共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。方法 将CTLA4Ig cDNA插入腺病毒表达质粒；将重组质粒与病毒基因组质粒共转染293细胞，产生重组腺病毒；采用dot-ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后，以dot-ELISA法筛选到2个293细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑，PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig，为进行器官移植基因治疗研究提供了工具。     

人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法:双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8-CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrack-CTLA4Ig与AdEasy-1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAd-CTLA4Ig,PacⅠ酶切产生30 kb和4.5 kb 2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109).结论:成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.     

人CTLA4Ig,IκBα双基因共表达腺病毒载体的构建

目的制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(cytotoxic T lymphocytic associated antigen 4, CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白(inhibition of NF-κB, IκBα)双基因共表达腺病毒载体.方法将IκBα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(internal ribosome entry site, IRES2)连接,并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体,以同源重组的形式转染293细胞,构建重组腺病毒.结果①成功构建Padtrack-CMV-CTLA4Ig-IRES2表达质粒; ②与BJ5183重组后转染293,获得重组腺病毒;③PCR鉴定重组腺病毒正确.结论构建了人CTLA4IGg,IκBα双基因共表达腺病毒载体,为进一步研究其在免疫耐受中的作用提供研究基础.     

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中，脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig-IRES2-EGFP转染PA317细胞，在G418选择压力下，通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA317细胞克隆，MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体，生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。结论 IRES序列调控CTLA4Ig与EGFP双基因在细胞中同时独立表达。     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

[目的]为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制,构建其重组腺病毒载体,并在PC12细胞中表达.[方法]RT-PCR获取大鼠DNA多聚酶β(POLβ)的编码序列,TA克隆测序,酶切POLβ基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV,电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183.重组腺病毒质粒(pAd-polβ)和Lipofectamine2000转染293细胞,用重组腺病毒感染PC12细胞.[结果]10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致,同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带.DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后,感染Ad-polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光,重组腺病毒Ad-polβPCR鉴定含目标条带,Ad-polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达.[结论]成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

人Toll样受体2细胞外区基因重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的:克隆人Toll样受体2(TLR2)细胞外区基因,并构建含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-TLR2. 方法:应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2细胞外区基因,克隆入pUCm-T载体并转化大肠埃希菌感受态DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序分析后,用KpnⅠ和HindⅢ双酶切,将目的片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,双酶切鉴定并测序验证. 结果:RT-PCR扩增得到约1 000bp的目的基因片段,TA克隆后测序鉴定与GenBank中的序列一致,经酶切连接成功地将目的基因插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中. 结论:成功克隆了人TLR2细胞外区基因,并构建了含目的基因的重组腺病毒穿梭载体.     

人神经营养素-3受体基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

[目的]构建人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)受体(即酪氨酸蛋白激酶受体C,tyrosine protein kinase C,TrkC)基因重组的腺病毒表达载体.[方法]从人脑组织mRNA中扩增TrkC基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的表达盒.再将表达盒与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒(pAd-TrkC).用pAd-TrkC转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-TrkC).[结果]TrkC基因RT-PCR扩增产物为2 478 bp.Adeno-TrkC经PCR鉴定为正确重组子.[结论]应用体外连接法已构建了人TrkC重组腺病毒表达载体,这为进一步应用NT-3进行基因治疗中枢神经损伤奠定了基础.     

连环蛋白P120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建携带HA—tag的连环蛋白P120（P120ctn）基因重组腺病毒载体,并观察腺病毒感染后P120ctn在HepG-2细胞中的表达情况。方法把HA-tag和P120ctn基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒。再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取P120ctn重组腺病毒并进一步感染HepG-2细胞株。结果P120ctn基因成功克隆到腺病毒载体中,该腺病毒可高效介导P120ctn在HepG-2细胞中表达。结论成功地构建了含P120ctn基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建

[目的]构建携带SARS冠状病毒刺突蛋白N端基因片段的重组腺病毒.[方法]从SARS病毒cDNA扩增刺突蛋白N端基因片段(-45～1469nt,截短的S1区,SN),插入腺病毒穿梭质粒pShuttle,通过体外连接法构建重组腺病毒Ad-SN.用Ad-SN感染Vero-E6细胞,通过RT-PCR和Western blot法检测SN的表达.[结果]克隆的SN基因序列与文献报道基本一致;Ad-SN基因组结构与预期一致.在Ad-SN感染的Vero-E6细胞中存在SN基因的转录和分泌型SN蛋白的表达.[结论]体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;重组腺病毒Ad-SN能正确表达分泌型SN蛋白,可用于诱导抗SARS免疫的动物实验研究.     

