一种简便高效制备伯氏疟原虫蛋白的实验方法

目的：探讨建立简便有效的大量制备鼠伯氏疟原虫蛋白的方法.方法：采集伯氏疟原虫感染晚期的大鼠外周血经肝素抗凝,通过白细胞滤器过滤去除白细胞,再使用30%阿拉伯胶溶液经密度梯度离心法分离含虫红细胞,经皂素溶血,收集纯化的原虫,虫体经超声波破碎后离心,上清液经SDS-PAGE电泳分析.采用蛋白凝胶灰度扫描方法分析蛋白电泳条带的分布.结果：从大鼠含虫外周血可分离制备出大量的可溶性疟原虫蛋白,对大鼠分离的疟原虫可溶性蛋白与小鼠来源的原虫可溶性蛋白比较,两种蛋白的电泳图谱完全相同.结论：利用大鼠模型可简便高效地制备大鼠伯氏疟原虫,结合超声波破碎法可提取足量的可溶性疟原虫蛋白抗原.     

恶性疟原虫PfRh5F2片段pTGub21b表达载体的构建及融合蛋白表达鉴定

目的克隆表达恶性疟原虫网状细胞结合蛋白同源体5(PfRh5)F2片段,并评价其抗原性。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pTGub21b中,构建PfRh5F2/pTGub21b原核表达载体。IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,并用Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PfRh5F2/pTGub21b原核表达系统,并在大肠杆菌中可溶性高效表达,表达产物能被恶性疟患者血清识别,而重组抗原免疫鼠血清也能识别恶性疟患者血样中的相应抗原。结论恶性疟原虫PfRh5 F2片段在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。     

ISA720与CpG联合佐剂增强恶性疟原虫抗原的免疫原性

目的评价CpG佐剂对以PfCP-2．9f/ISA720佐剂为基础的联合疟疾抗原的免疫原性。方法使用ISA720及ISA720＋CpG佐剂与恶性疟原虫抗原制备制剂,免疫BALB／c小鼠,考察不同佐剂增强免疫的效果。通过检测免疫血清中特异性IgG的水平、识别天然抗原的能力、分析特异性IgG的亚类分布等指标进行评价。结果CpG佐剂显著提升了联合疟疾抗原在BALB／c小鼠中产生特异性抗体的量（P〈0．01）,免疫血清能有效识别红内期疟原虫天然抗原,IFA滴度显著提高（P〈0．01）,IgG亚类分析显示该佐剂能有效刺激小鼠产生针对PfCP-2．9和Pfclet-3的多种IgG亚类抗体。结论CpG显著提高了联合疟疾抗原的免疫原性。     

疟原虫纯化新方法的研究

目的：拟应用去白细胞输血器,建立一种快速简便纯化疟原虫的新方法,以去除宿主白细胞DNA干扰。方法：建立Pb ANKA株鼠疟模型;39只小鼠分为A组（新鲜虫血组,n=18）、B组（冻存虫血组,-80℃保存,n=16）及C组（正常对照组,n=5）;应用去白细胞输血器对血样进行过滤纯化,观察比较过滤速度及血样处理（新鲜、冻存）对去除白细胞效果的影响;血细胞计数板和血涂片吉姆萨染色法计数各样本过滤前后白细胞、红细胞、原虫率并观察疟原虫形态和疟原虫密度。滤过后的血液提取DNA,PCR验证白细胞滤过效果。结果：经血细胞计数板计数,3组白细胞平均去除率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;C组红细胞的回收率高于A组,差异具有统计学意义（P〈0.05）;B组则仅见原虫。白细胞过滤后疟原虫形态及密度无明显改变。PCR鉴定PbGAPDH结果 A、B组均为阳性,而小鼠GAPDH均为阴性。结论：建立了白细胞输血器一步法纯化疟原虫的新方法。该方法简便、快速、廉价,是进行疟原虫分子生物学、免疫学等方面的研究不可或缺的实用技术。     

疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究

目的 建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v,)的双重聚合酶链反应(PCR)法。方法 根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f．与P．v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规。结果 从P.f.和P．v．感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1-5个虫／μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P．c,)与P.v．相似,在412bp可见扩增条带。经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f．109例、P.v.l114例、P．f. P.v.9例,阳性率67．4％;比常规镜检的阳性率66．3％稍高,尤以检出P．f． P．v．感染病例高。分别检测人工感染P.f．与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果。结论一次性检测P．f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点。对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值。     

疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠中的免疫特性

目的:探讨恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠(BALB/ca、C57BL/6J、C3H/He、DBA/2J及昆明种)中的免疫原性和免疫反应特性.方法:以ISA720为佐剂,PfCP-2.9抗原皮下免疫5种品系小鼠3次,间隔3周.以ELISA检测免疫血清中特异性抗体的动态变化、IgG抗体亚型及对融合抗原各组分的抗体水平,以间接荧光抗体实验分析免疫血清对恶性疟原虫天然抗原的识别情况.结果:5种品系小鼠均能产生针对PfCP-2.9的免疫应答,3次免疫后血清中特异性抗体滴度达105以上.PfCP-2.9所诱生的免疫血清不但能识别MSP1-19和AMA-1(Ⅲ)两个主要片段,而且能识别恶性疟原虫天然抗原.所诱导的4种IgG抗体亚型中,IgG1和IgG2a是免疫血清中主要的抗体类型.但特异性抗体水平及抗体亚型分布因遗传背景不同而异.结论:融合蛋白PfCP-2.9在5种不同品系小鼠中具有强的免疫原性,其抗体能识别疟原虫天然蛋白.     

肾癌冻融抗原致敏树突状细胞介导的CTL对肾癌786-0细胞株的体外杀伤作用研究

目的：研究肾癌冻融抗原负载树突状细胞（DCs）诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肾癌786-0细胞株的体外杀伤效应;方法：利用人外周血体外经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、人白介素-4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导产生的DCs负载肾癌冻融裂解物后诱导产生特异性CTL,观察杀伤后肿瘤细胞的形态变化,MTT法测定细胞毒性试验,ELISA测定细胞因子的分泌。结果：（1）负载肾癌抗原的DCs能促进T细胞的增殖;（2）诱导产生的特异性CTL对肾癌细胞具有高杀伤率,显著高于非特异性T细胞（P〈0．05）;（3）肾癌冻融抗原能够上调DCs人白介素-12（rhIL-12）的分泌,提高抗肿瘤的作用。（4）杀伤后的肾癌细胞发生明显凋亡。结论：由肾癌冻融抗原致敏的DCs所诱导产生的抗原特异性CTL对肾癌786-0细胞株有明显的杀伤效应,提示DCs瘤苗具有为肾癌患者进行特异性过继免疫治疗的临床应用前景。     

应用ELISA抑制法检测小鼠红细胞内约氏疟原虫抗原

应用ELISA抑制法检测小鼠红细胞内约氏疟原虫抗原的敏感性和特异性进行了观察,微板抗原包被剂量为20μg/ml,用反复感染原虫小鼠20只的感染混合血清作为抑制反应剂,结果表明ELISA抑制法的敏感度随着感染混合血清稀释度增加而提高,当1:500稀释时红细胞内抗原测水平为1虫/10~4BRC;感染小鼠阳性率为95.8％(64/48),正常小鼠阴性率为90.3％(28/31)。     

