单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究

目的：构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白D重组质粒DNA疫苗,初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果,为HSV-1新型疫苗奠定基础。方法：用PCR的方法从HSV－1病毒基因组中扩增糖蛋白D（glycoprotein D,gD)基因,利用基因重组技术构建重组质粒;将重组质粒体外转染真核细胞COS－7,Western blotting检测表达产物;于BALB／C小鼠后腿胫前肌注射免疫,0、2周名免疫1次,100μg/次。初次免疫后0,2,4,6周眼眶采血,ELISA间接法检测抗体。结果：重组质粒酶切出相应大小片段,经测序证实为HSV－1gD序列。Western blotting证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后,产生特异性抗体,抗体滴度1：2000。结论：HSV-1gD重组质粒DNA有可能作为HSV－1的DNA疫苗,用于防治HSV－1感染及其相关疾病。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型DNA疫苗的构建

目的 构建表达单纯疱疹病毒1型糖蛋白D的DNA疫苗。方法 采用聚合酶链式反应（PCR），从HSV-1基因组中扩增出gD基因，插入中间载体pGEM-T，然后克隆入真核表达载体pcDNA3.1，构建重组质粒pLy-D，经部分测序和限制性内切酶分析证实，将pLy-D转染Cos-7细胞，并肌肉接种ICR小鼠。用免疫组化和ELISA方法分别检测gD蛋白表达及小鼠血清中的特异性抗体。结果 转染的Cos-7细胞中有gD蛋白的表达；经三次肌肉免疫接种的小鼠血清中有特异性HSV-1抗体产生，结论 本研究构建的重组质粒pLy-D能够在哺乳动物细胞中表达目的蛋白，免疫接种后可以诱导动物产生免疫反应。     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究

目的构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白Ｄ重组质粒ＤＮＡ疫苗，初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果，为研制ＨＳＶ－１新型疫苗奠定基础。方法用ＰＣＲ的方法从ＨＳＶ－１病毒基因组中扩增糖蛋白Ｄ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ，ｇＤ）基因，利用基因重组技术构建重组质粒；将重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测表达产物；于ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后腿胫前肌注射免疫，０、２周各免疫１次，１００μｇ／次。初次免疫后０、２、４、６周眼眶采血，ＥＬＩＳＡ间接法检测抗体。结果重组质粒酶切出相应大小片段，经测序证实为ＨＳＶ－１ｇＤ序列。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后，产生特异性抗体，抗体滴度１∶２０００。结论ＨＳＶ－１ｇＤ重组质粒ＤＮＡ有可能作为ＨＳＶ－１的ＤＮＡ疫苗，用于防治ＨＳＶ－１感染及其相关疾病。关键词单纯疱疹病毒角膜炎ＤＮＡ疫苗糖蛋白Ｄ     

单纯疱疹病毒I型DNA疫苗的构建(英文)

目的　构建表达单纯疱疹病毒 1型糖蛋白D的DNA疫苗。方法　采用聚合酶链式反应 (PCR) ,从HSV 1基因组中扩增出 gD基因 ,插入中间载体pGEM T ,然后克隆入真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建重组质粒 pLy D .经部分测序和限制性内切酶分析证实。将pLy D转染Cos 7细胞 ,并肌肉接种ICR小鼠。用免疫组化和ELISA方法分别检测gD蛋白表达及小鼠血清中的特异性抗体。结果　转染的Cos 7细胞中有 gD蛋白的表达 ;经三次肌肉免疫接种的小鼠血清中有特异性HSV 1抗体产生。结论　本研究构建的重组质粒 pLy D能够在哺乳动物细胞中表达目的蛋白 ,免疫接种后可以诱导动物产生免疫反应     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白B基因疫苗的构建

目的：构建用于治疗和预防单纯疱疹病毒性角膜炎的核酸疫苗,探讨单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(HSV-1gpB)基因作为基因疫苗的可能性。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列(39 bp)的基因片断（2 673 bp）,定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中,构建出重组真核表达质粒pcDNA-gpB,并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。 结果：双酶切重组质粒pcDNA-gpB,电泳可见两条带,分别为目的基因（2 700 bp）和线性质粒pcDNA3（5 400 bp）; 以重组质粒pcDNA-gpB为模板进行PCR扩增,在2 700 bp位置扩增出特异的产物;测序结果表明,克隆基因插入方向正确,与GenBank中登录的HSV-1 F株gpB基因序列比较,同源性达99.5%。 结论：利用PCR技术从HSV-1 SM44株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列（39 bp）的基因片断（2 673 bp）, 成功地构建了HSV-1基因疫苗pcDNA-gpB。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步免疫观察

