结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ基因载体治疗血友病B的安全性研究

目的 分析结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ(rAAV2/CMV-hFIX)基因载体治疗血友病B小鼠的安全性.方法 将rAAV2/CMV-hFⅨ(剂量为1×1013v.g/kg)结肠灌注血友病B模型小鼠,分别检测抗重组腺相关病毒2(rAAV2)抗体和抗人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)抗体,并通过组织病理学、免疫组化和PCR技术分析病毒和hFⅨ的组织分布.结果 灌注后,在小鼠体内能够检测到抗rAAV2抗体和抗hFⅨ抗体;组织病理学、免疫组化和PCR技术分析结果显示灌注部位肠组织无明显病理改变,rAAV2以及hFⅨ基因仅仅在灌注的肠上皮.结论 结肠灌注重组腺相关病毒基因治疗血友病B小鼠,在所观测时间内是安全的.     

人凝血因子Ⅸ基因（pKG5—Ⅸ）直接注入小鼠骨骼肌中瞬间表达的研究

我们将带凝血Ⅸ因子基因ｃＤＮＡ的ｐＫＧ５－Ⅸ裸ＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌内，注射后第１４天取小鼠血分离血清进行研究。结果显示：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析中能清晰地看到一与凝血因子ⅨｃＤＮＡ表达相关的特定蛋白带，进一步的实验Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ，ＥＬＩＳＡ及一期法有力地证实了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，人ＦⅨ基因转移小鼠出现５５ｋＤ特异带与人ＦⅨ相符，即证明它确系人ＦⅨ。     

小鼠胚胎干细胞凝血因子Ⅸ基因的定向敲除

目的：将小鼠胚胎干细胞凝血因子Ⅸ基因定向敲除，为建立血友病Ｂ的转基因小鼠模型奠定基础；摸索建立ＥＳ细胞基因打靶技术体系。方法：将线性化的针对小鼠ｍＦⅨ基因组的基因打靶置换型载体ＤＮＡ用电穿孔法转入小鼠ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，用ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交两种方法，鉴定药物抗性细胞中发生同源重组的情况。结果：（）从药物抗体细胞克隆中鉴定获得了４个发生了按所设计的方式进行了     

腺相关病毒与人α1干扰素基因重组体的构建

目的 构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因重组体。方法 用多聚酶链反应(PCR)方法扩增获得hIFNα1基因；以T-A克隆方法将PCR扩增hIFNα1基因亚克隆到PCR2，1质粒中，产生PCR2．1—hIFNα1；用EcoRI酶切PCR2．1—hIFNα1，后回收hIFNα1基因片断，将此片断连接到pWP8A的EcoRI位点上，构建重组体pWP8A—hIFNα1；pWP8A—hIFNα1转化JM109大肠杆菌扩增，hIFNα1基因经测序鉴定符合Genebank中hIFNα1序列，并用BanH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向。结果 经MR扩增获得567bp hIFNα1基因；构建重组体pWP8A—hIFNα1，经测序证实pWP8A—hIFNα1中的hIFNα1与Genebank中hIFNα1序列相同，用BamH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向正确的重组体pWP8A—hIFNα1。结论 成功构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因的重组体。     

人凝血因子Ⅸ基因直接注射入小鼠骨骼肌内表达的进一步研究

目的：观察人凝血因子ⅨｃＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌后的存在和表达部位。方法；采用免疫组化和酸杂交检测人Ⅸ因子ｃＤＮＡ注入小鼠肌肉后的存在和表达情况。结果：免疫组化和斑杂交显示肌注４周时有Ⅸ因子的蛋白质和ｍＲＮＡ表达，原位杂交显示肌注４周时局部肌细胞内仍有Ⅸ因子ｃＤＮＡ存在。结论：Ⅸ因子ｃＤＮＡ肌注４周时在局部细胞内仍存在的并有较高的表达。     

携带全长人极低密度脂蛋白受体基因的重组腺相关病毒的构建

目的构建携带全长人极低密度脂蛋白受体(very low-density lipoprotein receptor,VLDLR)基因的重组腺相关病毒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,从人的骨骼肌中提取RNA,合成cDNA,扩增人VLDLR全长基因5′端约1 000 bp的DNA,并以含人VLDLR基因片段的质粒为模板,合成人VLDLR全长基因近3′端约1 600 bp的DNA,通过粘端连接将2片段连接成全长VLDLR后,再将其连接到重组腺相关病毒包装系统的特定载体raav-UF1上,用293细胞作为包装细胞,配合重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)相关质粒:辅助质粒(phelp-er)和包装质粒(Pxx2),包装大量携带人VLDLR基因的重组腺相关病毒(raav-VLDLR-UF1),以含绿色荧光蛋白(greenfluorescence protein,GFP)基因的重组腺相关病毒(raav-GFP-UF1)为对照,测定raav-VLDLR-UF1及raav-GFP-UF1的滴度。结果raav-GFP-UF1和raav-VLDLR-UF1的滴度均为4×1011pfu/ml,达到实验要求。结论成功构建携带全长人VLDLR基因的重组腺相关病毒,有望为2型糖尿病高脂血症的基因治疗提供一种新的方法。     

