石棉相关肿瘤p53基因突变的免疫组化及PCR—SSCP研究

为了分析石棉相关肿瘤ｐ５３基因的突变特点，对石蜡包埋的石棉相关肿瘤ｐ５３基因突变体蛋白的表达进行了免疫组化观察，提取染色体ＤＮＡ，对ｐ５３基因的第５、７、８外显子进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及测序分析。免疫组化观察发现：在分析的１０例病例中有５例阳性。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析发现７例（８处）发生突变，其中４处集中在第８外显子上。５例腺癌中有４例发生ｐ５３基因突变。测序发现热点区突变。提示：石棉相关肿瘤ｐ５３基因突变率高。     

石棉肺癌组织中p53基因突变的PCR-SSCP及部分序列分析研究

为研究石棉致癌的分子机理，本研究首次直接分析石蜡包埋的石棉肺癌病例肺组织中抗癌基因ｐ５３的突变情况。利用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术分析１０例石棉肺癌病例，检测到７例（８个片段）存在ｐ５３基因的突变，突变位点位于其第５、７和８外显子区内，突变率为７０％。对其中２例进行ＰＣＲ产物直接序列分析，发现其基因一级结构分别发生Ｃ→Ａ和Ｔ→Ａ转换。     

PCR-SSCP技术检测矽肺合并肺癌癌组织p53基因突变的研究

用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析法对３６例矽肺患者的石蜡包埋的原发性肺癌组织ｐ５３基因第５、７、８外显子进行了检测，检出突变１５例。突变在第５、７、８外显子上都有发生，但以第８外显子上发现的阳性突变最多。对肿瘤类型和ｐ５３基因突变的关系进行了分析，发现矽肺病例肺腺癌ｐ５３基因阳性突变率最高，为５３．９％，高于普通型肺癌（３３．０％）。进一步对其中１例样本进行核苷酸序列直接测定，结果显示第５外显子非突变热点区的第１４４位密码子核苷酸由ＣＡＧ突变为ＡＡＧ，氨基酸由谷氨酰胺突变为赖氨酸，以上结果与非职业肺癌明显不同，提示ｐ５３基因突变在矽肺病例肺癌发生中起着重要作用，可能与矽尘作业环境中含有的某些化学致癌物有关。     

用PCR—SSCP方法检测间皮瘤组织中p53基因点突变

为研究石棉纤维在人恶性间皮瘤病因学中的作用，检查了青石棉污染区１２例间皮瘤ＤＮＡ样品的ｐ５３基因点突变。应用非同位素ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了ｐ５３基因５，６，７，８外显子的４个ＤＮＡ片段，结果显示：４例有异常移动的单链ＤＮＡ电泳带，其中２例位于外显子５，２例位于外显子６。提示：这些病例的ｐ５３基因存在点突变     

应用PCR-SSCP检测转化细胞中p53基因突变

利用化学致突变物甲基丙烯酸环氧丙酯体外诱导人胚肺成纤维细胞，使之发生转化，分离转化细胞克隆。经ＰＣＲ特异性扩增ｐ５３基因外显子第５和第８，银染单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析，结果表明转化细胞中ｐ５３基因外显子第８发生突变，揭示出ｐ５３基因在化学致突变物诱导细胞转化中起着重要作用。     

接触矽尘及电焊烟尘工人肺癌组织中p53基因的初步研究

为了从分子水平揭示矽尘与肺癌的关系，采用免疫组化和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法对３６例矽尘相关肺癌和６例电焊烟尘相关肺癌的抑癌基因ｐ５３的突变进行了研究。样品为石蜡包埋的肺肿瘤组织块，平均保存１３．４年。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析显示，１８例病例中存在异常的电泳条带（２０处突变），占所测４２个样品的４２．９％，其中５０％的突变发生于第８外显子上（１０／２０）。以上发现有别于非职业性肺癌的基因突变谱。在非职业性肺癌中，第８外显子的突变频率介于１７．５％～２３．５％。尘肺相关肺癌基因突变的发生频率，在不同病理分类的肺癌中也与普通肺癌不同。在普通肺癌中，小细胞肺癌ｐ５３基因突变率最高（７０％），肺腺癌最低，为３３％。而本研究结果相反，肺腺癌最高，小细胞肺癌为最低，分别为５３．９％和３０．８％。免疫组织化学观察也显示了很高的ｐ５３突变体蛋白表达的发生率（４６．９％）。本研究仅做两例测序分析，意外地发现，探测到的两处点突变均发生于ｐ５３基因突变的非热点区，而且均发生于第１４４密码子上。基因突变谱的不同，显示矽尘、电焊烟尘中可能具有特异的致癌物和致癌机理。     

