真皮多能干细胞移植治疗大鼠皮肤光老化的作用研究

目的 研究真皮多能干细胞移植对大鼠皮肤光老化(skin photoage)的治疗作用,为皮肤光老化提供新的治疗方法.方法 57只SD大鼠随机分为正常组8只和模型组49只,采用UVA和UVB紫外灯同时对模型组进行照射(2 h/d,连续照射60 d),随机取8只大鼠进行皮肤光老化模型鉴定,模型成功后随机分为对照组(不做任何处理)和治疗组(1×106细胞悬液).体外分离培养SD乳鼠DMSCs,经DAPI标记后,取治疗组大鼠9只,于皮肤光老化区真皮层内多点移植细胞悬液,分别在移植后1、3、7 d处死大鼠,在荧光显微镜下观察DAPI标记的DMSCs在皮肤光老化区域组织存活、迁移.其余16只大鼠在以同样的方法行DSMCs移植后于第4、8周分别采用免疫组织化学检测各组真皮中成纤维细胞的变化.结果 DMSCs移植后1、3、7 d,荧光显微镜观察到DAPI标记的阳性细胞在皮肤光老化区存活并逐渐向真皮层迁移;移植后4、8周,DSMCs治疗组大鼠光老化皮肤较对照组均有显著恢复;与对照组相比,移植4周后治疗组大鼠皮肤组织成纤维细胞增多,8周后广泛均匀弥散在皮肤各层,两组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 DMSCs移植对大鼠皮肤光老化具有明显的治疗作用.     

脱细胞猪小肠黏膜下层与猪脱细胞真皮基质作为真皮支架的对比研究

目的：应用脱细胞猪小肠黏膜下层与猪脱细胞真皮基质作为真皮替代物与SD大鼠自体刃厚皮片进行复合移植,修复SD大鼠全层皮肤缺损,比较两者优劣性,为临床提供更理想的真皮替代物。方法：以36只SD大鼠为动物模型,随机区组法随机分为两组,每组18只,在其背部造成2.5 cm×2.5 cm的全层皮肤缺损,实验组应用脱细胞猪小肠黏膜下层+自体刃厚皮移植修复,对照组应用猪脱细胞真皮基质+自体刃厚皮移植修复,移植后2周对移植皮片成活率分析研究,移植后4周、8周、12周取材进行一般观察、组织学观察和收缩率的计算。结果：术后2周,实验组植皮存活率大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。于术后4周、8周、12周动态观察,实验组植皮区收缩率较对照组低,但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色组织学观察,术后4周,两组植入材料与移植皮片融合度均很好,植入材料内及其周围均有大量的成纤维细胞和新生毛细血管长入,并有炎症细胞浸润;术后8周,两组植入材料内及其周围均有成纤维细胞和新生毛细血管长入,炎症细胞较术后4周时少,两组植入材料的原有胶原纤维结构尚清晰,出现疏松;术后12周,两组植入材料...     

同基因细胞源组织工程皮肤修复皮肤缺损的实验研究

目的利用近交系大鼠实验模型评价同基因细胞源组织工程皮肤修复大鼠全层皮肤缺损的效果,为其临床应用奠定基础。方法取近交系F344大鼠乳鼠皮肤,采用Dispase-胰蛋白酶两步消化法分离培养表皮细胞;取SD大鼠皮肤,按照高渗盐-SDS-胰蛋白酶化学处理法制备脱细胞真皮基质;依次利用浸没式培养和气液分离培养法将第2代表皮细胞与脱细胞真皮基质复合体外培养构建组织工程皮肤。取4～5周龄近交系F344大鼠36只,于大鼠背部两侧对称制备全层皮肤缺损,缺损面积为预实验确定的1.5 cm×1.5 cm。将72个创面随机分为3组(n=24),两侧移植不同修复材料:实验组移植组织工程皮肤、阴性对照组移植同种异体脱细胞真皮基质、阳性对照组移植自体全层皮肤(非原位移植)。术后行大体观察、皮片成活率、创面收缩率测量及组织学观察,评价修复效果。结果实验组术后4周创面可达到Ⅰ期愈合,与周围组织紧密连接,外观接近周围正常皮肤。术后4周,阴性对照组皮片成活率为0;实验组为62.5%(15/24),与阳性对照组91.7%(22/24)比较差异有统计学意义(χ2=5.779,P=0.016)。术后4周,实验组和阳性对照组创面收缩率显著低于阴性对照组(P<0.05),实验组与阳性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。组织学观察示实验组术后1周有轻微炎性反应;术后2周真皮层小血管和成纤维细胞大量增生,表皮层逐渐分化成熟;术后4周时伴随新生胶原纤维沉积,移植物真皮层出现胶原改建。结论同基因细胞源组织工程皮肤能够有效修复大鼠全层皮肤缺损,在防止创面收缩和促进创面愈合等方面均可达到类似于自体全层皮肤移植的效果。     

