行为的改善 ;并在该基础上对两组大鼠分别采用一定浓度的L dopa进行治疗 ,观察脑内移植AADC基因后对大鼠旋转行为的进一步改善。采用免疫组化方法确定AADC的表达。结果　 (1 )阳离子脂质体包裹的pCDNA3 AADC重组体脑内注射后 ,在 3、7、1 4、2 1、2 8d时大鼠的旋转行为获得了一定的改善 (P <0 0 5) ,分别改善 56 0 % ,62 6 % ,49 4% ,36 3 % ,2 7 4% ,以第 1周时最为明显 ,在第 5周时 ,其旋转行为则与移植前差异无显著意义 (P >0 0 5) ;(2 )使用同等浓度的左旋多巴 (L dopa ,1 0mg·kg- 1 ·d- 1 )治疗后 ,在上述相同的时间点时 ,实验组较对照组明显改善模型大鼠的旋转行为 (P <0 0 5) ,以第 1周时最为明显 ,其旋转行为改善达93 4% ,在第 5周时 ,两组间差异无显著意义 (P >0 0 5) ;(3)免疫组化方法确定AADC在纹状体区的稳定表达。结论　增加脑内AADC基因的表达可有效改善帕金森病大鼠的旋转行     

GFP转基因小鼠神经干细胞移植治疗大鼠帕金森病的实验研究

目的观察GFP(绿色荧光蛋白)转基因小鼠胚胎神经干细胞植入帕金森病大鼠纹状体后的存活、分化情况及治疗作用。方法建立PD模型大鼠及体外培养神经干细胞,然后将GFP转基因小鼠神经干细胞定向植入帕金森病大鼠毁损侧纹状体内,于移植后不同时间诱发旋转行为,并与对照组相比,观察症状的改善,并用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色方法检测移植GFP转基因小鼠神经干细胞的存活及分化状况。结果 GFP转基因小鼠神经干细胞脑内移植后,帕金森病大鼠的旋转行为明显改善。移植后2至4周时可检测到成片或散在的TH免疫阳性细胞。结论 GFP转基因小鼠神经干细胞移植至帕金森病大鼠纹状体后,可分化为多巴胺能神经元并能改善旋转症状。     

TH基因修饰的神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的 探讨TH基因修饰的神经干细胞脑内移植对帕金森病(PD)的治疗作用。方法 构建pN：ATH逆转录病毒载体质粒，用PA317细胞包装，G418筛选阳性克隆，病毒上清感染神经干细胞，将表达TH的神经干细胞植入：PD大鼠纹状体内，测定：PD大鼠旋转行为改善，DA和DOPAC含量变化，以及TH在纹状体的表达。结果 TH基因修饰的神经干细胞移植8周时能显著降低PD大鼠旋转行为，增加纹状体DA和DOPAC含量，TH在纹状体内的表达增加，疗效好于单纯神经干细胞移植组。结论 TH基因修饰的神经干细胞移植对PD大鼠有明显的治疗作用，可望为PD治疗提供新的途径。     

Neurturin基因转染c17.2神经干细胞移植保护帕金森病大鼠模型的实验研究

目的探讨neurturin（NTN）基因转染c17．2神经干细胞脑内移植后对帕金森病大鼠模型的保护作用。方法构建高表达NTN蛋白的NTN-c17．2细胞克隆。实验分成NTN（12只）、空质粒（Mock，9只）和PBS组（9只），分别在各组大鼠的纹状体区移植入NTN-c17．2、Mock-c17．2和PBS，16d后再注入6-羟多巴胺（6-OHDA）。通过免疫组化、原位杂交、旋转行为和神经递质变化观察c17．2神经干细胞的分化，NTN基因的表达和NTN蛋白的保护作用。结果NTN-c17．2细胞移植后，细胞分化但仍持续分泌NTN蛋白。NTN蛋白可逆向运输到黑质，保护酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元免受6-OHDA的损害。动物模型旋转行为动态观测显示NTN的保护作用至少持续了4个月，NTN组要明显好于Mock和PBS组。移植后10个月，NTN和Mock组动物移植侧与健侧纹状体的神经递质如多巴胺浓度比值分别为95％（P〈0．05）和93％（P〈0．05），PBS组为75％。结论用带有NTN基因的神经干细胞移植治疗帕金森病，显示出良好的保护效果。     