石英的人类致癌性在DNA分子水平的证据

收集３６例石英粉尘作业工人肺癌（石英肺癌）的组织石蜡包埋物,提取其 Ｄ Ｎ Ａ,对 ｐ５３基因和 Ｋ ｒａｓ 基因进行了 Ｐ Ｃ Ｒ Ｓ Ｓ Ｃ Ｐ、 Ｐ Ｃ Ｒ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ及 Ｄ Ｎ Ａ 测序分析,发现具有完全有别于普通肺癌的特异基因突变谱。小细胞肺癌的 ｐ５３基因突变多发于第８外显子,腺癌的 ｐ５３基因突变率高。石英肺癌的 Ｋ ｒａｓ 基因突变未见一例发生于普通肺癌突变热点区第１２密码子上,相反发现多处非热点区突变,突变类型以 Ｇ→ Ｃ 突变为主。     

杂色曲霉素致人胚肺细胞p53及Ki-ras基因突变研究

为探讨中国恶性肿瘤高发区粮食中优势污染霉菌毒素－杂色曲霉素（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｉｎ,ＳＴ）的致癌作用,运用银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法分析了不同浓度的ＳＴ（１μｇ／ｍｌ和３μｇ／ｍｌ）对体外培养的人胚肺细胞恶性转化过程中抑癌基因ｐ５３第５、６、７、８显外子及癌基因Ｋｉ－ｒａｓ的突变情况。结果显示ＳＴ处理后第２２周,人胚肺成纤维细胞ｐ５３基因的第８外显子和Ｋｉ－ｒａｓ癌匀出现异常泳动带型,表明Ｓ     

烟草致癌物诱发人支气管上皮恶性转化细胞中p16基因的变化

采用银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法检测ＮＮＫ诱发ＢＥＰ２Ｄ恶性转化细胞中ｐ１６基因变化。与对照组比较,转化细胞中ｐ１６基因的Ｅ１．β外显子带型出现变异,而第１～３外显子均未见泳动变位,提示Ｅ１．β外显子突变和／或缺失所致细胞周期失调是ＮＮＫ诱发人类支气管上皮细胞癌变的可能原因之一。     

杂色曲霉素对人胚胃粘膜细胞p53基因致突变研究

为探讨杂色曲霉素（ＳＴ）的致癌作用，运用细胞培养、流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）和银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ等方法研究了不同浓度的ＳＴ（１ｍｇ／Ｌ和３ｍｇ／Ｌ）诱发体外培养的人胚胃粘膜细胞恶性转化情况以及此过程中抑癌基因ｐ５３在蛋白及基因水平上的变化。结果表明，ＳＴ处理４周后处理细胞增殖旺盛，并出现恶性转化灶；ＳＴ处理２４周后处理细胞可在软琼脂上形成细胞集落（ＳＴ１ｍｇ／Ｌ和３ｍｇ／Ｌ组每皿细胞集落数平均分别为１５和１７个）；ＦＣＭ检测结果表明，ＳＴ处理的细胞细胞增殖指数增高，ＤＮＡ含量增高，出现ＤＮＡ异倍体，突变型抑癌基因ｐ５３蛋白表达明显增强。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析结果显示，ＳＴ处理２２周后，处理细胞ｐ５３第８外显子出现异常泳动带型。本研究进一步证实了ＳＴ对体外培养的人胚胃粘膜细胞的致癌作用     