小鼠IDO基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的 构建携带小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行研究其免疫学效应.方法 酶切含有小鼠全长IDOcDNA的PCOUS-2质粒,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度.RT-PCR和荧光显微镜鉴定和检测重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达,同时进行野生型腺病毒的检测.结果 经酶切及测序证实IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,且无野生型腺病毒的产生.结论 成功构建了含小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,为探讨IDO的生物学功能奠定了基础.     

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的 利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒. 方法 自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中.酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒.重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达. 结果 经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒. 结论 成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体.     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

[目的]构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达,为开展对resistin的研究打下实验基础.[方法]酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患者腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA,RT-PCR法扩增出re-sistin基因cDNA,经测序后,PCR产物亚克隆入T载体,用EcoRI和KpnI分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS,然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接,用核酸内切酶EcoRI、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒.重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,经1 mmol/LIPTG在32℃诱导表达2 h,裂解细菌,进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达.[结果]RT-PCR扩增产物分子大小为327 bp,序列分析表明为人resistin基因完整编码区.PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后,从细菌质粒中酶切回收了目的片段.重组表达质粒经EcoRI和KpnI双酶切后能产生出327 bp、4 980 bp大小的两个片段,序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区,基因编码无移位,PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39.5 kD的融合蛋白.[结论]成功构建了人resistin基因原核表达载体,且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白,为下一步研究打下了实验基础.     

重组穿梭质粒pAdTrack-cmv-rHSG载体的构建及鉴定

目的构建大鼠增殖抑制基因（rat hyperplasia suppressor gene,rHSG）腺病毒穿梭质粒,为进一步研究体内诱导rHSG在恶性胶质瘤的特异性表达奠定基础。方法提取SD大鼠心肌总RNA,利用RT-PCR方法扩增大鼠增殖抑制基因（rHSG）的全开放读码框区片段,将其亚克隆入T载体,双酶切后与经同样处理的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-cmv相连,用酶切和测序进行鉴定。结果扩增rHSG克隆出rHSG基因并成功重组于入腺病毒基因并成功的穿梭质粒。结论构建成功重组大鼠增殖抑制基因腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-cmv-rHSG。     

编码绿色荧光蛋白和βARKct的重组腺病毒的制备

[目的]制备编码绿色荧光蛋白(GFP)和Gβγ活性抑制剂βARKct的重组腺病毒载体.[方法]构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-βARKct,经PmeI线性化后转化入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-I的BJ5183菌,筛选获得重组腺病毒质粒pAdEasy-gfp-βARKct.用LipoFectamine 2000将经PacI线性化的pAdEasy-gfp-βARKct转染入人胚肾293细胞,包装并扩增出重组腺病毒颗粒rAd-gfp-βARKct.用氯化铯高速梯度离心、纯化rAd-gfp-βARKct.用rAd-GFP-βARKct干预去甲肾上腺素诱导的乳鼠心肌细胞肥大过程,观察对β肌球蛋白重链(βMHC)基因表达的影响.[结果]将pAdTrack-CMV-βARKct转入含pAdEasy-I的BJ5183菌后获得20%的阳性重组体克隆.重组腺病毒质粒在293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有βARKct编码基因.透析纯化得到重组腺病毒滴度为6.0×106 pfu/mL.rAd-GFP-βARKct表达的βARKct可抑制乳鼠心肌细胞βMHC的高表达.[结论]成功构建重组腺病毒载体,并在293细胞中包装、制备出可表达βARKct的重组腺病毒rAd-gfp-βARKct.     