重组AAV1/hFIX病毒制备及其体外转导培养细胞的实验研究

目的 制备携带人凝血因子IX基因的重组AAV1病毒(rAAV1/hFIX),体外转导C2C12细胞并检测hFIX的表达.方法 通过"一株栽体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV1/hFIX,体外转导C2C12细胞后,检测细胞上清中FIX的表达量.结果 制备出了高纯度的rAAV1/hFIX病毒,转导C2C12细胞24 h后在上清中即可检测到hFIX,连续检测了120 h都有表达,24 h最高表达量高达到(68.0±3.2)ng/24h.结论 制备的rAAV1/hFIX病毒在体外培养细胞中能高水平表达hF1X,为应用基因治疗裁体治疗血友病B的体内实验奠定了基础.     

重组腺相关病毒载体在心血管疾病基因治疗中的应用

腺相关病毒体是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒,重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,具有安全性好、宿主范围广等优点.rAAV已成为基因治疗研究的热点,特别是在心血管疾病机制探讨和治疗研究中应用广泛.在过去几十年里,rAAV在高血压、心力衰竭、动脉硬化和心肌梗死等心血管疾病基因治疗中成果显著.     

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs).方法从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI=10^2,10^3,10^4,10^5,10^6,10^7)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况.结果转染后10～14 d,eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%～2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率.在MOI=105的条件下转染后观察了61 d,eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5～0.6)%,33～61 d一直维持在这一水平.结论rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍.     

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的 探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法 从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI =102, 103, 104, 105, 106,107)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况。结果 转染后10~14 d, eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%~2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率。在MOI=105的条件下转染后观察了61 d, eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12~ 33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5~0.6)%,33~61 d一直维持在这一水平。结论 rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍。     

罗格列酮对内皮祖细胞增殖、黏附及迁移能力的影响

目的：观察罗格列酮（rosiglitazone,Ros）对体外培养内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）增殖、黏附及迁移能力的影响。方法：以密度梯度离心法获取脐血单个核细胞,培养7d后收集贴壁细胞并分为正常对照组、单独Ros（1μmol/L、5μmol/L及10μmol/L）组、H2O2（500μmol/L）氧化应激模型组、Ros（1μmol/L、5μmol/L及10μmol/L）和H2O2共同干预组,培养24h。用流式细胞仪检测细胞表达CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin并用荧光显微镜观察细胞吞噬DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1来鉴定EPCs。分别用CCK-8、普通光学倒置显微镜、改良的Boyden小室检测EPCs的增殖、黏附和迁移能力。结果：与正常对照组相比,单独Ros干预组呈浓度依赖性促进脐血来源的EPCs增殖、黏附及迁移能力（均P〈0.05）,但是Ros5μmol/L和10μmol/L组间没有显著差异（P〉0.05）;与H2O2氧化应激损伤组相比,Ros能呈浓度依赖性改善H2O2对EPCs增殖、黏附及迁移功能的抑制（均P〈0.05）,Ros5μmol/L和10μmol/L干预保护组之间没有显著差异（均P〉0.05）。结论：噻唑烷二酮（TZDs）类药物Ros除具有激动PPAR-γ受体降糖作用外,还具有抗氧化应激损伤作用。Ros能促进EPCs功能,改善H2O2致EPCs功能的氧化应激损伤。     

人VEGF 165基因转染大鼠内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组。ELISA检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响。结果FITC-UEA-Ⅰ和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且可促进EPCs的增殖,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

氧自由基对内皮祖细胞的损伤及槲皮素的保护作用

目的研究氧自由基对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的损伤及槲皮素(quercetin,Que)的保护作用。方法分离并诱导分化人脐血EPCs,随机分为对照组、过氧化氢(H2O2)组:加入500μmol/L的H2O2建立氧化应激损伤EPCs模型、Que干预组:先分别加入浓度为60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L的Que预处理30min后,后加500μmol/L H2O2共同培养。培养24h及48h后使用WST-1法观察EPCs增殖情况。结果与空白对照组比较,60～90μmol/L的Que可以促进EPCs增殖,120μmol/L的Que则表现出抑制EPCs增殖的作用,与培养24h比,在48h对EPCs的抑制作用较为明显。差异均有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,H2O2组EPCs增殖能力明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。加入60～120μmol/L的Que处理后,损伤后EPCs的细胞增殖能力得到明显改善,且具有明显的时间和浓度依赖性,与H2O2组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论氧化应激损害内皮祖细胞的增殖能力,而槲皮素有显著的改善作用。     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

