瘢痕疙瘩Fas基因外显子1—6基因突变的检测

目的 检测Fas基因外显子1-6，探讨Fas凋亡基因在瘢痕疙瘩组织中的结构异常与临床病理的关系。方法 采用PCR银染技术，检测15例瘢痕疙瘩标本Fas外显子1-6的基因结构。结果 所检测的15例瘢痕疙瘩，2例Fas基因外显子6出现电泳条带增多，测序证实存在基因突变，为插入突变与点突变的混合型突变，且经同源性分析为一新突变位点。结论 少数瘢痕疙瘩病例Fas凋亡基因编码的蛋白无功能可能与其编码跨膜区的基因结构异常有关。     

瘢痕疙瘩Fas基因"死亡域"杂合性丢失的研究

目的　探讨Fas抑癌基因在瘢痕疙瘩组织中的缺失及与临床病理的关系。方法　采用PCR -SSCP银染技术 ,检测 1 5例瘢痕疙瘩标本Fas基因“死亡域”外显子 7～ 9的基因结构。结果　 1 5例瘢痕疙瘩 1 0 0 %有Fas基因外显子 8的杂合丢失。 2 0 %有外显子 9等位基因条带增多 ,提示存在基因突变。结论　瘢痕疙瘩Fas基因外显子 8、9区段的基因结构异常与其编码的蛋白无功能关系密切。     

Fas基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞抗Fas单克隆抗体(mAb)诱导的凋亡,是否能通过正常Fas基因转染使凋亡率得以提高。方法利用分子克隆技术将人Fas cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入瘢痕疙瘩成纤维细胞,Fas mAb诱导凋亡;通过琼脂糖凝胶电泳、HE染色和流式细胞仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况。结果转基因的瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas mAb作用后,在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂;琼脂糖凝胶电泳显现特征性的“梯状”带;流式细胞仪检测凋亡率明显增加。对照组未见上述结果。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas诱导的凋亡异常,是由于Fas凋亡通道的“上游事件”无功能Fas蛋白造成,与通道下游无关。瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常可能是Fas基因突变引起,其与瘢痕疙瘩形成有密切关系。     

Fas基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的 探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞抗Fas单克隆抗体(mAb)诱导的凋亡，是否能通过正常Fas基因转染使凋亡率得以提高。方法利用分子克隆技术将人FaseDNA插入真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点之间，以脂质体介导法将目的基因导人瘢痕疙瘩成纤维细胞，FasmAb诱导凋亡；通过琼脂糖凝胶电泳、HE染色和流式细胞仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况。结果 转基因的瘢痕疙瘩成纤维细胞经FasmAb作用后，在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂；琼脂糖凝胶电泳显现特征性的“梯状”带；流式细胞仪检测凋亡率明显增加。对照组未见上述结果。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas诱导的凋亡异常，是由于Fas凋亡通道的“上游事件”无功能Fas蛋白造成，与通道下游无关。瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常可能是Fas基因突变引起．其与瘢痕疙瘩形成有密切关系。     

病理性瘢痕成纤维细胞Fas介导的死亡信号传导研究Ⅰ:Ca2+在Fas介导的死亡通道中的作用

目的研究和比较增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas单抗(FasMcab)诱导产生凋亡的能力,同时探讨Ca2+在其相应死亡信号通道中的作用.方法取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各6例,通过细胞培养6～8代后,以FasMcab为处理因素作用于增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h.应用透射电镜证实凋亡现象的发生,流式细胞仪检测并比较两者凋亡率.同时,应用粘附式细胞仪检测FasMcab作用下胞内Ca2+的变化.结果增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度以上的FasMcab作用下,发生明显的凋亡现象,其凋亡率随着单抗浓度的增高不断增高.瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下,均未发生明显凋亡,且各组间差异无显著意义.在FasMcab作用下,增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+显著增高而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无变化.结论 Fas介导凋亡的异常可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖-凋亡调控异常的细胞生物学机制之一,胞内Ca2+产生的障碍可能与其Fas介导凋亡的异常密切相关.     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变

