大鼠原代肝细胞分离培养的实验研究

目的:探讨胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞及培养的可行性.方法:取10只SD大鼠,按照改良Seglen原位两步胶原酶灌流法分离培养原代肝细胞.以SD大鼠作为肝细胞供体,采用Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注,下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离肝细胞,经200目筛过滤,滤液以200 r/min离心3～5 min,重复3次,纯化肝细胞.台盼蓝拒染实验检测分离细胞活性.将10只SD大鼠分离得到的肝细胞混合,稀释50倍后接种于包被有鼠尾胶原的培养皿或培养板中,倒置显微镜下观察分离肝细胞的形态特征,糖原染色法(PAS法)鉴定分离肝细胞,MTT法测定肝细胞在培养不同时期的增殖情况.结果:平均每只大鼠肝脏分离获得(1.8±0.14) ×108/mL肝细胞,细胞活率＞85％.肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色.MTT实验结果表明在培养的第八天肝细胞增殖达到峰值,培养的第九天细胞活力开始下降.结论:采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种简单、高效的获得肝细胞的方法.     

原代鸭肝细胞的原位灌流分离法

目的：探索优化的原代鸭肝细胞分离方法，为鸭肝细胞在体外研究中的应用奠定基础。方法：分别采用胶原酶（Ⅰ型与Ⅳ型）经门静脉或胆总管原位灌注分离鸭肝细胞，观测肝细胞产量、存活率及其形态。结果：1．经门静脉原位灌流分离鸭肝细胞效果明显优于经胆总管灌流法；2．右心室为灌流液流出道分离鸭肝细胞效果明显优于经下腔静脉流出道分离法；3．Ⅰ型胶原酶与Ⅳ型胶原酶灌流分离鸭肝细胞效果相当。结论：采用Ⅰ型或Ⅳ型胶原酶经门静脉 －右心室原位灌流分离鸭肝细胞为一较好的方法，有利于鸭肝细胞为模型的体外研究工作的开展。     

小鼠肝脏原位持续灌流方法的建立及其在肝脏非实质细胞分离中的应用

目的建立一种小鼠肝脏原位持续灌流的方法,并将该法应用于肝脏非实质细胞的分离。方法利用三通管和静脉留置针将门静脉、蠕动泵软管以及下腔静脉连接形成封闭回路,自门静脉端注入37℃的胶原酶消化液约60 ml,调节蠕动泵转速为20 ml.min-1行循环灌注约30 min,摘除肝脏剪切成小块组织,加入胶原酶孵育液消化30 min后碾碎制备成细胞悬液,离心后取沉淀先后以50%和35%的Per-coll密度离心即可获得小鼠肝非实质细胞。结果肝脏非实质细胞的得率为0.5×107～1×107个/鼠肝,流式检测CD45+细胞占(27.21±1.47)%。结论胶原酶肝脏原位持续灌流+体外孵育消化结合Percoll密度离心是分离小鼠肝脏非实质细胞的可靠方法。     

胰岛素对大鼠肝细胞损伤的保护作用

目的:探讨胰岛素对大鼠肝细胞损伤是否具有保护作用。方法:胶原酶原位灌流分离大鼠肝细胞并原代培养,分别用脂多糖(LPS)及胰岛素处理肝细胞,12 h后检测肝细胞损伤及存活率。结果:LPS可引起肝细胞损伤,使丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)增高;胰岛素可减轻上述肝细胞损伤(ALT活性降低55.5%、AST活性降低24.4%,P<0.01),提高肝细胞存活率(P<0.01)。结论:胰岛素可减少ALT和AST释放,促进肝细胞存活,减轻LPS直接诱导的肝细胞损伤,保护受损的肝细胞。     

虎杖苷对CCl_4损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用

目的研究虎杖苷（ＰＤ）对ＣＣｌ４损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用。方法原位灌流法分离大鼠肝细胞，培养２４ｈ后加入ＰＤ，同时造成ＣＣｌ４损伤，分别于损伤后６，１２，２４和４８ｈ测培养液中谷丙转氨酶（ＡＬＴ）、丙二醛（ＭＤＡ）和还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）活性，４８ｈ后用ＭＴＴ比色法测肝细胞存活率。结果ＰＤ１×１０－７～１×１０－４ｍｏｌ·Ｌ－１能不同程度地抑制ＡＬＴ和ＭＤＡ的上升，提高ＧＳＨ水平，显著提高细胞存活率，以１×１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１效果最好。结论ＰＤ１×１０－７～１×１０－４ｍｏｌ·Ｌ－１能有效保护ＣＣｌ４造成的原代培养大鼠肝细胞损伤     

