结核分枝杆菌PZase-GST融合蛋白表达与鉴定

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌pncA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核杆菌pncA基因,并构建到pGEX4T-1上。重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果与预期大小相似,PCR扩增出大约600 bp的pncA基因,并且吡嗪酰胺酶(PZase)在诱导后得以高效表达。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-pncA,并经诱导后高效表达了PZase融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺(PZA)耐药性奠定了基础。     

布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定

[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序，并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序，目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接。构建重组质粒PGEX-4T-1／bp26，在大肠杆菌中表达该蛋白。用western—blot鉴定重组表达的GST—bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1／bp26原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因，布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达，它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

结核分枝杆菌85B基因原核表达及间接ELISA方法的建立

目的原核表达结核分枝杆菌85B融合蛋白,建立该抗原对结核病患者诊断的ELISA方法。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中进行PCR扩增85B基因并构建至表达载体p GEX4T-1上。原核表达GST-85B融合蛋白,并通过包涵体对其进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化得到可溶性的目的蛋白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白,ELISA检测表达融合蛋白的抗原性。结果扩增出了结核分枝杆菌85B基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体p GEX4T-85B,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。将包涵体变性、复性后用GST亲和层析纯化,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-85B融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。进行质粒的酶切鉴定和序列分析;对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western-blot鉴定融合蛋白。结果正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50%。该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应。结论成功构建了GST-PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

人卵GST-ZP3融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性的检测

目的:在大肠杆菌中表达人卵透明带3(Human zona pellucida3,HuZP3)蛋白并对其进行纯化。方法:将HuZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和序列分析后,用重组质粒转化E.coli BL21,经IPTG诱导产生GST-HuZP3融合蛋白并通过Glutathione Sepharose 4B纯化。以纯化的融合蛋白免疫纯系Balb/C小鼠制备抗血清。抗血清的效价采用ELISA检测。结果:成功地构建GST-HuZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST-HuZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价抗GST-HuZP3抗血清,且该抗血清可识别大肠杆菌表达的重组ZP3。结论:获得高表达的GST-HuZP3融合蛋白并证实其具有良好的免疫原性,可作为抗原研制开发检测不孕妇女体内是否存在抗自身ZP3抗体的诊断试剂盒。     

结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达与纯化及免疫原性检测

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核分枝杆菌esat-6基因,并构建到pGEX4T-1上,重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌esat-6基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,并经诱导后高效表达了ESAT-6融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

CPSIT_0942在鹦鹉热嗜衣原体感染细胞中的定位和特性研究

目的确定假定蛋白CPSIT_0942在鹦鹉热嗜衣原体(Cps)感染细胞中的定位及特征。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增Cps cpsit_0942基因,克隆入p GEX-6p-1原核表达载体,转化至大肠杆菌E.coli BL21,IPTG诱导表达融合蛋白GST-CPSIT_0942,纯化后免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光(indirect immunoinfluscent assay,IFA)检测CPSIT_0942蛋白在细胞内的定位,ELISA检测其在体外诱导THP-1细胞表达炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的情况。结果 CPSIT_0942蛋白能得到可溶性表达蛋白,可诱导机体产生抗体,IFA主要定位于Cps包涵体,该蛋白体外能诱导THP-1细胞产生炎症因子,在4μg/ml的浓度时,GST-CPSIT_0942诱导产生的IL-1β、IL-6和TNF-α达到最大值,且当以4μg/ml蛋白刺激细胞12 h时,IL-1β、IL-6和TNF-α达到高峰。结论 CPSIT_0942主要定位于包涵体上,能诱导THP-1细胞产生炎症因子,为阐明衣原体致病机制提供了重要的实验依据。     

