特异性损伤内耳螺旋神经元小鼠模型的建立

目的：建立小鼠内耳螺旋神经元损伤的耳聋模型,为研究干细胞移植治疗感音神经性聋奠定基础。方法成年雌性SPF级CBA／J小鼠60只,随机分为实验组和生理盐水组,每组30只,实验组动物经圆窗渗透给予10μl哇巴因（ouabain）,生理盐水组同法给予等量生理盐水。每组于给药前及给药后7、14及30天分别检测小鼠听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）,并用免疫组织荧光技术和基底膜铺片技术分别观察耳蜗螺旋神经元（spiral ganglion neurons ,SGNs）细胞及内耳毛细胞（hair cells ,HCs）的变化。结果①与生理盐水组比较,实验组给药后各时间点 ABR反应阈均明显升高,波Ⅰ潜伏期延长,振幅明显降低,差异有统计学意义（ P＜0．05）。②实验组及生理盐水组小鼠DPOAE均可正常引出。③与生理盐水组相比,实验组耳蜗各回螺旋神经元的数量及密度显著降低,差异有统计学意义（P＜0．05）。④实验组在给药后不同时间点,耳蜗各回内、外毛细胞均排列整齐、形态完整、未见明显损伤或丢失。结论哇巴因经圆窗渗透给药可特异性损伤CBA／J小鼠内耳螺旋神经元及其功能,而不损伤内、外毛细胞,是一种理想的研究干细胞移植治疗感音神经性聋的动物模型。     

耳后入路圆窗膜显微注射小鼠耳蜗基因转染新途径的研究

目的研究腺病毒携带目的基因经小鼠耳后人路圆窗膜显微注射途径耳蜗转导的可行性,为以小鼠作为动物模型的内耳基因治疗提供实验基础和解剖学依据。方法12只C57BL／6J小鼠分为2组,实验组（8只）以重组腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）、对照组（4只）以人工外淋巴液经耳后入路圆窗膜显微注射注入耳蜗内。分别于术后5、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片,在激光共聚焦显微镜下观察GFP表达。结果术后动物存活10只（每组死亡1只）。实验组转染后耳蜗底回基底膜及螺旋神经节上目的基因有表达,14天组强于5天组。对照组耳蜗未见荧光表达。结论耳后入路操作简单、损伤小、易于暴露圆窗龛。耳后入路圆窗膜显微注射腺病毒携带目的基因转导的方法能够将目的基因成功转导至耳蜗组织并表达。     

同种异体内耳组织免疫后豚鼠内耳形态学变化

目的建立一高阳性率、可供圆窗给药治疗内耳病研究用的自身免疫性内耳病动物模型。方法实验动物为86只豚鼠,其中32只用于制备粗制内耳抗原。其余动物随机分为实验组42只,对照组1、2各6只。将实验组动物腹腔注射环磷酰胺进行预处理,2d后用粗制内耳抗原行皮下多点接种,分别于接种后4、6、8、10、12、14、20d时用光镜观察动物内耳形态学变化,并检测其血清中IgG、IgM、C3、CH50、循环免疫复合物(CIC)水平。对照组1不行任何处理,对照组2不接种内耳抗原,余同试验组。结果接种后豚鼠耳蜗、前庭、内淋巴囊等部位出现以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,尤以前庭阶、鼓阶、螺旋神经节区域及耳蜗底圈等部位为重。接种后4d时,67%动物内耳有炎性细胞浸润;8~12d时,100%动物出现炎性细胞浸润;接种14d后,炎性细胞浸润明显减少。接种6~14d时,内耳尚有血管周围炎、螺旋神经节细胞变性、内淋巴积水等改变。结论将豚鼠采用环磷酰胺预处理及同种异体内耳抗原接种,可建立一高阳性率的自身免疫性内耳病动物模型。     