纳米脂肪改善裸鼠光老化皮肤质地的实验研究

目的初步探讨纳米脂肪改善紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤质地的作用和机理,为纳米脂肪在临床中应用于皮肤光老化治疗提供相关证据.方法选用6-8 周龄雌性BALB/c裸鼠1 8 只,分为4 组Control组（不行任何干预,n=6 ） ,PBSUVB 组（紫外线照射＋ PBS注射）,ADSCs-UVB 组（紫外线照射＋ADSCs注射,n = 6 ）,N anofat-UVB组（紫外线照射＋nanofat注射,n= 6 ） .注射4 周后取材,肉眼观察各组裸鼠皮肤质地;HE 和Masson染色分别观察裸鼠皮肤结构、真皮层厚度和胶原纤维排列情况;免疫组织化学CD31、K i- 6 7 染色观察皮肤微血管及细胞增殖情况.结果注射4 周后,皮肤大体观发现ADSCs-UVB 组、N anofat-UVB组与PBS -UVB 组之间未见明显差异.ADSCs-UVB 组、Nanofat-UVB组较PBS-UVB 组真皮厚（P 〈 0.05 ）,且 ADSCs-UVB 组比 Nanofat-UVB 组真皮厚（P 〈 0 .0 5 ）oADSCs-UVB 组和 Nanofat-UVB 组均较PBS -UVB 组微血管密度髙（P〈0.05）.ADSCs-UVB 组与Nanofat-UVB组间微血管密度无差异（P 〉 0 .0 5 ）.ADSCs-UVB 组较N anofat-UVB组表皮细胞增殖多（P〈 0 .0 5 ）,在真皮细胞增殖上两组无差异（P〉0 .0 5 ）.结论纳米脂肪具有促进真皮中胶原生成、微血管密度增加及表皮细胞增殖的作用.     

SD大鼠自然衰老皮肤组织模型的检测

目的通过比较4周龄年轻大鼠与18个月龄年老大鼠背部皮肤相关指标的差异性,确定自然衰老大鼠皮肤模型的建立。方法取年轻组和年老组大鼠背部皮肤组织,分别进行组织学HE染色、Masson染色和EVG染色,观察皮肤组织学形态变化;计算皮肤组织中真皮层厚度、胶原纤维和弹力纤维的相对面积值,并进行两组间比较。测定皮肤组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化脂质代谢产物丙二醛(MDA)和皮肤羟脯氨酸(Hyp)的含量。结果组织切片染色显示,SD大鼠年老组较年轻组皮肤层厚度变薄,胶原纤维面积和弹力纤维面积均减少(n=5,P0.05)。年老组皮肤组织中SOD和Hyp含量低于年轻组,而MDA含量则年老组高于年轻组(n=5,P0.05)。结论 4周龄年轻组大鼠皮肤与18个月龄年老组大鼠皮肤存在较大差异,且年老组大鼠皮肤抗氧化能力下降,胶原纤维含量减少,染色变浅,弹力纤维减少、变形,有部分呈断裂、缠结,可以作为自然衰老皮肤的实验动物模型。     