基因修饰骨髓源性神经元样干细胞治疗帕金森大鼠的研究

目的 观察大鼠酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)修饰的骨髓基质源性神经元样干细胞(neuronoid stem cells derived from bone marrow stem cells,NdSCs-D-BMSCs)在脑室移植途径下对帕金森病(Parkinson disease,PD)大鼠的治疗作用.方法 将酶切鉴定后的新构建质粒pEGFP-C2-TH经电穿孔法转染培养第8天NdSCs-D-BMSCs,注射到PD大鼠模型右侧脑室,观察大鼠行为学变化,移植细胞在大鼠脑组织内的迁移,以及高效液相方法检测脑内DA含量.结果 质粒pEGFP-C2-TH转染NdSCs-D-BMSCs移植后10周,PD大鼠症状显著改善,DA恢复至正常水平33.0%,移植细胞可以在PD大鼠脑内存活,并出现远处迁移.结论 TH修饰的大鼠NdSCs-D-BMSCs经脑室移植对PD大鼠具有明显的治疗作用,为临床中腰椎穿刺干细胞移植的应用提供实验依据.     

外源性EGFP和TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞帕金森病猴模型脑内移植后的跟踪观察

目的评价外源性酪氨酸羟化酶(TH)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因修饰的骨髓基质细胞源神经干细胞(BMSCs-D-NSCs)在猴帕金森病(PD)模型脑内移植后长期存活情况及其功能评定。方法应用MPTP制成偏侧PD猴模型。将构建的pEGFP-hTH转染培养的自体BMSCs- D-NSCs,而后植入PD猴模型脑内,观察其行为学变化,并进行单光子发射计算机体层摄影术(多巴胺转运蛋白显像)和正电子发射计算机体层摄影术(葡萄精代谢显像)检查。用免疫组化法检测移植细胞的存活情况。结果成功构建pEGFP-hTH和pEGFP-C2转染的BMSCs-D-NSCs中TH和EGFP基因均有效表达;细胞移植后5个月PD猴症状仍有所改善。多巴胺转运蛋白显像见细胞移植组术侧纹状体平均标准摄取值低于对侧及健康猴,而高于PD猴术侧。葡萄糖代谢显像见细胞移植组术侧纹状体平均标准摄取值低于对侧及健康猴,而高于PD猴术侧,而细胞移植组间明显差异。免疫组化发现, 细胞移植术后5个月移植区仍存存大量TH、EGFP阳性细胞。结论 pEGFP-hTH和pEGFP-C2转染的BMSCs-D-NSCs存体外和体内均长期表达外源性TH、EGFP基因,基因工程细胞在PD猴脑内存活并发挥治疗作用。     

帕金森病基因治疗的实验研究

帕金森病(PD)的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元变性,表达的酪氨酸羟化酶(TH)减少或者活性降低。目前外源性多巴是最有效的抗PD药物,但常在数年后失去其有效的治疗作用。用胚胎脑细胞移植虽有效果,但胚胎脑来源困难。因此需要探索新的有效治疗方法。本研究将遗传修饰的成肌细胞植入偏侧PD鼠模型纹状体进行基因治疗。移植转TH基因的成肌细胞(治疗组,n=24)和未经遗传修饰的成肌细胞(对照组,n=10)于偏侧PD鼠损毁侧纹状体。用阿朴吗啡(APO)诱发旋转行为,RT-PCR、TH免疫组化检测TH基因的表达和TH蛋白的合成以及HPLC-ECD检测纹状体多巴胺及代谢产物含量以此评估基因治疗的效果。治疗组移植治疗后APO诱发的旋转行为明显改善(P<0.01),且可持续13个月,而对照组APO诱发的旋转行为无改善(P>0.05),应用RT-PCR、TH免疫组化和HPLC-ECD在治疗组移植部位检测到TH基因的表达、TH蛋白的合成和移植侧纹状体部多巴胺及其代谢产物含量增高。遗传修饰的成肌细胞能够在体内长时间、有效地表达TH,并改善PD鼠的病理行为,是PD基因治疗的合适靶细胞之一。     