人宫颈癌及慢性宫颈炎组织内P_(53)基因变异的研究

本文应用多聚酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)分析,对人宫颈癌(cervical carcinoma)和慢性宫颈炎(chronic cervicitis)组织内的P_(53)基因5-6、7-8、9外显子(exon)变异进行研究。结果表明:35例宫颈癌组织中8例出现了异常电泳带,总变异率22.86％(8/35)。其中,5-6外显子2例,变异率为5.71％(2/35);7-8外显子5例,变异率为14.29％(5/35),是变异率最高的基因片段;9外显子1例,变异率为2.86％(1/35)。8例变异标本中3例P_(53)5-6、7-8外显子同时发生突变,占变异标本的37.5％(3/8),占宫颈癌组织总标本的8.57％(3/35)。17例慢性宫颈炎组织P_(53)5-6、7-8、9外显子均未出现异常。提示:PCR-SSCP技术能有效地检出宫颈组织P_(53)基因5-9外显子变异的情况;P_(53)5-9变异是人宫颈癌发生发展过程中的一个重要事件和生物学行为;宫颈癌组织P_(53)变异多发生在5-8外显子,有不同外显子同时变异的现象;慢性宫颈炎组织无P_(53)5-6、7-8、9外显子变异现象,说明该病的发生发展与抑癌基因P_(53)外显子变异无关。     

食管癌与p53突变和人乳头状肉瘤病毒感染

目的探讨p53基因突变与人乳头状肉瘤病毒16（HPV16）感染在食管癌发病中的作用及相互关系。方法应用病例-病例研究方法进行分析，采用聚合酶链反应（PCR）、单链构像多态性（SSCP）、测序等分子生物学技术对110例食管癌组织标本中p53基因的突变与HPV16感染进行了检测。结果110例食管癌组织标本p53基因突变率为49．1％，其中外显exon5—6，exon7，exon8—9的突变率分别为19．1％，27．3％，17．2％。食管癌组织HPV16的检出率为49．1％。吸烟患者p53基因突变率（61．4％）明显高于非吸烟患者p53基因突变率（48．2％），差异有统计学意义；淋巴结转移患者p53基因突变率（65．2％）明显高于无淋巴结转移患者p53基因突变率（37．5％）；HPV16阳性者中，p53突变率是40．7％，HPV16阴性者仅为57．1％，两者差异无统计学意义。结论HPV16感染可能是食管癌高发区的危险因素；p53基因突变与吸烟、淋巴结转移有明显相关性；HPV16感染和p53基因突变可能是2个独立的事件。     

聚合酶链反应-单链构象多态法在研究新疆地方性砷中毒患者p53基因突变中的应用

目的 探索砷致癌的基因多态性,为进一步研究砷对人体健康作用的远期影响提供科学依据.方法 于2001年采集新疆奎屯123团4例经病理诊断为皮肤癌的砷中毒患者的6份皮肤癌石蜡包埋组织及其4份血液组织;采集奎屯128团2例经病理诊断为皮肤癌的砷中毒患者和2例癌前砷中毒患者的血液组织;采集对照区新疆奎屯125团2例健康居民的血液组织.采用聚合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)银染术测定p53基因外显子(exon,E)5～9突变情况.结果 p53基因中,仅E6、E7发生突变.凝胶电泳成像显示,p53基因E6、E7有异常条带、条带缺失及条带上移现象.结论 砷对p53基因有致突变作用,突变位于E6、E7.     

利用激光捕获显微分离技术和突变分析法检测肺癌病人痰细胞的K-ras和p53基因突变

[目的]探索激光捕获显微分离技术在检测肺癌病人K-ras和p53基因突变的应用。[方法]以3种不同的基因突变分析法对20例患者的痰细胞进行基因突变分析：①以PCR＋DGGE方法分析K—ras基因突变,以PCR＋SSCP方法分析p53基因突变;②以PCR十MAE＋DGGE方法分析K—ras基因突变;以PCR＋MAE＋SSCP方法分析p53基因突变;③以激光捕获显微分离技术和突变分析法检测肺癌病人痰细胞的K—ras和p53基因突变。[结果]在20例患者中,以现有的方法仅发现有15％（3／20）的基因突变,而激光捕获显微分离技术则发现有60％（12／20）的基因突变。[结论]激光捕获显微分离技术和突变分析法能高效灵敏检测肺癌病人痰细胞的K—ras和p53基因突变。