皮肤老化过程中弹力纤维的形态学变化

目的探讨年轻人正常皮肤、自然老化皮肤、光老化皮肤的弹力纤维形态学特征，建立评判皮肤弹力纤维损伤程度及治疗药物对其修复程度的简单、实用方法。方法分别取年轻人光保护皮肤（年轻人正常皮肤）、老年人光保护皮肤（自然老化皮肤）以及老年人光暴露皮肤（光老化皮肤）进行甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，醛品红染色（Gomori染色法）。结果在年轻人光保护皮肤耐酸纤维、前弹力纤维及成熟的弹力纤维组成结构完整清晰的弹力纤维网络。老年人光保护皮肤的弹力纤维损伤相对较轻，主要表现为真皮乳头处耐酸纤维数量明显减少，真皮中上层弹力纤维轻度增粗及片段化。老年人光暴露皮肤的弹力纤维损伤明显，表现为真皮乳头处耐酸纤维消失，真皮浅层和中层弹力纤维明显增粗、扭曲、断裂、分支、形成团块。结论年轻人正常皮肤、自然老化皮肤、光老化皮肤的弹力纤维形态学各具有明显的特征，Gomori染色法是评价皮肤老化过程中弹力纤维损伤效果及治疗药物对其修复效果的简单、实用方法。     

血小板源性生长因子基因修饰的人工复合皮移植大鼠创面效果观察

目的观察血小板源性生长因子B(PDGFB)基因修饰的人工复合皮移植大鼠创面后的效果。方法构建PDGFB真核表达质粒,在脂质体介导下转染大鼠成纤维细胞。分别构建复合皮1(角质形成细胞 猪脱细胞真皮基质 PDGFB基因转染的成纤维细胞)和复合皮2(角质形成细胞 猪脱细胞真皮基质 未转染的成纤维细胞),移植于大鼠背部全层皮肤缺损创面,相应设为转染组、未转染组(各18只)。以不作皮肤移植的8只大鼠全层皮肤缺损创面为对照组。术后2周观察大鼠创面移植皮片存活情况。术后2、4、6周观察大鼠创面大体情况,计算创面收缩率,并取创面组织标本进行组织学观察。结果(1)术后2周,转染组大鼠中皮片完全存活者14只、部分存活者3只、未存活者1只;未转染组大鼠中皮片完全存活者10只、部分存活者4只、未存活者4只。(2)术后2周,对照组创面结痂。术后6周转染组移植皮片表面光滑,有弹性,抗磨擦性强,愈合效果优于其他两组。(3)术后2、4、6周,对照组大鼠创面收缩率均高于其他两组,转染组创面收缩率低于未转染组(P<0.05)。(4)术后2周转染组移植皮片内可见较多毛细血管分布;6周时表皮细胞分化达7～10层,纤维排列致密整齐,毛细血管分布均匀。结论用含PDGFB基因的人工复合皮移植修复创面,可明显提高创面愈合质量。     

点阵CO2激光和Nd∶YAG激光对自然老化小鼠真皮重塑的比较研究

目的:比较点阵CO2激光和Nd:YAG激光(准长脉宽1 064nm波长)对老化昆明小鼠真皮重塑的作用,并探讨二者嫩肤作用机制,为临床选择治疗方法提供理论依据。方法:应用两种波长激光照射自然老化昆明小鼠背部脱毛皮肤,通过HE染色进行成纤维细胞计数及真皮厚度测量,饱和苦味酸-天狼猩红染色观察皮肤Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维的表达及Gomor i醛品红染色观察弹力纤维的变化。结果:两组照射组中真皮厚度、成纤维细胞计数和弹力纤维容积分数的值均高于正常对照组(P均<0.05);点阵CO2激光组均高于Nd:YAG激光(准长脉宽1064nm波长)组(P均<0.05);两组照射组中Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白容积分数均高于正常对照组(P均<0.05),但照射两组间差别无统计学意义。结论:点阵CO2激光和Nd:YAG激光(准长脉宽1064nm波长)均可引发小鼠真皮重塑,前者效果优于后者。     