大鼠离体原代肝细胞中布洛芬代谢的研究

目的:研究布洛芬在大鼠原代培养肝细胞中的代谢情况。方法:建立大鼠肝细胞的分离及原代培养方法,考察肝细胞对布洛芬的代谢情况;采用2步灌流技术并运用胶原酶消化法,分离肝细胞并分别与2.50、5.00、20.00μg·mL-1浓度布洛芬进行悬浮共培养,在不同时间点取样,应用高效液相色谱法测定布洛芬的浓度并计算其它药动学参数。结果:240min内肝细胞活率>80%,能满足代谢要求;布洛芬低、中、高3种浓度药动学数据Ke为(0.0064±0.0011)、(0.0086±0.009)、(0.0091±0.0015)min-1,t1/2为(110.0562±17.16)、(81.3873±9.2815)、(77.9516±12.1355)min;AUC为(272.9287±35.58)、(448.9899±23.0295)、(2157.6777±318.8730)μg·mL·min-1;CLs为(0.0093±0.0011)、(0.0112±0.0005)、(0.0094±0.0014)mL·min-1。结论:利用原代肝细胞培养技术对布洛芬代谢进行研究,可为临床优化治疗、合理用药等方面提供有价值的实验数据。     

异种肝细胞移植对大鼠药物性肝衰存活率和肝功能的影响

目的　观察异种肝细胞移植对大鼠药物性肝衰的存活率和肝功能的影响。方法　豚鼠为供体 ,海藻酸钠 氯化钡法微囊化。SD大鼠为受体 ,氨基半乳糖腹腔内一次性注射制作肝衰模型。 4 8h后将微囊化豚鼠肝细胞 (1 5× 10 7个 )移植于大鼠脾脏内。豚鼠裸肝细胞 (1 5× 10 7个 )移植及生理盐水 1 2ml脾脏注射为对照。移植后观察受体大鼠 14d存活率和肝功能的改变。结果　微囊化肝细胞移植组存活率 80 % ,明显高于生理盐水组 (2 5 % )和裸肝细胞移植组 (70 % ) (P <0 0 1与P <0 0 5 )。微囊化肝细胞移植组 14d总胆红素 (0 6 8± 0 0 5 μmol/L)和ALT(5 5± 6 7U/L) ,明显低于生理盐水组 (0 82± 0 0 7μmol/L和 91 0± 8 0U/L)和裸肝细胞组 (0 76± 0 0 6 μmol/L和 74 0±7 1U/L) (P <0 0 5和P <0 0 1)。总蛋白 (117 0± 8 4 g/L)和球蛋白 (6 6 0± 5 6 g/L) ,明显高于对照组 (78 0± 6 9g/L和 4 3 0± 6 2 g/L)、(96 0± 7 4 g/L和 5 2 0± 6 9g/L) (P <0 0 5与P <0 0 1)。结论　药物性肝衰大鼠脾内移植微囊化异种肝细胞有显著逆转肝功能和提高生存率的作用。     

玉郎伞多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

目的:研究玉郎伞多糖(YLS)对大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用四氯化碳(CCl4)体外诱导肝细胞损伤,检测培养上清液中天门冬氨酸转换酶(AST)和丙氨酸氨基转换酶(ALT)水平,测定肝细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果:YLS(0.125~1.000g.L-1)可明显降低由CCl4升高的肝细胞培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞MDA含量,还可提高CCl4降低的肝细胞存活率和GSH含量。结论:提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。     

用人和大鼠肝组织分离肝细胞的方法研究

1976年Seglen建立了“二步灌流法”分离大鼠肝细胞，大大地提高了肝细胞的产量和存活率，从而可以更好地利用原代培养的大鼠肝细胞作为体外模型探讨肝毒性作用及其机制。但是由大鼠肝细胞获得的结果外推于人有一定困难，若直接利用原代培养的人肝细胞作为体外模型，则可解决这一难题。已有学者分别     