恶性疟原虫多价重组疫苗的研制及其免疫活性的初步鉴定

为了探讨含Ｔ、Ｂ淋巴细胞双重激活表位的重组复合症疾抗原的免疫原性和保护作用，作者设计合成了编码恶性疟原虫红内期３个保护性抗原位点和２个外源性Ｔ细胞激活位点的复合基因ＨＧＦＣ，并构建了多连体复合基因ＨＧＦＣＡＣ。两种复合基因分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组，并在大肠杆菌中表达出含外源蛋白和β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融合蛋白（分子量分别为６５０００和７７０００），表达量为３５％。表达产物可与小鼠及兔抗恶性疟原虫抗体发生特异性免疫反应。用纯化的融合蛋白免疫家兔制备的免疫血清可特异地识别恶性疟原虫抗原，并对疟原虫体外生长有显著抑制作用。抑制程度与免疫血清浓度及作用时间呈正相关，在２０％浓度下作用７２小时，抑制率可达８２％，并引起疟原虫发育不良和死亡。研究结果说明，制备的恶性疟原虫重组复合抗原具有免疫原性和一定的免疫保护作用，可作为恶性疟疫苗候选物。     

补气生血精胶囊对^60Co辐照致小鼠骨髓抑制干预的实验研究

目的：探讨补气生血精胶囊对^60Co辐照致小鼠骨髓抑制的干预作用。方法：将60只小鼠随机分为空白对照组、模型组、贞芪扶正胶囊组、补气生血精胶囊低剂量组、补气生血精胶囊中剂量组、补气生血精胶囊高剂量组6组。除空白对照组外余组小鼠均以^60Co辐照致骨髓抑制,造模成功后分别灌胃给予相应药物,连续治疗21d后眼球取血,检测各组小鼠外周血网织红细胞、红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、平均血红蛋白浓度、平均血红蛋白量、平均红细胞容积、血红蛋白含量、血细胞比容、骨髓有核细胞计数。结果：补气生血精胶囊对^60Co辐照致骨髓抑制小鼠的骨髓有核细胞、外周血网织红细胞、白细胞、红细胞、血红蛋白含量、血小板、红细胞压积具有显著的升高作用,与贞芪扶正胶囊作用大致相当。结论：补气生血精胶囊对^60Co辐照致小鼠骨髓抑制具有明显的干预作用。     

新鲜血比对方法在血液分析仪中的应用

目的:应用正常人新鲜全血对多台血液分析仪进行比对,使血液分析仪各参数之间具有可比性。方法:选择性能良好、规范化操作的血液分析仪作为参比仪,用该仪器定值的健康人新鲜血校准比对3台血液分析仪(比对仪)。结果:3台比对仪白细胞(WBC)比对前偏倚分别为(-7.32、-4.49、-8.70)%,血小板(PLT)比对前偏倚分别为(-4.75、-17.1、-11.8)%;WBC比对后偏倚分别为(-0.3、2.5、-1.7)%,PLT比对后偏倚分别为(-1.7、-0.7、-1.1)%;WBC、PLT差异有统计学意义(P<0.05),RBC、HGB、HCT、MCV差异无统计学意义(P>0.05),但相关性存在差异,通过比对试验校准仪器后结果一致性良好。结论:该方法能方便、经济地对血液分析进行有效的质量控制。     

全自动血细胞分析仪稀释模式用于脑脊液细胞计数及分类检测的可能性

目的：探讨ABX PENTRA 60血细胞分析仪在脑脊液细胞计数及分类中应用的可能性。方法：采用ABX PENTRA 60血细胞分析仪稀释模式对100份脑脊液标本进行白细胞计数、红细胞计数和白细胞分类分析,并与人工显微镜计数分类法结果进行对比。白细胞分类手工法采用瑞氏染色法,仪器法采用荧光染色和流式细胞术原理进行分类。结果：两种方法对脑脊液标本白细胞计数、红细胞计数、单个核及多个核细胞的绝对计数检测差异无统计学意义（ P>0.05）,并且两种方法具有良好的相关性（白细胞计数r=0.988、红细胞计数r=0.988、单个核细胞绝对计数r=0.953,多个核细胞绝对计数r=0.981）。结论：应用ABX PENTRA 60血细胞分析仪的稀释模式进行脑脊液细胞计数、分类快速准确。全自动血细胞分析仪稀释模式检测脑脊液常规中细胞计数及分类可在临床应用中推广。     