目的：分析瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变高发区第4～8外显子的突变及其意义。方法：取手术切除的瘢痕疙瘩和非增生瘢痕各12例，分别采用相应正常皮肤对照，体外培养成纤维细胞，采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测p53基因的突变情况。结果：12例瘢痕疙瘩成纤维细胞标本中有9例p53基因外显子4、5、6、7出现突变，非增生瘢痕标本和正常皮肤标本均未检出突变。结论：p53基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

病理性瘢痕成纤维细胞Fas 受体及Bcl-2 蛋白的表达

目的 研究病理性瘢痕成纤维细胞Fas受体及凋亡相关蛋白bcl-2的表达，探讨增生性瘢痕成纤维细胞对Fas介导凋亡的抑制作用。方法 取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各6例，通过细胞培养6～10代后，应用流式细胞仪、粘附式细胞仪分别检测增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas及Bcl-2蛋白的表达。结果 增生性瘢痕成纤维细胞Fas受体呈低表达，而瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas受体强表达。凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞内均呈低表达，两者无显著差异。结论 正常情况下，Fas Mcab能诱导Fas受体表达阳性的细胞凋亡，瘢痕疙瘩成纤维细胞却表现为Fas受体高表达而不凋亡，Bcl-2低表达。实验结果表明，瘢痕疙瘩成纤维细胞不凋亡现象并非Fas受体缺陷或外源性抑制所致，提示瘢痕疙瘩成纤维细胞膜表面高表达的Fas受体可能处于无功能状态。     

细菌内重组法高效制备含人Fas基因的重组体腺病毒

目的 制备含人Fas基因的重组腺病毒,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白,并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法 应用高效细菌内同源重组系统Ad-Easy,自PMD-T-Fas质粒中切取Fas基因,将Fas基因克隆到穿梭质粒,在BJ5183细菌内重组,最后在293细胞中构建携带Fas基因的重组腺病毒．将腺病毒感染瘢痕疙瘩成纤维细胞,检测转染前后Fas蛋白的表达的变化及蛋白的功能。结果 通过Ad-Easy系统成功构建高滴度的携带Fas基因的重组腺病毒Ad-Fas,Ad-Fas感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后能稳定提高Fas蛋白的表达,并且在Fas单克隆抗体的诱导下可以发现明显的细胞凋亡。结论 (1)构建的重组腺病毒Ad-Fas在体外实验中能有效地提高瘢痕疙瘩成纤维细胞蛋白的表达,并且可以重建原来阻断的死亡信号传导通道。(2)再次证实了Fas基因突变与瘢痕疙瘩之间的联系,为瘢痕疙瘩基因治疗开辟了一条新途径。     

瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞的增殖-凋亡调控及相关蛋白的表达

目的 观察Fas介导下瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞增殖与凋亡的特点,探讨瘢痕疙瘩周边和中央部生长差异的细胞生物学机制。方法 应用透射电镜及流式细胞仪技术,观察了FasMcAb诱导下瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞的凋亡情况,并检测了不同来源成纤维细胞Fas受体、Bcl-2蛋白及p53蛋白的表达情况。结果 (1) 瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞在各种浓度梯度的FasMcAb作用下均未见明显的凋亡现象,Fas受体均呈高表达;(2)Bcl-2蛋白在瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞内均呈低表达,但中央部表达强度显著高于周边部(P<0.05);(3) p53蛋白在瘢痕疙瘩周边呈低表达,而在中央部呈高表达。结论 p53蛋白可能是导致瘢痕疙瘩不同部位呈现不同生长特性的最重要的增殖调控蛋白。     

重症肌无力患者胸腺Fas基因突变及氨基酸变异分析

目的：分析重症肌无力(MG)患者胸腺Fas基因突变及其编码蛋白质的氨基酸变异,探讨Fas分子在重症肌无力发生中的作用。方法：提取8例MG患者胸腺总RNA,经RT-PCR法扩增mFas基因全长,克隆后用荧光标记法进行基因测序,用DNASIS、OMIGA软件与Genbank中Fas序列进行同源性比较和分析。结果：8例患者胸腺组织6例出现Fas基因突变,突变率为75％(6／8),其中5例发生2个以上位点突变,只有1个位点突变的1例(12．5％,1／8);突变类型为164位A→G,相应的氨基酸变异为55位Asp→Gly,96位His-Arg,192位Arg→Lys和251位Lys→Arg。Fas基因高度保守,患者之间同源性为99．6％～100％,Fas分子同源性为98．7％～99．7％。结论：重症肌无力患者胸腺组织中存在Fas基因突变和Fas分子结构变异,可能与患者胸腺异常有关。     