转基因星形胶质细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠的研究

目的　评价酪氨酸羟化酶 (TH)基因转染的星形胶质细胞移植入帕金森病 (PD)模型大鼠脑内后对旋转行为改善作用。方法　用pcDNA3 1/TH质粒转染原代培养的星形胶质细胞 ,采用免疫组化及RT PCR方法检测到TH表达后 ,将转基因的星形胶质细胞移植入PD模型大鼠脑纹状体内 ,观察PD大鼠的旋转行为变化情况。结果　移植后共观察 12周 ,转基因细胞移植组PD大鼠 (n =10 )的旋转行为明显改善 (P <0 0 5 ) ,改善情况在 2～ 8周最显著 ,对照组大鼠 (n =10 )的旋转行为无变化。结论　转基因的星形胶质细胞脑内移植后可短期改善PD大鼠的旋转行为 ,星形胶质细胞有可能作为有效的载体细胞。     

基因修饰的神经干细胞脑内移植后TH表达和神经递质的变化

目的：探讨经TH基因修饰的神经干细胞脑内移植后，PD模型动物脑内TH表达和神经递质的变化。方法：构建pN2ATH逆转录病毒载体质粒，用PA317细胞包装，G418筛选阳性克隆，病毒上清感染神经干细胞，将神经干细胞和表达TH的神经干细胞植入PD大鼠纹状体内，观察移植后TH的表达情况以及DA和DOPAC含量变化。结果：TH基因修饰的神经干细胞移植2月内，TH在纹状体内的表达增加，纹状体DA和DOPAC含量增高，好于单纯神经干细胞移植组和对照组，但比正常水平低，结论：TH基因修饰的神经干细胞，脑内移植能增加纹状体内TH的表达以及DA和DOPAC含量，为其脑内移植治疗PD提供了理论基础。     

Neurturin基因的克隆及其在C17.2神经干细胞中表达的研究

目的 探讨Neurturin(NTN)基因转染的C17．2神经干细胞移植后对帕金森病(PD)大鼠模型的保护作用，为其提供基因修饰的神经干细胞。方法 用RT—PCR方法获取Prepro-NTN cDNA，并克隆至pBlueskipt Ⅱ载体中，再将Prepro-NTN基因克隆至pcDNA3．1—hygro真核表达载体中，经量Lipofectamine 2000转染C17．2神经干细胞，挑选稳定表达的克隆，用RT—PCR及Western Blot印迹分析鉴定。结果 pcDNA3．1—hygro-NTN质粒转染C17.2神经干细胞后有5个稳定表达的克隆生长，克隆1有NTN蛋白的高表达。结论 获得了稳定表达NTN蛋白的C17．2神经干细胞克隆，为移植治疗PD打下了坚实的实验基础。     