改良后的大鼠原代肝细胞分离方法应用于格列喹酮肝摄取方式的考察

目的:对分离大鼠原代肝细胞的经典方法进行改良,使之更方便、高效、经济和实用;并将方法改良后分离获得的原代肝细胞进行贴壁培养用于格列喹酮的肝细胞摄取方式的考察。方法:将雄性Wistar大鼠于无菌条件下麻醉后固定,保持体温在37℃,对Seglen两步在体灌注分离原代肝细胞方法进行改进,采用先在体后离体的方法分离大鼠原代肝细胞,离心纯化后进行贴壁培养;将不同浓度格列喹酮溶液与贴壁的原代肝细胞共同孵育40 min, 1% Trion-X 100 裂解后,高效液相色谱-荧光法测定肝细胞裂解液中格列喹酮的浓度,BCA法测定细胞蛋白含量,绘制格列喹酮大鼠原代肝细胞摄取曲线,考察格列喹酮的肝细胞摄取方式。结果:经改良后,所分离的大鼠原代肝细胞数量有所提高,活性>80%,易于贴壁,形态良好,且节省试剂尤其是Ⅳ型胶原酶的用量;在15.625~720 μg·ml^-1范围内时,随着格列喹酮浓度的增大肝细胞对格列喹酮的摄取量呈近似线性的升高,并未呈现明显的饱和现象。结论:经典方法经改良后,分离获得的肝细胞活性高且易于贴壁,同时操作更为方便、高效,节约试剂尤其是昂贵的Ⅳ型胶原酶的用量,是较为经济、实用的方法;格列喹酮在15.625~720 μg·ml^-1范围内时,肝细胞对其摄取以自由扩散为主并非蛋白介导转运。     

豹皮樟总黄酮体外对酒精性脂肪肝大鼠肝细胞脂肪变性的影响

目的探讨豹皮樟总黄酮(TFLC)对酒精性脂肪肝(AFL)大鼠肝细胞脂肪变性的影响。方法大鼠自由饮用含乙醇饮料,起始浓度为5%,依次增加为10%,15%,20%,25%,30%和35%,每个浓度持续1周,第8周～第12周浓度为40%的方法制备大鼠AFL模型,原位二步灌流法分离AFL大鼠肝细胞,用细胞角蛋白18(CK18)抗体进行肝细胞鉴定。肝细胞培养16 h后加入TFLC 1,10和100 mg.L-1或谷胱甘肽(GSH)10 mmo.lL-1孵育48 h。MTT法测定肝细胞存活,用试剂盒方法检测肝细胞丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性以及肝细胞内甘油三酯(TG)含量,免疫组化和逆转录PCR方法测定脂肪分化相关蛋白(ADRP)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA和蛋白表达的变化。结果 TFLC对正常大鼠肝细胞存活无明显影响。TFLC 100 mg.L-1明显增加AFL大鼠肝细胞存活(P<0.05)。AFL大鼠肝细胞培养液ALT和AST活性分别为(63±12)和(74±19)U.L-1,TFLC 10和100 mg.L-1分别将ALT活性降低到(42±12)和(44±8)U.L-1(P<0.05),将AST活性降低到(46±14)和(47±8)U.L-1(P<0.05)。AFL大鼠肝细胞内TG含量为(2.3±0.6)mmol.L-1,TFLC 10和100 mg.L-1分别将AFL肝细胞内TG含量降低到(1.4±0.3)和(1.5±0.5)mmo.lL-1(P<0.05)。AFL肝细胞ADRP和PPARγ阳性表达细胞分别为(41±6)%和(37±10)%,TFLC 100 mg.L-1治疗组ADRP和PPARγ阳性表达细胞分别降低为(26±6)%(P<0.01)和(25±5)%(P<0.05)。结论 TFLC可能通过改善肝细胞活性、减少肝细胞内TG生成、抑制ADRP表达及调控肝细胞PPARγ的表达,从而改善AFL大鼠肝细胞的脂肪变性。     