Sysmex UF-100全自动尿沉渣分析仪检测红细胞、白细胞的性能评价

目的评价Sysmex UF-100全自动尿沉渣分析仪检测尿红细胞（RBC）、白细胞（WBC）的性能。方法检测UF-100法的精密度,线性,携带污染率,并选择2~100/μl、100~500/μl、〉500/μl三个浓度范围的RBC、WBC标本各35例,分别用牛鲍氏细胞计数板和UF-100法进行计数并进行比对评价。结果 RBC和WBC精密度分别为3.8%和5.6%、线性相关系数（r）分别为0.997和0.999、携带污染率分别为0.14%和0.17%;UF-100与牛鲍氏计数板计数比较：RBC在〈500/μl浓度范围内无显著性差异（P〉0.05）,〉500/μl的浓度范围有显著性差异（P〈0.05）,WBC在2-100/μl浓度范围内无显著性差异（P〉0.05,）〉100/μl的浓度范围有显著性差异（P〈0.05）。结论 UF-100全自动尿沉渣分析仪检测RBC、WBC的精密度高,线性好,携带污染低率,但不能完全取代显微镜检查,结合尿干化学以及镜检联合过筛,可大大提高检测效率。     

动物疟原虫与人疟原虫的交叉反应抗原

目的分析5种疟原虫（间日疟原虫、恶性疟原虫,食蟹猴疟原虫、伯氏症原虫,约氏疟原虫）中,可被间日疟、恶性疟病人血清识别的交及反应抗原。方法用50％、60％Percoll不连续梯度分离疟原虫感染红细胞,20mmolPBS被红细胞后,收集红内期原虫,以1％NP—40提取可溶性抗原。各种抗原经SDS—PAGE电泳后,转移至硝酸纤维膜上,分别用间日疟、恶性疾病人血清进行免疫识别。结果3神动物疟原虫红内期抗原中有多条蛋白区带可被间日疟或恶性疟病人血清识别。其中合蟹报疟原虫有14条蛋白带被间日疟病人血清识别,伯氏疟原虫有16条蛋白区带被恶性疟病人血清识别,分别多于其它疟原虫。间日疟病人血清可识别5种疟原虫共有的72kD蛋白,而恶性疟病人血清不识别该蛋白。结论人疟原虫和动物疟原虫之间有一系列支又反应抗原。会压滤疟原虫与间日疟原虫,伯氏疟原虫与恶性疟原虫之间抗原相似程度高于其它疟原虫。72kD．蛋白在间日疟无疾学诊断方面可能有实用价值。     

利用血球仪对肉眼全程血尿进行定位诊断

目的：能否采用血球仪对肉眼全程血尿进行定位诊断。方法：对肉眼全程血尿的病人同时采集其血和尿用血球仪进行平行测定,通过比较同一病人的血和血尿的RDW、MCV、RBC/WBC的比值、RBC直方图的变化来判断其血尿的来源。结果：肾小球性血尿与非肾小球疾病血尿具有显著的差异（P〈0.05）。结论：可采用血球仪对肉眼全程血尿进行定位诊断,尤其是肾小球性血尿。     

参芪益髓颗粒对抗环磷酰胺导致模型小鼠骨髓抑制作用研究

目的：观察参芪益髓颗粒对环磷酰胺（CTX）造模小鼠血象及骨髓象的影响。方法：通过腹腔注射环磷酰胺造模,观察本品对小鼠WBC、RBC、PLT、Hgb及骨髓增生情况的影响。结果：经参芪益髓颗粒大剂量治疗后,对WBC、PLT有明显的提升作用,与模型组比较,具有统计学意义（P〈0．05）;参芪益髓颗粒中剂量对RBC有提升作用,与模型组比较,具有统计学意义（P〈0．05）。参芪益髓颗粒大剂量具有对抗CTX导致小鼠骨髓抑制效果,与模型组比较,具有统计学意义（P〈0．01）;参芪益髓颗粒大剂量能够明显升高胸腺、脾脏指数,与模型组比较,具有统计学意义（P〈0．01）;参芪益髓颗粒中剂量对胸腺指数有提升作用,与模型组比较,具有统计学意义（P〈0．01）。结论：参芪益髓颗粒对CTX导致的骨髓抑制及其外周血细胞减少有一定的对抗作用,并能够提高免疫器官指数。     