内耳疾病基因治疗方法的研究

目的:探讨一种高效、安全和简便的内耳疾病基因转移和导入方法。方法:将30只健康豚鼠随机分为A、B、C 3组,每组10只。用Ad—GFP报告基因分别由圆窗、耳蜗底回和脑脊液三种途径导入30只豚鼠内耳,在术前和术后测定听性脑干反应(ABR)阈值和畸变产物耳声发射(DPOAE)振幅改变。再行耳蜗铺片,观察AdGFP在内耳组织中的转染表达和耳蜗毛细胞的形态结构。结果:三种途径导入Ad—GFP在耳蜗螺旋神经节、血管纹和Corti器上均有转染和表达。在术后3 d的表达产物最高,7 d后减弱,10 d后更弱。圆窗和耳蜗底回钻孔导入手术可引起蜗内出血,凝血块淤积在耳蜗顶回的中阶,造成顶回毛细胞损害。而脑脊液给药途径无此现象。ABR阈值在各组动物手术前后无明显改变,而圆窗和耳蜗底回给药途径造成DPOAE幅度明显下降,脑脊液给药组无DPOAE改变。结论:应用腺病毒载体进行基因转移通过圆窗和耳蜗底回钻孔途径可引起蜗内出血,影响DPOAE幅度,而应用脑脊液给药途径则相对安全和方便。     

美金刚拮抗阿米卡星对豚鼠螺旋神经节细胞毒性的实验研究

目的通过圆窗龛局部给药,探讨美金刚对阿米卡星致豚鼠螺旋神经节细胞毒性的拮抗作用。方法将听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检测结果小于40dBSPL的花色豚鼠共60只,随机分为4组,每组15只。Ⅰ组:空白对照组;Ⅱ组:单纯阿米卡星给药组(肌肉注射阿米卡星);Ⅲ组:人工外淋巴液(artificial perilymph,APL)+阿米卡星给药组(左耳圆窗龛注人APL60μl后,肌肉注射阿米卡星);IV组:美金刚+阿米卡星给药组(左耳圆窗龛注入溶于APL的美金刚5mg/ml,60μl后,肌肉注射阿米卡星)。阿米卡星注射量为400mg/kg/d,连续注射5天,停药14天后,每组动物行ABR阈值检测,将动物处死,取出每组动物左耳蜗。每组随机取6只通过免疫组织化学染色观察耳蜗螺旋神经节caspase3表达情况。剩下6只行原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)法检测螺旋神经节细胞凋亡率。结果给药前,各组动物ABR阈值检测结果均小于40dBSPL。给药后,各组动物左耳ABR阈值结果为:Ⅰ组:37.08±3.34dB SPL,Ⅱ组:90.42±5.42dBSPL,Ⅲ组:91.17±5.37dB SPL,IV组:78.75±6.78dB SPL。免疫组织化学染色显示,Ⅱ组、Ⅲ组动物耳蜗螺旋神经节caspase3表达较Ⅰ组升高(P<0.01)。IV组动物耳蜗螺旋节caspase3表达较Ⅱ组、Ⅲ组降低(P<0.05),较Ⅰ组升高(P<0.01)。TUNEL法检测螺旋神经节细胞凋亡率:Ⅱ组、Ⅲ组动物耳蜗螺旋神经节细胞凋亡率较Ⅰ组明显升高(P<0.001)。IV组动物耳蜗螺旋神经节凋亡率较Ⅱ组、Ⅲ组降低(P<0.01),较Ⅰ组升高(P<0.001)。结论 (1)美金刚经圆窗龛局部给药后肌肉注射阿米卡星,豚鼠ABR阈值低于单纯肌肉注射阿米卡星ABR阈值。(2)美金刚经圆窗龛局部给药后肌肉注射阿米卡星,螺旋神经节caspase3表达较单纯肌肉注射阿米卡星减少。(3)美金刚经圆窗龛局部给药后肌肉注射阿米卡星,螺旋神经节凋亡较单纯肌肉注射阿米卡星减少。美金刚经圆窗龛给药对阿米卡星螺旋神经节细胞毒性有一定拮抗作用。     