目的 构建用于防治单纯疱疹的核酸疫苗并观察其免疫效果。方法 用PCR反应,从HSV-F株基因组DNA中扩增出gD蛋白的全部编码序列,将其插入pcDNA3.1（ ）的PCMV下游,构建HSV gD核酸疫苗,并用酶切分析和测序鉴定;通过中和试验、ELISA方法和攻击试验检测是用pLy-D三次肌肉接种小鼠的免疫效果。结果 经鉴定证实了HSV gD核酸疫苗pLy-D的构建,实验小鼠产生了对HSV-1特异性的抗体（抗体滴度：ELISA法1：203,中和试验法1：37）。并经受了HSY-1病毒的攻击（存活率：70%）。结论 成功构建出了HSV gD核酸疫苗pLy-D,用其接种小鼠可以诱导产生特异性免疫反应,并具有良好的保护作用。     

单纯疱疹病毒DNA疫苗研究进展

人类单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）感染在全世界都非常普遍，它不仅产生原发性感染还存在潜伏性感染和复发性感染。HSV分为HSV-1和HSV-2两型，两者的感染都严重影响了人类的健康。目前对HSV感染的治疗方法有多种，但效果较差，并且对HSV的潜伏感染无治疗作用，现在迫切需要开发研制能够有效控制疾病的HSV疫苗。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法:应用PCR方法从HSV-Ⅰ基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD.结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%.结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒.     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。     

单纯疱疹病毒DNA疫苗的初步研究

目的：探讨含有HSV—2糖蛋白D全基因序列的重组质粒作为DNA疫苗的可能性。方法：采用PCR方法获得HSV—2gD片段，构建含HSV—gD片段的重组质粒pcDNA3-gD。重组质效作为DNA疫苗免疫小鼠，观察其对小鼠的免疫效果及保护作用。结果：重组质粒pcDNA3-gD免疫小鼠后产生特异性抗体；可保护小鼠免受HSV—2的致死性攻击(存活率达75％)。结论：重组质粒pcDNA3-gD能诱导小鼠产生特异性免疫反应，可以作为HSV的候选DNA疫苗。     

Comparative study on the immunogenicity between Hsp70 DNA vaccine and Hsp65 DNA vaccine in humanMycobacterium tuberculosis

Summary The BALB/c mice were immunized with Hsp70 DNA and Hsp65 DNA vaccines in humanMycobacterium tuberculosis. Eight weeks after immunization, the eyeballs were removed, blood and spleen taken, and intraperitoneal macrophages were harvested. The lymphocytic stimulating index (SI) was used to measure the cellular proliferating ability and NO release to measure the phagocytic activity of the macrophages. With ELISA kit, the levels of interleukin-2 (IL-2) and interferon-γ (IFN-γ) in serum and the splenic lymphocytic cultured supernatant were detected. The results showed that after the mice were immunized with 100 μg/mouse of Hsp70 DNA vaccine intramuscularly, the splenic lymphocytic proliferating ability in the mice was significantly increased as compared with that in the control group, vector group and Hsp65 DNA vaccine group (P<0.01); The contents of NO in the intraperitoneal macrophages of the mice were significantly lower than in the control group and Hsp65 DNA vaccine group (P<0.01); The levels of serum IL-2 in the mice were significantly higher than in the control group, but there was no statistical difference between Hsp65 DNA group and vector group (P>0.05); The contents of serum IFN-γ in the mice were significantly higher than in the control group, but significantly lower than in the Hsp65 DNA vaccine group (P< 0.05). It was indicated that immunization with Hsp70 DNA vaccine could obviously enhance the immune response, but its intensity seemed inferior to Hsp65 DNA vaccine. The anti-infection mechanisms and clinical use in the future of the vaccines of Hsp70 DNA and Hsp65 DNA are worth further studying. This project was supported by a grant from National Natural Sciences Foundation of China (No. 39870663).     