碱性成纤维细胞生长因子和硫糖铝联合局部应用对扩张皮肤组织结构的影响

目的　探讨碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)和硫糖铝对扩张皮肤组织结构的影响。方法　白色小猪 9只 ,自身对照。在猪两侧侧胸埋置皮肤扩张器。持续恒压扩张同时实验 组注入 b FGF和硫糖铝 ,实验 组注入b FGF和生理盐水 ,实验 组注入硫糖铝 ,对照组注入生理盐水共 7天。各组完成扩张后第 3天及取出扩张器后 6周取材行组织学检查。结果　实验 组皮肤表皮层增厚更明显 ,颗粒和棘细胞层次更多 ,基底细胞数目增多 ,细胞核肥大 ,染色质变浓 ,排列密集 ,表皮钉突增多 ,呈粗长发育成巨大钉突 ;真皮层厚度变化较轻 ,胶原纤维束粗而密 ,平行于皮面排列 ,弹力纤维明显增加 ;成纤维细胞和毛细血管密度更高 (P<0 .0 5 )。对照组表皮层和真皮层有相应的变化均弱于实验 组 ,术后 3天、6周胶原纤维可见断裂。实验 、 组表皮层和真皮层组织改变与对照组差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。各组纤维包膜厚度近似。结论　在持续恒压扩张同时扩张囊周围注入外源性 b FGF和硫糖铝 ,能更有效地刺激皮肤生物性生长 ,促进扩张速率 ,缩短扩张时间     

强脉冲光促进大鼠皮肤转化生长因子-β1表达的实验研究

目的观察强脉冲光照射对SD大鼠皮肤转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达的影响,以进一步阐明强脉冲光治疗皮肤光老化可能的机制。方法随机选取15只SD大鼠,两侧背部皮肤去毛,以一侧为强脉冲光照射实验组,对侧背部皮肤作对照组。采用波长560～1200 nm、能量27 J/cm~2、脉宽3.0 ms、双脉冲方式、脉冲延时10 ms的强脉冲光照射实验组皮肤,取术前及术后4周大鼠实验侧和对照侧皮肤标本,行大鼠皮肤TGF-β1蛋白免疫组化染色定位,观察大鼠皮肤TGF-β1的分布情况以及强脉冲光照射后TGF-β1的表达变化。结果TGF-β1分布于大鼠正常皮肤全层,主要分布在细胞外结缔组织基质胶原纤维中。强脉冲光照射刺激大鼠皮肤分泌TGF-β1,实验组强脉冲光照射4周后,大鼠皮肤TGF-β1表达较对照组显著增强(P<0.001),阳性产物主要分布在细胞外结缔组织中。真皮浅层较对照组有非常强烈的棕黄色着染,同时皮肤表皮细胞亦出现明显的阳性表达产物。阳性表达区成纤维细胞数量明显增多。结论强脉冲光照射后上调大鼠皮肤TGF-β1的表达,是强脉冲光治疗皮肤光老化的内在机制。     