中药健耳Ⅱ号胶囊对抗C57BL/6J小鼠老年性耳蜗损害的实验研究

目的 观察中药健耳Ⅱ号胶囊是否对C57小鼠老年性耳蜗损害具有保护作用。方法 选择刚出生的C57BL／6J小鼠40只，随机平均分为对照组、中药组各20只，其中对照组小鼠为常规饲料喂养，分别在出生后2．4和7个月终止实验；中药组小鼠常规饲料喂养至出生后2个月时开始饮用健耳Ⅱ号胶囊溶液以代替日常饮水，至7月龄时终止实验。取出小鼠耳蜗分别制成耳蜗铺片和耳蜗切片，在光学显微镜下定量观察并比较两组小鼠耳蜗毛细胞的密度和疆孔内的神经纤维数量以及螺旋神经节密度。结果 对照组C57BL／6J小鼠随着月龄的递增出现耳蜗毛细胞损伤加重的趋势，且这种随着年龄增长而发生的耳蜗损害遵循着从底回逐渐向顶回发展的规律，外毛细胞的损害比同区域的内毛细胞严重。7月龄对照组动物的耳蜗毛细胞损害范围比较广泛，底回螺旋神经节细胞数量明显减少，存活神经元细胞亦呈现异常的形态学改变，同时疆孔内的神经纤维数量也有所减少。但在中药组小鼠，无论是耳蜗毛细胞的数量还是疆孔内的神经纤维数量，以及蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞密度均比对照组动物的损害轻。经统计学分析，两组动物耳蜗底回的螺旋神经节细胞密度和底回疆孔内的神经纤维数量差异均有统计学意义（P〈0．001，P〈0．05）。结论 ①C57BL／6J小鼠在出生后4个月即开始发生耳蜗进行性损害，可作为研究老年性聋的理想动物模型；②鉴于在老年性耳蜗损害的早期可见毛细胞和螺旋神经节均有损害，提示老年性耳蜗损害可能是同时发生在听觉神经元；③中药健耳Ⅱ号胶囊不但可以延缓C57BL／6J小鼠随着年龄增长而发生的耳蜗毛细胞损坏，而且对于听觉神经元和听神经纤维也具有一定的保护作用。     

大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的定量观察

目的 为定量观察SASCO Sprague Dawley(SD)大鼠耳蜗蜗轴螺旋管(Rosenthal's canal)切片中螺旋神经节细胞的数量提供实验依据.方法 11只SD大鼠用于本实验研究,其中5只正常SD大鼠用于对照,另966只SD大鼠用于制备乌苯苷引起的螺旋神经节细胞损害模型.耳蜗样品制作耳蜗中轴半薄切片,常规甲苯胺蓝染色,对耳蜗各回蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞进行计数,计数结果采用方差分析检验.结果 一个完整蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞数量在底回末段多于耳蜗底回起始段和中回中段.与正常大鼠耳蜗螺旋神经带数量相比,1mM乌苯苷仅造成耳蜗底回的部分螺旋神经节细胞破坏,而10mM乌笨苷可破坏绝大部分螺旋神经节,乌苯苷引起的螺旋神经节破坏模式是从耳蜗底回逐渐向顶回发展.结论 计数耳蜗各回不同部位切片中的蜗轴螺旋管内螺旋神经节细胞数量是一种简便可靠的耳蜗螺旋神经节细胞定量分析方法.     

脑源性神经营养因子和神经生长因子对顺铂诱导的内耳毒性的保护作用

目的研究豚鼠耳蜗内脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)在顺铂致耳中毒后的表达,并探讨其对内耳的保护作用。方法将豚鼠分成对照组、顺铂组,分别给生理盐水、顺铂腹腔注射,于注射后3、5、7天取豚鼠耳蜗行石蜡切片,进行BDNF和NGF免疫组织化学染色,观察螺旋神经节BDNF和NGF蛋白表达。结果对照组耳蜗螺旋神经节细胞中BDNF几乎不表达,NGF呈中度阳性表达。顺铂组BDNF在3天时达到高峰,以后减弱;NGF在5天时达到高峰,以后减弱。结论正常豚鼠耳蜗有中度NGF的表达,表明NGF可能对内耳的正常生理功能起重要作用。顺铂干预后螺旋神经节BDNF和NGF出现高表达,提示BDNF和NGF对顺铂诱导的螺旋神经元损伤有保护作用。     