Fas基因在卵巢癌细胞凋亡中的作用

目的 :检测Fas基因表达并观察转染Fas基因对卵巢癌细胞凋亡的影响 ,探讨其在卵巢癌发生、发展中的作用。方法 :经流式细胞术、RT PCR方法检测 6种卵巢癌细胞Fas的表达水平。构建pcDNA3 Fas真核表达载体 ,经脂质体转染细胞 ,通过流式细胞仪检测Fas基因表达变化。应用PI染色经流式细胞术检测观察转染Fas基因对3AO细胞凋亡的影响。结果 :6种卵巢癌细胞均表达Fas,均属中低表达。经 pcDNA3 Fas真核表达载体转染的卵巢癌细胞Fas基因表达及对Fas单抗诱导凋亡的敏感性均有不同程度提高。结论 :Fas基因低表达及对Fas介导凋亡的抵抗可能与卵巢癌发生、发展有关 ;转染Fas基因可提高Fas基因表达 ,可促进卵巢癌细胞凋亡     

5-氟尿嘧啶对大肠癌Fas蛋白表达的调控作用

目的：探讨5-氟尿嘧啶（5-Fu）对大肠癌细胞Fas蛋白表达水平的调控作用。方法：采用流式细胞术检测了培养的9株细胞（6株为大肠癌细胞）Fas蛋白的表达情况,并观察了5-Fu（260mol/L）处理后大肠癌细胞Fas蛋白表达水平的变化。结果：在检测的6株人大肠癌细胞中,有5株肿瘤细胞表面表达Fas蛋白;用临床浓度的5-Fu处理后,HCT-116和WiDr的Fas蛋白的表达水平显上调。结论：5-Fu可上调肿瘤细胞Fas表达水平,由此可能增加其对Fas介导的机体免疫监视作用的敏感性。     

Fas在食管癌中的表达一种免疫逃逸机制

目的：研究Ｆａｓ抗原在食管癌细胞中的表达情况及其与食管癌发生和预后的关系。方法：应用免疫组化ＳＰ法检测了４０例食管癌原发灶、１７例淋巴结转移灶和１０例正常食管粘膜组织中Ｆａｓ的表达情况。结果：１０例正常食管粘膜中均检测到了Ｆａｓ的表达,而４０例原发性食管癌中仅１１例（２７．５％）可见Ｆａｓ的表达,与正常粘膜相比差异有显著性（Ｐ＜０．０５）;６例高分化鳞癌均检测到Ｆａｓ的表达,３１例中分化鳞癌仅７例Ｆａｓ表达阳性,两组间差异有显著性（Ｐ＜０．０５）,而３例低分化鳞癌中均未检测到Ｆａｓ的表达,提示Ｆａｓ的表达与食管癌细胞的分化程度有关。１７例淋巴结转移灶癌细胞中均未检测到Ｆａｓ的表达。提示Ｆａｓ的表达与肿瘤的转移有一定的关系。结论：食管癌细胞通过Ｆａｓ的下调表达,逃避机体的免疫监视,在肿瘤的发生、发展及转移中发挥着重要的作用。     

肝细胞癌生物学行为的研究

目的 :探讨p5 3、nm2 3 -H1、CD44v6、P gp、Fas、FasL和MMPs基因表达与肝细胞癌 (HCC)生物学行为的关系。方法 :用酶谱分析和免疫组化技术对HCC组织中p5 3、nm2 3 -H1、CD44v6、P gp、Fas、FasL和MMPs基因表达水平进行了检测。结果 :HCC组织中p5 3、nm2 3 -H1、CD44v6、P gp、Fas、FasL和MMPs基因表达水平与正常组织相比 ,存在显著性差异 ;同时 ,转移组与无转移组也存在显著性差异。结论 :结果提示p5 3、nm2 3 -H1、CD44v6、P gp、Fas、FasL和MMPs基因表达水平与HCC的生物学行为有关     