脂肪干细胞对D-半乳糖致裸鼠皮肤老化的拮抗作用及对皮肤恢复功能的影响

目的:本文通过研究脂肪干细胞(Adipose stem cells,ASCs)在D-半乳糖诱导裸鼠皮肤老化的拮抗作用及其对皮肤恢复功能的影响,旨在探讨抗衰老机制并为临床上抗衰老疗法提供新的思路。方法:选择SPF级裸鼠40只,随机分为4组:对照组、D-半乳糖+磷酸盐缓冲液(PBS)组、D-半乳糖+ASCs组与D-半乳糖+氨基胍(AG)组,每组10只。对D-半乳糖+PBS组,D-半乳糖+ASCs组和D-半乳糖+AG组的裸鼠的背部进行皮下注射1 000mg/kg D-半乳糖,每天1次,持续8周。2周之后,3组小鼠背部分别注射PBS缓冲液(0.5ml)、ASCs(1×10^6/ml)和AG(100mg/kg),均注射至真皮层,每天1次,4周后处死。取每组皮肤组织,采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA),黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD),ELISA法测定晚期糖基化终末产物(AGEs)、总胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平。通过HE染色和马松染色比较各组皮肤组织真皮层厚度及胶原分布比,采用免疫组化测定各组CD31及血管内皮生长因子(VEGF)表达情况。结果:四组裸鼠的体重与模型构建前并无显著差别。对照组裸鼠表现为充满活力,反应敏捷,并且皮肤富有弹性,粪便无明显臭味;衰老小鼠模型皮肤逐渐变弱,变薄,失去弹性,并患有便秘,且排泄物发臭;而经ASCs或AG处理的小鼠裸鼠在处理后情况有所改善。相较于对照组,D-半乳糖+PBS组裸鼠SOD、总胶原蛋白、CD31、VEGF、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平显著降低,MDA及AGEs表达量显著增加,而通过ASCs或AG处理的裸鼠各指标水平均有所改善。HE及马松染色结果显示,相较于对照组,D-半乳糖+PBS组裸鼠真皮层相对较薄,胶原分布比明显降低,而经ASCs或AG处理的裸鼠鼠真皮层有所增厚,胶原分布比显著上升。结论:ASCs移植对D-半乳糖诱发衰老的裸鼠的自由基与糖基化水平具有良好的拮抗作用,为ASCs的移植抵抗肌肤衰老的理论提供了实验依据。     

骨髓间充质干细胞经脾移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）经脾移植治疗急性肝功能衰竭的疗效，并观察MSCs在体内的迁徙情况。方法 收集1只SD雄性大鼠胫骨及股骨的骨髓，采用密度梯度离心联合贴壁培养法分离、纯化及扩增雄性SD大鼠的骨髓MSCs，再行免疫组化染色以观察第4代骨髓MSCs的表面标志物。联合应用D-氨基半乳糖和肿瘤坏死因子-α （TNF-α）建立24只雌性大鼠急性肝功能衰竭模型，将其随机分为2组：实验组（n=12）大鼠于造模后24 h行骨髓MSCs脾内移植；空白对照组（n=12）仅于脾内注射0.5 mL生理盐水。2组大鼠于移植后均取血检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBIL）及白蛋白（ALB）水平，采用PCR法检测大鼠肝脏组织中Y性别决定区基因（SRY基因）的表达，并行HE染色观察肝脏组织的病理学改变。结果 第4代MSCs表达CD44和CD29，但不表达CD34。MSCs移植72 h及以后，实验组存活5只大鼠（41.7%），空白对照组存活3只大鼠（25.0%），2组大鼠的存活率比较差异有统计学意义（P＜0.05），实验组较高。将雄性大鼠的骨髓MSCs移植于雌性大鼠的脾内后，在雌性大鼠肝脏中能检测到SRY基因的表达；且HE染色结果显示，实验组大鼠的肝功能在移植后4周明显改善。移植后与空白对照组比较，实验组各时点的ALT和TBIL水平均较低（P＜0.05）；移植后1周和2周，实验组的ALB水平均高于空白对照组（P＜0.05）。结论 骨髓MSCs经脾内移植后迁徙并定居于受损的肝脏内，可替代肝细胞的功能。     