对灰鼠延迟性神经元死亡模型中螺旋神经节细胞缺损的评估

目的探索观察耳蜗螺旋神经节细胞的简便定量研究方法 ,并在灰鼠延迟性螺旋神经节细胞死亡动物模型中验证本方法的实用性和可靠性。方法 15只成年灰鼠平均分为3组,第1组用于正常对照;第2组一次性同时肌肉注射庆大霉素（125mg/kg）和静脉注射利尿酸钠（40mg/kg）,并在用药后2个月处死;第3组接受与第2组同样的药物注射,但在用药后4个月处死。耳蜗样品被常规应用环氧树脂包埋并制作成耳蜗中轴半薄切片,计数耳蜗各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节数量并进行统计分析。结果灰鼠耳蜗底回起始端的蜗轴螺旋管腔比耳蜗底回中部和耳蜗中回大,因此耳蜗底回起始端蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞数量多于耳蜗底回中部和耳蜗中回。耳蜗毛细胞被彻底破坏后2个月,与正常灰鼠耳蜗各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节细胞数量相比,耳蜗底回蜗轴螺旋管切片截面内的螺旋神经节细胞减少数量比耳蜗中回严重,提示延迟性螺旋神经节细胞死亡可能遵循着从耳蜗底回向顶回扩展的规律。耳蜗毛细胞被彻底破坏后4个月,全耳蜗蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞基本上丧失殆尽。结论计数耳蜗中轴切片各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节细胞数量是一种简便可靠的定量分析方法 。     

内耳免疫反应中细胞凋亡的研究

目的探讨内耳免疫反应过程是否引起细胞凋亡以及Fas和FasL、Bcl-2和Bax的表达情况。方法选用雌性白色豚鼠16只，随机分为实验组和对照组各8只，以钥孔蛾血蓝蛋白全身免疫后，实验组以相同抗原进行内耳免疫，对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水，在内耳免疫7d后处死动物，取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过电镜和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)检测内耳凋亡细胞，免疫组化检测内耳Fas和FasL以及Bcl-2和Bax的表达。结果透射电镜观察发现实验组术后7d内耳外毛细胞、血管纹细胞及螺旋神经节细胞都出现了凋亡细胞的特征性改变，而对照组未发现具有上述特征的细胞。实验组内耳Corti器毛细胞，血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞存在TUNEL染色阳性细胞，TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征，对照组内耳的任何结构中都没发现TUNEL染色阳性细胞。免疫组化染色实验组Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带Fas和FasL蛋白表达阳性，而对照组只有螺旋神经节细胞和血管纹有较弱的Fas蛋白表达，FasL蛋白表达阴性。实验组Corti器、螺旋神经节细胞、侧壁Bcl-2蛋白表达阴性，对照组的Corti器、侧壁和螺旋神经节细胞Bcl-2蛋白表达阳性。实验组Corti器、侧壁和螺旋神经节细胞Bax蛋白表达阳性，对照组只有螺旋神经节细胞Bax蛋白表达弱阳性，Corti器、侧壁表达阴性。结论内耳免疫反应可诱导细胞凋亡发生，Fas-FasL是此过程的信号转导途径之一，Bcl-2和Bax蛋白在其中起了重要调节作用。     

Transplantation of Mouse Embryonic Stem Cells into the Cochlea of an Auditory-Neuropathy Animal Model: Effects of Timing after Injury