人CTIA4Ig，IκBα双基因共表达腺病毒载体的构建

目的制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(cytotoxic T lymphocytic associated antigen4，CTIA4Ig)和核因子的抑制蛋白(inhibition of NF-κB，IκBα)双基因共表达腺病毒载体。方法将IκBα和CHA4Ig通过内部核糖体进入部位(internal ribosome entrysite，IRES2)连接，并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体，以同源重组的形式转染293细胞，构建重组腺病毒。结果①成功构建Padtrack-CMV—CTLA4Ig-IRES2表达质粒；②与BJ5183重组后转染293，获得重组腺病毒；③PCR鉴定重组腺病毒正确。结论构建了人CHA4IGg，IκBα双基因共表达腺病毒载体，为进一步研究其在免疫耐受中的作用提供研究基础。     

沉默信息调节蛋白6基因重组腺病毒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建高表达小鼠沉默信息调节蛋白6(SIRT6)基因的重组腺病毒Ad-SIRT6,并在HepG2细胞中验证其表达。方法:通过PCR获取SIRT6基因编码序列,克隆入pAd-Track-CMV载体质粒中;将重组质粒PmeⅠ线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同电转入大肠杆菌BJ5183中,获得Ad-SIRT6质粒pAd-SIRT6;用PacⅠ线性化处理后,转染Ad293细胞,包装获得Ad-SIRT6。用该病毒感染HepG2,进行RT-PCR及Western blot验证目的基因的表达。结果:pAd-Track-CMV-SIRT6测序结果正确;pAd-SIRT6转染Ad293后,扩增并纯化得Ad-SIRT6;转染HepG2后,经RT-PCR及Western blot验证,可表达外源性SIRT6基因,且SIRT6总蛋白表达量增高(P<0.05)。结论:成功构建可高表达SIRT6基因的Ad-SIRT6,为进一步研究SIRT6基因在肝糖脂代谢中的作用机制奠定了基础。     

人骨形成蛋白-2基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的：克隆人骨形成蛋白-2（BMP-2）基因cDNA，构建含BMP-2基因的重组腺病毒载体。方法：采用RT-PCR方法克隆BMP-2基因cDNA，并插入克隆载体pGEM-T中进行全序列分析。将BMP-2基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中，构建pShuttle-BMP2重组质粒，再将其中的表达盒克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA-pAd-BMP。 结果：成功地克隆长约1 200 bp的BMP-2 cDNA，并成功地构建其腺病毒载体，经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞，包装、扩增后得到人骨形成蛋白-2重组腺病毒，其滴度约为1×10¹¹nfu•L^-1，该滴度可满足进一步的BMP-2成骨作用的研究。结论:成功地构建BMP-2腺病毒载体。     

携带TIMP-4 cDNA的重组腺病毒载体的构建

目的 克隆细胞外基质金属蛋白酶组织抑制因子4(tissue inhibitor-4 of metalloproteinases,TIMP-4)基因,构建包装携带TIMP-4基因的重组腺病毒载体(Ad/T4),为基因治疗血管再狭窄的实验研究打下基础.方法 以人心脏cDNA文库为模板,应用PCR克隆TIMP-4基因,经DNA测序确定克隆结果.构建具有强启动子CMV,携带TIMP-4和报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-T4,利用AdEassy系统,在大肠杆菌BJ5183经同源重组产生重组腺病毒质粒pAd/T4.脂质体介导转染293细胞,包装重组腺病毒载体(Ad/T4).结果 克隆出含TIMP-4全部编码序列的cDNA片断,并通过亚克隆和同源重组等将其重组入腺病毒,构建包装了重组腺病毒载体Ad/T4.结论 Ad/T4中含有TIMP-4和GFP的完整表达盒,可用于基因治疗的实验.     

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

[目的]构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的重组腺病毒载体并观察其在C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础.[方法]将VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,获得重组质粒pAdTrack VEGF165,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV VEGF165,转化体外培养的C17.2神经干细胞.通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot法检测其在C17.2神经干细胞中的表达.[结果]重组腺病毒AdCMV VEGF165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/mL.病毒上清液经ELISA检测VEGF165表达的量为(1135±138)ng/L.重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达.[结论]成功构建pAd VEGF165重组腺病毒,获得了稳定表达VEGF165的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础.