嗅鞘细胞移植在大鼠截瘫模型中的应用

目的探讨嗅鞘细胞局部移植治疗脊髓损伤的可行性、安全性及细胞移植数量和时机与疗效的关系。方法应用改良Allen’s法制备大鼠T10脊髓损伤模型,第1部分：随机分4组,移植时间分别设定为手术即时0,1,2,3周,共分为上述4组（随机）,每组共10只,4周后进行CBS评分。第2部分：取40只大鼠,随机分为5组,A组：注细胞数量为5：〈10。个。B组：移植方法同A组。注入细胞数量为4×10^5个。C组：移植方法同A组,注入细胞数量为3×10^5个。D组：移植方法同A组,注入细胞数量为2×10^5个;E组：移植方法同A组,将20μlDMEM／F12培养液注入损伤部位。结果在移植细胞为固定的4×10^5个时,损伤后2周移植大鼠CBS评分（损伤后4周,20．12±5．23,P〈0．05）较其余时间好：而在移植时间均为损伤后两周的情况下。B、C两组大鼠CBS评分（损伤后4周,B：20．34±5．63,C：20．34±5．63,P〉0．05）无明显差别,但较其余各组好（P〈0．05）。结论嗅鞘细胞局部移植治疗脊髓损伤安全有效,移植细胞数量适中和移植时间在2周时脊髓神经功能恢复较好。     

应用改良扩张器构建大鼠皮肤软组织扩张模型

目的应用改良设计的短注射导管枕形扩张器构建大鼠皮肤软组织扩张模型，并探讨其产生的扩张应力对大鼠皮肤细胞增殖分化的影响，验证扩张模型的扩张效果，为研究扩张皮肤新生机制提供一个稳定的动物模型。方法SD大鼠随机分为A、B两组（每组各30只），A组大鼠采用改良设计的扩张器，B组大鼠采用上海威宁公司生产的普通扩张器；选择SD大鼠近颈部切口，以注射壶外置的方式埋置扩张器，制作皮肤软组织扩张模型。分别采集A组在不同扩张时间点（1、2、3、4、5周）的扩张中心区域皮肤和正常皮肤组织作为标本；利用HE染色方法观察扩张后皮肤结构的变化；根据增殖细胞表达增殖细胞核抗原，采用免疫组织化学染色方法观察扩张皮肤中细胞增殖的情况。结果A组应用自行改良设计的扩张器，选择大鼠近颈部切口构建的皮肤软组织扩张模型，术后外置的注射壶不易被大鼠咬掉，且术后注水及护理更简单，模型稳定性显著高于B组。HE染色结果表明，扩张后皮肤的表皮层明显增厚，真皮层变薄；免疫组织化学染色结果显示，增殖细胞呈点状分布，主要集中于表皮基底层和毛囊鞘。结论自行改良设计的短注射导管枕形扩张器，是构建大鼠皮肤软组织扩张模型的良好实验材料；扩张应力对大鼠的皮肤结构和增殖产生了影响。     

自体移植的大鼠骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处的存活及分化

目的观察自体移植的骨髓间充质干细胞(BMSC)在脊髓损伤(SCI)处的存活及向神经细胞分化情况。方法将36只雄性SD大鼠随机分为PBS注射组(PBS组)和BMSC自体移植组(BMSC组)。BMSC组大鼠在术前均进行自体BMSC分离培养。2组大鼠均采用改良Allen撞击装置制备T9水平的SCI模型,PBS组于损伤处注射PBS,BMSC组注射第4代自体BMSC。于移植后2、3、5周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法进行运动功能评分;移植后2、3、5周取损伤部位脊髓,采用Hoechst33342染色法观察移植细胞存活情况,同时行免疫荧光化学染色检测自体移植的BMSC中微管相关蛋白2(MAP-2)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果移植后2、3、5周,BMSC组大鼠BBB评分均高于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植后2、3、5周,BMSC组大鼠损伤处脊髓有不同数量Hoechst33342标记细胞存活,其中2周时细胞存活较多,5周时细胞存活较少;移植后2、3周,未检测到移植细胞表达MAP-2及GFAP,5周时检测到部分移植细胞表达MAP-2和GFAP。结论SCI后立即进行移植的自体BMSC可在损伤处存活,部分存活细胞可向神经元和星形胶质细胞方向分化,促进大鼠后肢运动功能的恢复。     