Application of ouabain to the round window membrane of the gerbil selectively induces the death of most spiral ganglion neurons and thus provides an excellent model for investigating the survival and differentiation of embryonic stem cells (ESCs) introduced into the inner ear. In this study, mouse ESCs were pretreated with a neural-induction protocol and transplanted into Rosenthal's canal (RC), perilymph, or endolymph of Mongolian gerbils either 1-3 days (early post-injury transplant group) or 7 days or longer (late post-injury transplant group) after ouabain injury. Overall, ESC survival in RC and perilymphatic spaces was significantly greater in the early post-injury microenvironment as compared to the later post-injury condition. Viable clusters of ESCs within RC and perilymphatic spaces appeared to be associated with neovascularization in the early post-injury group. A small number of ESCs transplanted within RC stained for mature neuronal or glial cell markers. ESCs introduced into perilymph survived in several locations, but most differentiated into glia-like cells. ESCs transplanted into endolymph survived poorly if at all. These experiments demonstrate that there is an optimal time window for engraftment and survival of ESCs that occurs in the early post-injury period.     

ouabain-induced auditory nerve degeneration in congenic ly5.1 mice

The Ly5.1 mouse,also termed B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ,is a congenic strain widely used as a recipient in animal studies of bone marrow transplant.Our previous study documented that a majority of type Ⅰ ...     

A new method for drug application to the inner ear

Inner ear sensory cells are very susceptible to injuries and recovery after damage is very difficult. Recently several drugs including neurotrophic factors have been reported to protect against inner ear injury. The purpose of this experimental study is to find new methods for applying drugs to the inner ear that effectively protect against inner ear damage. Biodegradable hydrogel was used as a carrier for application of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) into the inner ear of guinea pigs through the round window membrane. After application of BDNF the number of surviving spiral ganglion neurons increased following injury of inner ear hair cells and spiral ganglion neurons by ototoxic treatment. This result indicates that BDNF provides effective protection against inner ear damage and that biodegradable hydrogel is useful for application of drugs to the inner ear.     

凋亡及其相关基因在实验性自身免疫性内耳病小鼠内耳组织中的表达

目的探讨凋亡及其相关基因在自身免疫性内耳病形成和发展中的作用。方法选用近交系C57BL／6小鼠随机数字表法分为正常对照组和免疫7、14、21、28d组，每组16只。提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原，与等量完令弗氏佐剂，百日咳杆菌一次免疫实验组动物，制备自身免疫性内耳病动物模型，应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase—mediated d-UTP nick end—labing，TUNEL）检测内耳中的细胞凋亡，应用免疫组化和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测Fas、FasL及bcl-2在内耳的表达。结果正常小鼠内耳组织中，TUNEL染色阳性细胞极为少见，偶尔在Corti器或球囊斑的支持细胞发现。免疫7d后，内毛细胞和少量的血管纹边缘细胞TUNEL染色阳性，14d后TUNEL染色阳性的细胞数量及种类显著增加，但外毛细胞、螺旋神经节细胞与前庭神经节细胞免疫前后均未见凋亡表达。免疫组化染色显示，正常小鼠内耳中Fas表达广泛，FasL存部分螺旋神经节细胞与前庭神经节细胞表达，bcl-2仅在螺旋神经节细胞、前庭神经节细胞有较强表达。免疫后FasL在各种组织均有较强表达，bcl一2在外毛细胞出现表达，在耳蜗神经无细胞的表达增加。RT—PCR检测正常小鼠内耳组织的Fas mRNA、FasL mRNA、bcl-2mRNA均为阳性，FasL mRNA低水平表达，免疫后升高，在2周达到高峰后逐渐下降；bcl-2 mRNA在免疫后进行性升高。结论Fas／FasL信号系统介导的凋亡与自身免疫性内耳病的发生、发展过程关系密切，bcl-2对内耳中Fas／FasL介导的凋亡有重要的调节作用。     