大鼠肝实质及非实质细胞分离和质量检测

目的　探索分离肝实质细胞及非实质细胞的合理条件。方法　应用胶原酶 /蛋白酶E消化分离和低速离心技术 ,以细胞活率、细胞产量和细胞纯度等指标检测细胞质量。结果　在 37℃ ,0 5g·L-1的胶原酶作用 30min ,80 0r·min-1离心条件下 ,肝实质细胞产量 (98× 10 9± 4× 10 9·L-1)、纯度 (97%± 2 % )和活率 (>90 % )最好。胶原酶和蛋白酶E合用 ,肝非实质细胞产量最高 (2 8 6× 10 9± 3 7× 10 9·L-1) ,Kupffer细胞纯度合理 (16 0 %± 3 5 % ) ,且Kupffer细胞含量符合体内正常分布。结论　本实验方法分离细胞对于进一步研究肝实质 ,尤其肝非实质细胞功能有实际意义。     

高浓度大鼠肝实质细胞与非实质细胞共培养的细胞功能研究

目的:高浓度肝实质细胞与非实质细胞原代共培养,研究其功能活性。方法:应用原位胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞,获得有活性的肝细胞,并应用高浓度实质和非实质肝细胞共培养的方法原代培养（共培养组）,并以微囊肝细胞培养为对照组（微囊组）进行了比较。结果:两组均维持白蛋白分泌、尿素合成功能7天;共培养组的白蛋白分泌与微囊组一样为下降趋势,共培养组从（0.870±0.102）降至（0.492±0.040）g·L-1·10-6cells·24h-1,微囊组从（1.147±0.099）降至（0.375±0.012）g·L-1·10-6cells·24h-1;共培养组的肝细胞第4天后维持在一个较稳定的水平,而微囊组肝细胞前3天明显高于共培养组,而后两天显著低于共培养组（P<0.05）。共培养组的尿素合成功能,由（4.50±0.56）降至（4.37±0.19）μmol·L-1·10-6cells·90min-1,微囊组由（5.42±0.81）降至（3.60±0.33）μmol·L-1·10-6cells·90min-1,前3天微囊组高于共培养组,后2天共培养组明显高于微囊组（P<0.05）。共培养2～7天肝细胞的对氨基苯甲酸（PABA）浓度稳定在 7.2～9.9mg/L·10-6cells·24h-1。结论:高浓度肝实质细胞与非实质细胞共培养,可使肝细胞的特异性功能维持7d,而且较微囊肝细胞更适合应用于中空纤维舱型生物人工肝。     

对乙酰氨基酚对大鼠原代肝细胞及BRL-3A细胞的毒性作用比较

目的 建立大鼠原代肝细胞提取鉴定体系,比较对乙酰氨基酚(APAP)对大鼠原代肝细胞和永生化细胞BRL-3A的毒性作用。方法 采用胶原酶原位两步灌流法提取大鼠原代肝细胞,通过过碘酸雪夫染色(PAS)和肝细胞双核结构进行鉴定;CCK 8法测定APAP对大鼠原代肝细胞及BRL-3A细胞毒性作用的IC₅₀;光学显微镜透射电镜观察APAP对2种细胞的损伤情况;全自动生化分析仪测定细胞上清AST、ALT、LDH、ALP、ALB、BUN、TP、GLU 8项生化指标的变化。结果 PAS糖原染色鉴定获取的大鼠原代肝细胞,双核结构,细胞存活率浮动在80%~95%;最佳接种密度为60000/cm²,在第3~5天为对数生长期;APAP作用于大鼠原代肝细胞24 h的IC₅₀为18.03 mmol/L,95%置信区间为(17.28~18.81)mmol/L,作用于BRL-3A的IC₅₀为20.05 mmol/L,95%置信区间为(18.99~21.17)mmol/L;透射电镜结果显示,在30 mmol/L APAP作用下,2种细胞细胞器肿胀,核膜破裂,细胞膜边界模糊不清;与对照组比较,大鼠原代肝细胞分泌的天冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、葡萄糖(GLU)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)随着APAP浓度增加产生显著变化,而BRL-3A细胞几乎所有的酶学指标变化均差异不显著。结论 与永生化细胞BRL-3A比较,大鼠原代肝细胞更能体现药物的肝脏毒性作用,但其体外培养存活时间较短;BRL-3A细胞缺少肝脏重要酶类,增加细胞内肝脏酶类是提升其作为肝脏毒性筛选模型的更好手段之一。     