利用人源化小鼠研究组织工程材料的体内免疫原性

目的建立并利用人源化小鼠模型,研究组织工程材料的体内免疫原性。方法利用NOD／SCID小鼠（非肥胖型糖尿病鼠与重症联合免疫缺陷鼠反交鼠模型）．通过腹腔注射人外周血单个核细胞（PBMC）（100×10^6）建立人源化小鼠,在人源化小鼠皮下植入异体人皮肤（阳性对照）、人体脂肪干细胞与脱钙骨构建的组织工程骨（实验组）、单纯脱钙骨材料（阴性对照）。在植入后1周、2周、3周、4周,取小鼠尾静脉血,流式细胞仪检测人CD4^＋和CD8^＋淋巴细胞比例。4周后,取小鼠的移植局部皮肤进行HE染色分析,同时检测脾细胞人CD4^＋和CD8^＋淋巴细胞比例。结果NOD／SCID小鼠腹腔注射人PBMC4周内,在外周血和脾中均可测到人CD4^＋和CD8^＋淋巴细胞。病理分析结果显示：在人源化小鼠皮下植入的组织工程材料及成体干细胞构建的组织工程骨组未见炎性细胞浸润;而单独植入人皮肤组可见明显的炎性细胞浸润。结论人源化小鼠可作为组织工程材料体内免疫原性的研究的良好模型。     

Transplantation of acellular dermis and keratinocytes cultured on porous biodegradable microcarriers into full-thickness skin injuries on athymic rats

In search of an optimal transplantation regime for sufficient dermal and epidermal regeneration after a full-thickness skin injury, wounds on athymic rats were grafted with split-thickness skin grafts or acellular human dermis followed by transplantation with human keratinocytes either in single-cell suspension or cultured on porous biodegradable microcarriers. After 2 weeks, all wounds grafted with acellular human dermis showed a well organised and vascularised dermal component and reepithelialisation on the grafted dermal matrix was complete 21 days after transplantation with human keratinocytes. Wounds grafted with human keratinocytes seeded on biodegradable microcarriers or split-thickness skin grafts displayed over time (i.e. 16-21 days post-transplantation) a significantly thicker epithelial cell layer in comparison to wounds grafted with keratinocytes in single-cell suspensions or microcarriers not seeded with cells. Furthermore, measurements of dermal thickness in the closed wounds 21 days after grafting showed a significantly thicker and well organised neodermal component in wounds transplanted with keratinocytes seeded on microcarriers or split-thickness skin grafts compared to all other wounds. Positive immunostaining towards von Willebrand factor revealed the plausible proangiogenic effects of transplantation with keratinocytes seeded on microcarriers. Analysis of representative tissue sections after fluorescence in situ hybridisation visualised that grafted human keratinocytes were present in the epidermal layers covering the wounds 16 and 21 days after transplantation, strongly indicating preservation of cell viability. These results shows that the use of biodegradable microcarriers in the culture of autologous keratinocytes for treatment of full-thickness wounds not only facilitate the cultivation, transportation and transplantation processes but also enhances the dermal regeneration induced by a dermal scaffold which results in a clinical result that is significantly superior to the one obtained when keratinocytes are transplanted in a single-cell suspension.     

Ad-EGFP修饰的MSCs在糖尿病足溃疡大鼠体内的示踪及疗效观察

目的：观察自尾静脉移植Ad-EGPF修饰的大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）在糖尿病足溃疡模型大鼠胰腺、肾脏及溃疡局部的示踪情况,并观察移植后大鼠血糖、体重及溃疡面积的改变情况。方法：贴壁法体外分离培养iW st ar大鼠BMSCs,传代培养后用携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒（Ad-EGFP）以感染复数（MOI=150）体外转染。60只iW st ar大鼠,雌雄各半,随机分为3组;糖尿病治疗组（糖尿病足溃疡大鼠细胞移植治疗组）、糖尿病对照组（糖尿病足溃疡大鼠PBS对照组）使用链脲菌素（STZ）诱导糖尿病模型后,连同正常对照组（正常足溃疡大鼠PBS对照组）制作足部溃疡模型。造模成功后,糖尿病治疗组经尾静脉注射转染Ad-EGFP 72h后的BMSCs悬液0.5 ml（细胞数5×106个）,糖尿病对照组及正常对照组注射等量PBS溶液。分别于细胞移植后7天、14天、21天测量体重、空腹血糖水平、足部溃疡面积;并于细胞移植后14天,观察BMSCs在胰腺、肾脏及足溃疡局部的分布情况。结果：移植后14天可在糖尿病大鼠胰腺、肾脏及皮肤溃疡面观察到Ad-EGFP标记的BMSCs.糖尿病治疗组大鼠体重明显恢复、血糖显著降低、足溃疡愈合加速,与糖尿病对照组相比,差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论：BMSCs具有归巢特性,并可能对糖尿病及足溃疡有一定的治疗效果。     