转基因成肌细胞脑内移植后帕金森病大鼠纹状体多巴胺含量的变化

为评价转鼠酪氨酸羟化酶（TH）基因的成肌细胞脑内移植对偏侧帕金森病（PD）大鼠模型纹状体区多巴胺及代谢产物含量的影响，应用6－羟多巴胺损毁SD大鼠单侧黑质制备偏侧帕金森病臣模型。模型稳定必个月后，移植转TH基因的成肌细胞（n＝24）或未转基国的成肌细胞（n＝10）于偏侧PD鼠损毁侧纹状体。移植治疗后6个月，用高效液相色谱电化学法（HPLC－ECD）检测偏侧PD鼠模型纹状体区多巴胺、3，4－二羟苯乙酸（DOPAC）以及高香草酸（HVA）含量。结果转TH基因成肌细胞植入组PD鼠纹状体区多巴胺及代谢产物含量明显增高（P＜0．01），其中多巴胺含量从治疗前平均39．20Pg／mg提高至治疗后的985．71Pg／mg，相当于正常侧纹状体的49．99％．对照组植入未转基因的成肌细胞后纹状体多巴胺及代谢产物含量无明显变化（P＞0．05）。可见转鼠TH基因的成肌细胞脑内移植能够部分改善偏侧PD鼠模型纹状体区多巴胺的缺乏，成肌细胞是PD基因治疗的合适靶细胞之一。     

含NURR1基因腺病毒对神经干细胞分化的影响

目的含NURR1基因的重组腺病毒对神经干细胞分化的影响。方法免疫组化观察转染腺病毒后C17·2神经干细胞后分化效率。结果含NURR1基因的重组腺病毒可使C17·2神经干细胞分化后近76%细胞表现为神经元显型。结论含NURR1基因的腺病毒能明显的提高神经干细胞的分化效率。     

TH基因修饰细胞脑内移植治疗猴帕金森病的实验研究

目的 评价包囊化酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroylase,TH）基因修饰的基因工程细胞脑内移植治疗帕金森病的疗效。方法 将pcDNA3/hTH质粒转染人神经母细胞瘤细胞系SYTY细胞，筛选出阳性克隆，微包囊化处理后的含有TH基因修饰细胞植入PD猴模型脑内，观察其行为、CSF中DA含量的变化，用免疫组化法检查移植细胞的存活情况。结果 （1）pcDNA3/hTH基因经亚克隆，提取纯化的质粒，经ECORI酶切后产生1.9Kb和5.5Kb的片段。转基因后的SY5Y细胞免疫细胞化学染色显示TH染色强阳性；（2）移植后PD猴症状明显改善，脑脊液中DA含量升高；（3）SABC免疫组化发现移植区存在大量TH阳／性细胞。结论 构建的TH基因工程细胞体外和体内均表达人类TH基因；微包囊化处理后的基因工程细胞在PD猴脑内存活并发挥治疗作用。     

脑源性神经营养因子基因工程细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠的实 …

目的观察脑源性神经营养因子基因工程成肌细胞脑内纹状体移植对帕金森病大鼠的治疗作用。方法 建立逆转录病毒介导的ＢＤＮＦ表达质粒并转染成肌细胞，筛选阳性细胞进行脑内移植。结果 基因工程成肌细胞脑内移植可明显提高帕金森病大鼠黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元的存活率，使纹状体多巴胺含量明显增加，动物的旋转行为改善约５０％，并持续２个月之久。结论脑源性神经营养因子基因工程成肌细胞脑内纹状体移植可明显改善动物的旋转     

酪氨酸羟化酶cDNA移植治疗帕金森病的实验研究

帕金森病(PD)的主要病因是黑质多巴胺能神经元损伤,表达的酪氨酸羟化酶(TH)减少。本文在应用6-羟多巴胺(6-OHDA)制备偏侧PD大鼠模型的前提下,首次将TH cDNA移植到PD大鼠纹状体内,模型动物的旋转行为明显改善,用免疫组化法及PCR法证实了外源性THcDNA可以进入脑细胞内,并表达出有生物活性的TH。     