Comparative Study on the Immunogenicity between Hsp70 DNA Vaccine and Hsp65 DNA Vaccine in Human Mycobacterium Tuberculosis

There are 3million deaths perannum worldwidedue to tuberculosis,and AIDS is compounding theproblem.A better vaccine than the live mycobacteri-um currently in use,Bacillus Calmette- Guerin( BCG) ,is needed.Mycobacterium heat shock pro-tein ( HSP) can not only enhance the immune re-sponse,but also keep the antigen characteristics ofmycobacterium itself.Our cooperator,Silva fromLowrie group of British National Medical Academy,cloned the mycobacterium Hsp65 gene into a eukary-otic expressi…     

腺病毒介导 HSV-2 gD 基因修饰的树突状细胞疫苗制备

目的：生殖器疱疹尚无彻底治愈的方法。研制有效的生殖器疱疹病毒疫苗是预防和治疗HSV-2感染的关键,文中探讨制备腺病毒介导的HSV-2 gD基因修饰的树突状细胞（ dendritic cell , DC）疫苗的可行性。方法将HSV-2 gD蛋白基因克隆到质粒载体Shuttle-2,重组质粒酶切鉴定、测序鉴定后构建重组腺病毒pAdeno-HSV-2 gD。分离小鼠骨髓DC细胞, pAdeno-HSV-2 gD转染DC细胞后用流式细胞术检测DC表型,用免疫组化法、RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot 方法检测HSV-2 gD的表达情况。结果以HSV-2病毒DNA为模板,采用gD基因引物扩增出相应的目的片段。琼脂糖凝胶电泳显示,PCR产物gD基因同预期的大小一致（1182 bp）。 pAdeno-gD DNA用脂质体法转染293细胞10 d,反复冻融获得pAdeno-HSV-2 gD重组腺病毒,活性为4×1010 IU／mL。流式细胞仪检测结果显示：成熟DC和腺病毒感染后DC,CD40含量为（74．2±3．9）％、（81．3±3．1）％,CD80含量为（73．9±4．1）％、（80．4±2．9）％,CD86含量为（76．1±5．5）％、（83．7±3．9）％,均较不成熟DC的CD40、CD80、CD86含量[（9．7±0．5）％、（7．5±1．2）％、（5．2±1．1）％]升高（P＜0．01）。 pAdeno-HSV-2 gD-DC和细胞因子刺激诱导成熟的DC细胞表面分子表达差异无统计学意义（P＞0．05）。 RT-PCR、免疫组织化学方法证明HSV-2 gD能在DC细胞内表达,表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析发现,在相对分子质量为43000处有外源蛋白表达,与预期蛋白条带一致。结论成功制备了pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗。     

Increased expression of Hsp70 and co-localization with nuclea r protein in cells infected with the Hantaan virus

目的　研究汉滩病毒 (HTV)感染对应激基因表达的影响。方法　病毒感染 ,Westernblot,免疫组化 ,免疫荧光双标记 ,激光扫描共聚焦显微镜观察 ,RNA斑点杂交 ,原位杂交。结果　HTV感染细胞中Hsp70高表达 ,病毒感染后Hsp70从细胞浆转位至细胞核 ,病毒感染后不同时间点Hsp70的分布不一 ,间接免疫荧光双标记显示感染细胞的胞浆中NP与Hsp70有共定位。结论　汉滩病毒能直接诱导Hsp70的高表达 ,可能与病毒的装配有关 ,感染细胞中汉滩病毒蛋白与Hsp70共定位 ,并可能形成一种物理复合物     

热休克蛋白70和热休克蛋白27在宫颈鳞癌中的表达及其意义

目的探讨热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白27(HSP27)在宫颈鳞癌中的表达及其相关性。方法应用免疫组织化学方法检测HSP70、HSP27在60例宫颈鳞癌,18例宫颈上皮内瘤变(C IN),7例正常宫颈组织中的表达。结果宫颈鳞癌组织中HSP70,HSP27阳性表达率与正常宫颈组织相比差异有统计学意义(P<0.05);宫颈鳞癌中HSP70的阳性表达与病理分级、临床分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05),HSP27的阳性表达与病理分级密切相关(P<0.05);HSP70与HSP27在宫颈鳞癌中的表达无相关关系(P>0.05)。结论HSP70、HSP27均在宫颈鳞癌发生和发展中起重要作用,HSP70可能作为判断宫颈癌预后的重要指标。     