汉族与哈萨克族腰椎间盘组织中细胞因子的表达及其意义

目的观察促炎因子白介素-6（IL-6）、抗炎因子白介素-10（IL-10）和Fas蛋白在汉族与哈萨克族椎间盘组织内的表达,并探讨其意义。方法收集30例单节段椎间盘突出症患者及10例非腰椎源性死亡的新鲜尸体的腰椎间盘组织,术前患者临床症状均予JOA评定,术后应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定椎间盘组织中IL-6、IL-10和Fas蛋白的含量,并进行免疫组化染色。结果退变腰椎间盘组织中IL-6、IL-10含量较对照组高（P〈0.01）,而Fas蛋白的含量两组间差异无统计学意义。哈萨克族患者IL-6的表达水平及JOA评分与汉族相比有统计学意义。30例突出腰椎间盘组织中IL-6表达阳性有28例,IL-10表达阳性有27例,Fas蛋白表达阳性有25例,其中24例为三种细胞因子均表达阳性。对照组10例中椎间盘组织3例有Fas蛋白表达阳性。结论细胞因子IL-6、IL-10的表达增高为椎间盘退变的重要原因,年龄因素在细胞凋亡中的作用不容忽视,Fas蛋白可引起细胞凋亡,加重退变;椎间盘退变可能有种族及遗传这方面差异,但有待于进一步证实。     

Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

镜检大肠癌黏膜Fas,FasL的表达与肿瘤浸润转移

目的 探讨Fas和FasL在镜检大肠癌黏膜的表达与肿瘤浸润转移的关系。方法 免疫组化（SP)法分别对51例大肠癌和42例正常大肠黏膜的镜检组织进行了Fas,FasL表达的检测。结果 42例正常大肠黏膜为Fas,FasL阳性,阳性率100％。大肠癌黏膜Fas,FasL阳性率分别为35％（18／51）和39％（20／51）。大肠癌黏膜Fas,FasL表达阳性率明显低于正常大肠黏膜（P＜0．01）。大肠癌黏膜Fas,FasL表达与局部浸润深度、淋巴结转移无关（P＞0．05）。6例肝转移者,其镜检原发灶黏膜Fas均为阴性。镜检癌黏膜同时表达Fas,FasL阳性率为12％（6／51）,Fas(-)FasL( )癌黏膜比Fas( )FasL(-)更易侵及浆膜或浆膜外（P＜0．05）。结论 Fas,FasL的表达异常与大肠癌的发生有关。Fas抗原缺失可能与大肠癌肝转移有关。     

局灶性脑缺血/再灌注后Fas、TNF-α在大鼠脑组织中的表达

目的 :通过观察局灶性脑缺血 /再灌注后大鼠脑组织中 Fas、肿瘤坏死因子 - α( TNF- α)的动态变化及细胞凋亡的情况 ,探讨脑缺血后 Fas、肿瘤坏死因子 - α与细胞凋亡的关系。方法 :采用大鼠大脑中动脉线栓动物模型 ,应用免疫组化及 TUNEL方法检测 Fas、TNF- α的动态变化和细胞凋亡情况并进行图像分析。结果 :局灶性脑缺血再灌注后 Fas过度表达 ,且在缺血再灌注后 6h达高峰 ,于 2 4 h开始下降 ;TNF- α的表达于再灌注 3h已有明显升高 ,2 4 h达到高峰 ,其后逐渐下降 ;细胞凋亡于再灌注 6h开始增加 ,2 4 h达到高峰 ,36h略有下降 ,且与 Fas及 TNF- α表达范围基本一致。结论 :Fas、TNF- α在局灶性脑缺血 /再灌注损伤中表达增加 ,介导细胞凋亡。它们在局灶性脑缺血再灌注损伤的病理过程中起到重要作用。