腺病毒携带的LacZ基因在豚鼠耳蜗中的表达

目的 带有LacZ基因的腺病毒注入豚鼠耳蜗后,观察不同时间段LacZ基因的表达和分布情况及手术操作对听力的影响,为内耳基因治疗提供理论依据。方法 24只白色豚鼠术前及术后行听性脑干反应(ABR)检查。空白对照组经圆窗注入人工外淋巴液,实验组注入带有LacZ基因的腺病毒。分别于2天、l周、2周后取材。耳蜗标本经β-半乳糖苷酶(X-Gal)组织化学染色后做石蜡切片和耳蜗铺片。结果 腺病毒注入耳蜗后对听力影响不大。经X-Gal染色后整个耳蜗被染成蓝色。2天组表达产物最高,l周后逐渐降低。表达产物主要分布于柯蒂器的内外毛细胞、螺旋神经节细胞、基底膜下的间皮细胞。对照组均未着色。结论 通过圆窗注入腺病毒对听力没有影响,单一位点的接种就能使因子通过耳蜗液扩散到整个耳蜗。有效的基因转移在耳蜗是可行的,但表达相对短暂。     

Temporal bone histopathology in a patient suspected of inner ear extension of otitis media

We report the histopathological findings in the temporal bone of a 30-year-old female who died of cervical esophageal carcinoma. The temporal bone sections revealed severe bilateral suppurative labyrinthitis and otitis media that presumably occurred immediately before her death. Many inflammatory cells were present in the middle ear, particularly around the stapes and the round window niche. They had also infiltrated the inner ear via the annular ligament of the stapes and the round window membrane. Inflammatory cell accumulation was also observed in the peri- and endolymphatic spaces, and it was most severe in the basal turn. Most of the inner and outer hair cells were preserved, but some had degenerated or were missing. Numerous round cells were observed in the modiolus, and some of the spiral ganglion cells had degenerated. On the basis of these findings, we concluded that bacterial otitis media had extended in to the inner ear via the oval window and round window membrane and had resulted in suppurative labyrinthitis. These findings are consistent with those of stage II suppurative labyrinthitis according to the classification of Schuknecht.     

豚鼠环磷酰胺预处理后再免疫对其ABR阈值的影响

目的建制一高阳性率、可供圆窗给药治疗内耳病研究用的自身免疫性内耳病动物模型。方法采用270—370g重的白色红目豚鼠97只作为实验对象，其中32只用于制备粗制内耳抗原，47只经环磷酰胺腹腔注射预处理2d后，再用粗制内耳抗原行皮内多点接种。动物于接种后4、6、8、10、12、14、20d(分别为6、7、7、6、9,6、6只)接受听性脑干反应(ABR)检测。正常对照18只，组1(12只动物)不行任何处理，组2(6只动物)仅行环磷酰胺预处理，不行粗制内耳抗原接种。结果实验组动物接种后4d时ABR阈值升高10dB以上者为67％，8d时为86％．14d时仍为58％，接种后20d时所有动物ABR阈值恢复正常。结论将豚鼠用环磷酰胺预处理后，用粗制同种异体内耳抗原只需单次接种即可建立听力损害发生率高的自身免疫性内耳病动物模型。     

Dose-dependent effects of ouabain on spiral ganglion neurons and Schwann cells in mouse cochlea

Objective: This study aimed in fully investigating the toxicities of ouabain to mouse cochlea and the related cellular environment, and providing an optimal animal model system for cell transplantation in the treatment of auditory neuropathy (AN) and sensorineural hearing loss (SNHL).

Methods: Different dosages of ouabain were applied to mouse round window. The auditory brainstem responses and distortion product otoacoustic emissions were used to evaluate the cochlear function. The immunohistochemical staining and cochlea surface preparation were performed to detect the spiral ganglion neurons (SGNs), Schwann cells and hair cells.

Results: Ouabain at the dosages of 0.5?mM, 1?mM and 3?mM selectively and permanently destroyed SGNs and their functions, while leaving the hair cells relatively intact. Ouabain at 3?mM resulted in the most severe SGNs loss and induced significant loss of Schwann cells started as early as 7 days and with further damages at 14 and 30 days after ouabain exposure.

Conclusions: The application of ouabain to mouse round window induces damages of SGNs and Schwann cells in a dose- and time-dependent manner, this study established a reliable and accurate animal model system of AN and SNHL.