T-2毒素、DON诱导人软骨细胞差异表达基因与大骨节病的关系分析

目的探讨T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导人软骨细胞差异表达基因与大骨节病(KBD)之间的关系, 寻找KBD的潜在分子标志物。方法采用基因表达谱芯片对T-2毒素(0.01 μg/ml)、DON(1.0 μg/ml)诱导正常人软骨细胞的差异表达基因进行分析, 比较其与KBD软骨细胞差异表达基因的异同;并对各组差异表达基因进行KEGG通路富集分析;进一步比较分析T-2毒素、DON诱导人软骨细胞后KBD易感基因的表达情况。结果基因表达谱芯片分析结果显示, T-2毒素、DON诱导人软骨细胞与正常对照细胞比较分别有882(上调基因349个、下调基因533个)和2 118个差异表达基因(上调基因1 124个、下调基因994个);与KBD软骨细胞差异表达基因比较, 表达趋势一致的基因包括B细胞易位基因1(BTG1)、G蛋白信号调节蛋白5(RGS5)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)和衰老关键蛋白1(FBLN1), 相同的KEGG通路包括p53、细胞外基质受体相互作用和磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路。T-2毒素、DON诱导人软骨细胞均可引起KBD易感基因生长分化因子...     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

弓形虫微线体蛋白8胞质尾蛋白的表达及纯化

目的 制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8t)蛋白片段.方法 以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8t基因片段,构建MIC8t/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8t融合蛋白;亲和层析纯化融合蛋白.结果 构建了MIC8t原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8t融合蛋白.结论 在体外制备并纯化了GST-MIC8t融合蛋白,为后续研究MIC8t的功能奠定了基础.     

人细小病毒B19VP1基因片段原核表达载体的构建及其表达

目的　克隆人细小病毒B19　VP1基因片段,构建其重组克隆载体和表达载体,并诱导表达。方法　利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,将B19病毒VP1基因片段扩增后,构建pGEM-T-easy克隆载体;经PCR筛选后,亚克隆于pGEX-4T-1表达载体中,并转化至BL21感受态菌;经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定。结果　扩增出一条约 801bp的基因片段,PCR鉴定结果的与预期结果一致。经IPTG诱导,VP1融合蛋白在大肠杆菌中得到成功表达,PAGE上出现相对分子量约为 54KD的一条新生蛋白带,经蛋白印迹验证为表达蛋白B19VP1。薄层扫描现示,表达产物占菌体总蛋白的 27. 4%。结论　获得人细小病毒B19VP1基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及B19疫苗有重要意义。     

重组多价人精子表位肽的原核表达及其条件优化

目的构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,优化其在大肠杆菌中的表达条件。方法用化学合成法合成多价人精子表位肽基因。该基因经PCR扩增,BamHI和XhoI双酶切后,克隆至GST融合表达载体PGEX-4T-1获得重组质粒。将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,观察在摇瓶发酵条件下改变培养基组成、诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度和诱导时间等条件对GST-多价人精子表位肽融合蛋白表达量的影响。结果构建了重组多价人精子表位肽原核表达载体。在摇瓶实验中,优化的表达条件为:TB培养基,诱导温度37℃,在菌体对数生长的中后期进行诱导,IPTG诱导终浓度0.05 mmol/L,诱导时间5 h。优化后GST-多价人精子表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2%,且主要以可溶形式表达。结论成功构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,重组表达载体在E.coli BL21(DE3)内主要表达可溶形式的GST-多价人精子表位肽融合蛋白,在优化条件下可获得较高的表达量。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白G表达载体的构建及鉴定

[目的]构建gG-1强抗原决定簇集中区对应基因的重组原核表达载体,并对其进行鉴定。[方法]利用DNAstar软件分析gG-1强抗原决定簇的集中区,PCR扩增相应基因片段,将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/gG-1,并对其进行双酶切和DNA测序鉴定。[结果]成功构建了pGEX-4T-1/gG-1重组原核表达载体,且目的基因片段与GenBank中已公布序列一致性较高,阅读框架正确。[结论]pGEX-4T-1/gG-1重组原核表达载体的成功构建,为研制HSV-1型特异性基因工程诊断试剂奠定了基础。     

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450-1－微线体蛋白1（MIC1）原核表达重组质粒,对MICI基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MICI的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG－1、JM109（DE3）和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基－β－D－硫代半乳糖诱导下,用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70000的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pW450-1-MCI1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础。