南沙参多糖对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞保护作用的研究

目的:探讨南沙参多糖(RAPS)对四氯化碳(CCl4)损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用及其机制。方法:通过原位灌流法分离大鼠肝细胞,培养36h后加入RAPS,同时造成CCl4损伤,分别于损伤24h和48h时检测培养液中丙二醛(MDA)的含量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性,48h后用MTT法测定肝细胞存活率。结果:RAPS对CCl4引起的ALT、AST活力的升高有抑制作用,同时抑制MDA的产生及肝细胞损伤造成的SOD活性及GSH-PX活性的降低。而且能明显改善肝细胞存活率。结论:RAPS能有效抑制CCl4造成的原代培养大鼠肝细胞损伤,机制可能与其抗氧化作用有关。     

大鼠肝细胞分离及体外损伤模型建立

目的:分离大鼠肝细胞,建立体外大鼠肝细胞损伤模型.方法:改进Seglen胶原酶(IV型)原位灌注分离大鼠肝细胞,培养液中加入不同浓度D-氨基半乳糖培养24 h,于培养1、3、6、12、24 h取上清测定ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸转移酶)、LDH(乳酸盐脱氢酶),同步测定肝细胞的细胞增殖活性(MTT)反应.结果:平均肝细胞产量(8.92±0.47)×108,Trypan blue拒染实验细胞活性率96.23%±2.41%,培养体系中加入D-氨基半乳糖后,部分肝细胞胞膜破损,随剂量增加及时间延长而逐渐加重;各剂量组随时间延长,培养上清液中生化指标水平逐渐升高,而MTT反应水平逐渐下降,以3 h与6 h变化最为明显;各时间点生化指标及MTT反应变化随剂量增加呈现相同趋势.结论:该方法可获得高产量高活性大鼠肝细胞;D-氨基半乳糖可成功诱导大鼠肝细胞体外损伤模型.     

川芎嗪对依托泊苷诱导小细胞肺癌细胞凋亡增敏作用的评判

目的:观察低浓度(10μg/ml)的中药钙拮抗剂川芎提取物川芎嗪(tetrame thylpyrazine,TMP)与化疗药物依托泊苷(etoposide,VP-16)合用对人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)细胞的影响。方法:用MTT法观察药物对体外培养的人小细胞肺癌H446细胞存活率的影响;用吖啶橙/溴乙啶双荧光染色法检测凋亡细胞,采用流式细胞术分析药物对H446细胞周期的影响。结果:TMP和VP-16合用与单用VP-16相比细胞存活率明显下降,VP-16的浓度在0.1、1、10、100μg/ml时,细胞存活率分别为(93.85±2.51)%、(91.90±2.10)%、(66.64±3.73)%和(8.21±1.84)%。VP-16与低浓度的TMP联用后,上述浓度细胞存活率分别降为(90.80±1.20)%、(78.96±1.94)%、(51.48±2.52)%和(2.56±1.44)%,其合并指数为0.85,增效倍数为4.32。双荧光染色法证实TMP可增强VP-16的凋亡诱导作用;细胞周期分析表明低浓度TMP对细胞周期无明显影响,VP-16半数抑制浓度使细胞生长停滞在S期,抑制细胞有丝分裂及DNA合成,两者合用主要表现为VP-16的作用。结论:低浓度的TMP与VP-16合用可增加对小细胞肺癌细胞的诱导凋亡作用。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

大鼠肝实质细胞原代培养模型的研究及其功能鉴定

目的:为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型,并鉴定肝细胞的功能。方法:在传统的两步灌流法的基础上进行改良分离培养肝实质细胞;流式细胞术测定原代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况;SRB法测定不同培养基对原代肝细胞的生长和功能的影响。结果:分离得到的肝细胞成活率可达90%以上,纯度可达95%以上;流式细胞术结果表明原代肝细胞大多处于G0/G1期,且基本无凋亡;SRB法和白蛋白分泌量检测结果显示,低糖DMEM组原代肝细胞生长和白蛋白分泌功能在短期内(1~5 d)与高糖DMEM组没有明显差异;RPMI1640组肝细胞的生长和功能则明显低于前两组(P<0.05)。结论:体外培养的肝细胞活力和纯度均较高,体外培养后细胞功能正常,是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。