慢病毒介导的三种神经元谱系相关转录因子脑内转移治疗帕金森病的实验研究

目的探讨慢病毒介导的三种神经元谱系相关转录因子(Ascl1-Brn2-Ngn2,ABN)脑内转移治疗帕金森病(PD)的疗效。方法采用SD大鼠单侧纹状体注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)法建立PD模型并分为高剂量治疗组(n=11)、低剂量治疗组(n=11)和空载病毒PD模型组(空载病毒组,n=8),另设PBS阴性对照组(n=6)。应用立体定向仪将携带ABN基因的慢病毒(LV)注射至PD模型大鼠纹状体,观察行为学变化并用Western blot方法检测黑质内酪氨酸羟化酶(TH)表达;利用高效液相色谱法检测多巴胺(DA)及二羟苯乙酸(DOPAC)含量。结果 PBS阴性对照组大鼠未出现明显旋转行为;所有PD模型大鼠自术后第7～10d左右开始出现偏侧PD症状,动物自发向右侧旋转,肌内注射APO后出现快速向右侧旋转(10～17次/min)。基因治疗前空载病毒组大鼠与两治疗组相比,平均旋转圈数差异无统计学意义(均P0.05);空载病毒组大鼠在空载慢病毒注射前后未见有明显旋转行为改善(P0.05);而两ABN基因治疗组在治疗后3周有显著的旋转行为改善(均P0.05),其中高剂量治疗组在治疗后2周出现平均旋转圈数减少,趋势较低剂量治疗组更加明显。PBS阴性对照组术侧黑质内TH表达最高,空载病毒组大鼠TH蛋白表达明显降低;经ABN基因治疗后的两组大鼠TH蛋白表达明显高于空载病毒组,但仍低于PBS阴性对照组。移植后12周,空载病毒组DA及DOPAC水平均显著低于PBS阴性对照组(均P0.05);而ABN基因高低剂量组中DA及DOPAC含量均明显高于空载病毒组(均P0.05),但仍低于PBS阴性对照组。结论 ABN基因脑内转移可显著改善PD大鼠的旋转行为,其作用机制可能与促进多巴胺能神经元再生、增加纹状体多巴胺表达相关。     

神经干细胞与帕金森病

神经干细胞具有几乎无限的稳定扩增能力以及体外分化为多巴胺能神经元的能力,使之成为神经变性疾病移植治疗的重要细胞来源。神经干细胞可以在宿主脑内增殖、分化、迁移并与宿主神经组织整合。移植后的神经干细胞系在体内特定环境下可以自发地表达多巴胺能神经元的特性。可以通过刺激成年哺乳动物脑内终生存在的神经干细胞,使之在脑内增殖、迁移,并分化为多巴胺能神经元,与周围建立突触联系以治疗帕金森病。神经干细胞治疗帕金森病的前景是巨大的,但距临床应用尚有一定距离,仍需要包括动物实验在内的大量基础研究。     

人羊膜上皮细胞侧脑室移植对帕金森病大鼠模型行为、多巴胺能神经元、神经递质影响的实验研究

目的 观察人羊膜上皮细胞(HAECs)移植入帕金森病(PD)大鼠模型侧脑室后的存活及分化情况,及其对PD大鼠模型旋转行为、纹状体区多巴胺及其代谢产物的影响.方法 采用6-羟多巴立体定向脑内注射制作PD大鼠模型,将制模成功大鼠随机分成3组:人羊膜上皮细胞移植组(HAECs组)、磷酸缓冲组(PBS组)和帕金森组(PD组),1w后腹腔注射阿朴吗啡观察各组大鼠旋转行为的变化,连续观察10w,HAECs组5w后用人特异性抗体Nestin和Vimentin检测人羊膜细胞的存活情况,10w后酪氨酸羟化酶(TH)染色观察各组PD大鼠模型黑质部TH阳性神经元的变化情况及HAECs的分化情况,高效液相色谱--电化学仪测定纹状体多巴胺(DA)、高香草酸(HVA)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)等神经递质的水平.结果 HAECs在PD大鼠侧脑室内移植可以长期存活达10w,并且可以分化为DA能神经元,HAECs组大鼠旋转数较PBS组及PD组明显降低(P<0.01),黑质部TH阳性神经元数量较PD组及PBS组升高(P<0.01),HAECs组大鼠纹状体区DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量较PBS组明显升高(P<0.05).结论 人羊膜上皮细胞移植入PD大鼠侧脑室可以改善PD大鼠的旋转行为,其机制可能与增加纹状体区DA等神经递质有关.