甲胎蛋白与热休克蛋白70基因融合载体的构建及表达

目的：构建分泌性小鼠甲胎蛋白(α—Fetoprotein,AFP)与结核杆菌热休克蛋白70(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,Mt．HSP70)基因融合载体,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法：以pSecTag2B为基本单位构建AFP及与HSP70的融合表达载体,融合基因以G-S-G-S连接子连接;用脂质体将系列载体导入COS-7细胞,48 h后以免疫化学方法检测其表达,抽提总RNA作RT-PCR测其在转录水平的表达。结果：构建的AFP和HSP70的单独及融合表达载体导入COS-7细胞48h后经细胞免疫化学染色为阳性,RT-PCR可扩增出特异性条带。结论：AFP和HSP70的单独及融合表达载体构建成功,能在真核细胞中表达。     

日本血吸虫SjC23-Hsp70 DNA 疫苗与IL-12对水牛保护性作用的研究

目的:研究日本血吸虫中国大陆株23 kD 膜蛋白-热休克蛋白(SjC23-Hsp70)DNA 疫苗联合佐剂白细胞介素12(IL-12) 质粒DNA 对水牛的免疫保护作用。方法:将血吸虫病非流行区8~10 月龄健康水牛45 头随机分为A组(SjC23-Hsp70+IL-12)、B 组(SjC23+IL-12) 和C 组(pVAX+IL-12),每组15 头。每头牛经肩部肌注免疫3 次,每次间隔28 d。末次免疫后28 d,每头牛感染日本血吸虫尾蚴1000 条。解剖前2 天及当天分别收集粪便1 次,用定量法检测虫卵和毛蚴数。攻击感染后56 天解剖所有水牛,经胸主动脉灌冲法收集成虫,计数成虫数,检测每克肝组织虫卵数。结果:A,B 组与C 组相比,分别获得45.70%和26.61%的减雌率,44.51%和25.84%的减虫率,41.10%和31.63%的减粪卵率,48.11%和38.07%的减毛蚴率及43.39%和31.95%的减肝卵率。A 组的5 个率均比B 组高(P<0.05)。结论:用SjC23-Hsp70 DNA 疫苗和IL-12 联合免疫水牛可获得明显的免疫保护作用。     

脑梗死大鼠模型急性期抗凋亡蛋白Bcl-2和热休克蛋白70的动态表达

【目的】观察SD大鼠大脑中动脉闭塞模型（middlecerebralarteryocclusion,MCAO）急性期热休克蛋门70（heatshockresponse70,Hsp70）和抗凋亡蛋门Bcl-2（Bcelllymphoma／leukemia2）随时间变化的动态表达,探讨其变化的规律,为临床治疗靶点提供实验依据。【方法】选用健康雄性SD大鼠36只,采用完全随机设计方法分为3组,空白对照组n=4）、假手术组（n=16）、手术组（n=16）。手术组采用改良线栓法建立急性大脑中动脉闭塞模型,术后0．5h、2h、3h、6h、12h、24h、3d、7d共8个DI采血。用ELISA法测定Bcl-2和Hsp70的OD值,绘制标准曲线并计算对应的浓度。【结果】（1）Bcl-2的表达：手术组Bcl-2术后6h显著升高,12h到达高峰,3d时下降接近空F1对照组水平。手术组与假手术组在6、12、24h时问点比较差异有统计学意义（P〈0．05）;手术组与空白对照组在2h、3h、6h、12h、24h、3d、7d时间点比较差异有统计学意义（P〈0．05）;手术组内6、12、24h与其他时间点比较差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）Hsp70的表达：手术组Hsp70在术后0．5h就开始表达,24h达到高峰,3d时逐渐下降接近对照组水平。手术组内24h与各时间点内表达水平比较差异有统计学意义（P〈0．05）。【结论]Bcl-2和Hsp70在脑梗死急性期均显著升高,参与神经元缺血缺氧的病理过程,在神经细胞损伤早期发挥重要作用。二者的表达水平呈正相关性。