骨髓间充质干细胞治疗慢性后肢缺血机理的初步研究

目的利用细胞示踪技术探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）治疗慢性后肢缺血的相关机理。方法采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离和培养大鼠MSCs,并以5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记。采用线栓法制备8只Lewis大鼠慢性后肢缺血模型,将其随机均分为MSCs移植组和对照组,分别于患侧后肢肌肉注射MSCs和生理盐水。分别于移植术后第7天和第14天,对其进行临床观察、后肢血流量测定及后肢血管造影,再于相应时间点处死大鼠,取患侧后肢股四头肌和腓肠肌,行HE染色及BrdU免疫组化染色。结果移植术后14 d,8只大鼠全部成活,移植部位均无坏死和肿瘤形成;MSCs移植组大鼠患侧/健侧后肢的血流灌注比值明显增高（1.773比1.279）,而血管造影结果提示2组大鼠的侧支血管数量比值未见显著增加（0.908比0.835）。HE染色结果示2组大鼠的股四头肌及腓肠肌并未发生特殊的病理学变化。BrdU免疫组化结果显示,阳性颗粒定位为股四头肌及腓肠肌的间质细胞和血管内皮细胞;且MSCs的分布存在差异,移植术后7 d腓肠肌内阳性细胞所占比例明显高于股四头肌,而14 d时则相反。结论 MSCs移植在术后早期可以提高血流灌注量,但这并非为增加了侧支血管数量使然,MSCs移植后所引起的旁分泌效应可能在术后早期起着重要的作用。     

子宫内膜间充质干细胞对小鼠模型薄型子宫内膜的修复作用

目的观察小鼠子宫内膜间充质干细胞对小鼠模型薄型子宫内膜的修复作用。方法选择8周龄动情期规律C57BL/6J小鼠共288只,随机分为空白对照组、模型对照组、干细胞移植组,每组96只。空白对照组不做任何处理;模型对照组宫腔注射95%乙醇损伤后立即原位注射PBS 0.1 ml,3 d后尾静脉注射PBS 1 ml;干细胞移植组宫腔注射95%乙醇损伤后立即原位注射子宫内膜间充质干细胞0.1 ml,3 d后尾静脉注射子宫内膜间充质干细胞1 ml,干细胞浓度为5×105/ml。每组根据取样时间(3 d、7 d、14 d、30 d)不同分为4小组,取样当日,半数小鼠子宫组织取样,4%多聚甲醛固定送检,进行子宫内膜厚度、HE染色、免疫组化等检测;另半数小鼠与确定有生殖能力C57BL/6J雄鼠合笼,进行生育力评估。结果干细胞移植组小鼠子宫内膜厚度在各时间点均显著厚于模型对照组(P<0.05),但与空白对照组仍有一定距离(P<0.05)。HE染色结果显示,干细胞移植后的受损子宫内膜上皮层及基质层均增厚,腺体增加。免疫组化结果显示,干细胞移植组角蛋白、波形蛋白、VEGF、ERα各项指标均有显著上升,与模型对照组有显著性差异(P<0.05)。生育力评估发现,模型对照组生育率接近于0(仅30 d亚组1例),而干细胞移植组生育率显著升高,30 d亚组生育率达50%,接近空白对照组(66.7%)。结论小鼠子宫内膜间充质干细胞对薄型子宫内膜有显著改善。