部分脾动脉栓塞术治疗脾功能亢进对免疫功能的影响

目的：探讨部分性脾栓塞术（Partial splenic embolization,PSE）治疗脾功能亢进对患者免疫功能的影响。方法：选取确诊为肝癌合并脾亢患者36例,对其施行PSE治疗,观察术前及术后外周血细胞计数（RBC、WBC、PLT）细胞免疫指标（CD3、CD4、CD8、CD4/CD8）以及体液免疫指标（IgM、IgG、IgA）的变化情况。结果：血细胞计数：术后WBC、PLT明显升高,与术前比较有显著性差异（P〈0.05）,RBC术后与术前比较无明显差异（P〉0.05）。②细胞免疫指标：术后CD3细胞比例与术前比较,无显著差异（P〉0.05）。术后CD4、CD8、CD4/CD8与术前比较有显著性差异（P〈0.05）。③体液免疫指标：术后IgG、IgM与术前比较均无显著性差异（P〉0.05）,术后28d IgA与术前比较明显上升,有显著性差异（P〈0.05）。结论：对肝癌合并脾亢患者实施PSE治疗,不仅血细胞数值有不同程度升高,达到了治疗脾亢的目的,而且保留了部分脾组织来维持机体的免疫平衡,从而使脾亢患者免疫功能得到一定改善,有利于肝癌患者进一步治疗。     

肝癌切除联合全脾切除治疗原发性肝癌合并脾功能亢进的疗效分析

目的：探讨临床治疗原发性肝癌合并脾功能亢进的有效方案。方法：回顾分析163例原发性肝癌合并脾功能亢进患者的临床资料,根据治疗方案将上述患者分为观察组（n=83）与对照组（n=80）,观察组接受肝癌切除术联合全脾切除术治疗,对照组仅接受肝癌切除术治疗。结果：（1）两组患者术中出血量、输血量比较差异无统计学意义（P〉0．05）。（2）术前,两组患者红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血小板（PLT）比较差异无统计学意义（P〉0．05）;术后2个月,观察组WBC、PLT显著高于对照组（P〈0．05）,两组患者RBC比较差异无统计学意义（P〉0．05）。（3）术前,两组患者CD4、CD8、CD4／CD8比较差异无统计学意义（P〉0．05）;术后2个月,观察组C现、CD4／CD8显著高于对照组（P〈0．05）,CD。显著低于对照组（P〈O．05）。（4）两组患者并发症发生率、病死率比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：肝癌切除术联合全脾切除术是治疗原发性肝癌合并脾功能亢进的有效方案,该方案值得临床应用与推广。     

2：1球浆比换血治疗新生儿高胆红素血症前后血常规的变化

目的观察2：1球浆比换血疗法对新生儿高胆红素血症患者血常规影响规律。方法回顾2005-01～2009-04我科因高胆红素血症采用不同球浆比换血治疗的新生儿76例,观察组44例用2：1球浆比换血,对照组32例采用1：1球浆比换血;检测换血前后胆红素（Bil）、白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HB）、血小板（PLT）等指标。结果观察组换血后RBC、Hb均升高,对照组换血后RBC、Hb下降,两组WBC、PLT明显下降。结论2：1球浆比换血治疗重症胆红素血症可明显降低血胆红素水平及纠正贫血;但换血后易出现一过性WBC和PLT降低;提示换血后应预防感染、出血的发生,及时采取相应治疗措施,避免出现严重换血后并发症。