川芎嗪对体外血管内皮祖细胞氧化损伤的保护作用

目的: 研究川芎嗪对过氧化氢(H2O2)诱导的内皮祖细胞(EPCs)氧化应激损伤的保护作用.方法: 采用密度梯度离心法获取兔外周血单个核细胞,EBM-2完全培养基诱导分化,并对培养7 d的细胞进行免疫荧光及免疫细胞化学方法分析.实验分为正常对照组、H2O2组及H2O2川芎嗪预处理组,以600 μmol*L-1H2O2诱导EPCs氧化应激损伤,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,测定细胞浆中丙二醛(MDA)含量和细胞培养液上清总超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)活力.结果: 兔外周血单个核细胞诱导培养7 d,Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)内吞和荆豆凝集素(FITC-UEA-1)双染色阳性,免疫细胞化学显示培养细胞CD31/CD34/VEGFR-2阳性,证实为EPCs;流式细胞分析显示,H2O2组细胞凋亡率明显高于对照组(P＜0.01),川芎嗪预处理组明显抑制H2O2 诱导的EPCs凋亡(与H2O2组比较,P＜0.05);H2O2可导致 EPCs MDA、LDH含量明显增加和SOD活性下降,而用川芎嗪预处理可明显抑制EPCs的氧化应激反应(与H2O2组比较,P＜0.05).结论: 川芎嗪对H2O2 诱导的EPCs氧化应激损伤有一定的保护作用,其机理可能与其抗凋亡和抗脂质过氧化有关.     

切应力诱导大鼠颈动脉内皮细胞组织因子表达的检测与分析

目的在体研究切应力诱导内皮细胞TF基因表达变化规律及其机制。方法54只SD大鼠随机分为对照组和颈动脉狭窄组,狭窄组有又分为0.5、1、3、6、12 h、1、3、7 d 8个时相点,套扎法建立左颈总动脉狭窄模型,术后不同时相点用原位杂交和免疫组化法检测TF、Egr、Sp-1的mRNA和蛋白,用图像分析系统测定内膜平均灰度,进行统计学分析。结果正常对照组内皮细胞TF、Egr-1、Sp-1的mRNA和蛋白弱表达,狭窄30 m in后,内皮细胞胞浆组织因子基因mRNA转录和蛋白合成升高,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。内皮细胞胞核和胞浆的Sp-1和Egr-1基因mRNA转录和蛋白合成均有显著性增加(P<0.05),但以Egr-1增加更显著(P<0.05),其变化趋势与组织因子基因mRNA转录、组织因子基因蛋白合成的变化趋势相同。TF mRNA和蛋白6 h达到峰值,Egr-1 mRNA和蛋白3 h达到峰值,Sp-1 mRNA和蛋白1 h达到峰值,与邻近组比较差异显著(P<0.05)。结论切应力是内皮细胞组织因子基因表达上调的触发因素之一,切应力激活TF与转录因子Egr-1和Sp-1介导有关。     

表达内皮抑素基因的内皮祖细胞治疗肝癌的初步研究

目的:观察内皮抑素(endostatin,ES)基因转染的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对小鼠肝癌细胞H22增殖的影响,探讨联合自体EPCs和ES基因治疗肝癌的可行性和有效性?方法:构建表达ES基因的慢病毒载体,培养小鼠骨髓源EPCs,运用qPCR检测培养内皮细胞表面标记CD31?血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)?血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)表达,电镜观察内皮细胞特征小体?实验分EPCs组?EPCs+LV空病毒载体组?EPCs+ES组?CCK-8法检测各组细胞增殖的情况?同时构建原位肝癌小鼠模型,尾静脉注射3组细胞后不同时间点处死小鼠,测量肿瘤大小并进行统计分析?结果:①酶切和测序?PCR鉴定证实成功构建慢病毒载体pLenti6.3-ES-Monomer-DsRed;②qPCR显示培养细胞表达内皮细胞标志CD31?VEGFR?vWF,透射电镜下在细胞质内可见多个散在内皮细胞特征性Weibel-Palade小体(WP小体);③慢病毒载体Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed转染小鼠骨髓源性EPCs后荧光显微镜下可见细胞呈红色荧光;EPCs+ES组细胞上清较对照组上清液对小鼠肝癌细胞H22体外增殖具有明显抑制作用,体内实验显示EPCs+ ES组肝癌生长速度慢于对照组?结论:小鼠骨髓源单个核细胞体外可以诱导培养为内皮祖细胞,负载ES基因的EPCs体外可以抑制小鼠肝癌细胞H22的增殖,体内可以抑制小鼠肝癌生长?     

血流剪切应力刺激后人脐带内皮细胞HIAP-2的表达

目的:阐明血流剪切应力抑制血管内皮细胞凋亡的分子机制.方法:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养于DMEM,细胞融合时将细胞暴露于2 N/m2的剪切应力,分别用Nortern blot及Western blot法检测人凋亡抑制蛋白2(HIAP-2)mRNA及蛋白的表达.结果:HUVECs在静止状态下表达少量HIAP-2mRNA及蛋白,在2N/m2的剪切应力2～6 h刺激下可诱导HUVECs产生HIAP-2mRNA,且量明显增加.HIAP-2蛋白在2 N/m2剪切应力4～24 h刺激下表达明显增加.结论:生理水平剪切应力能够明显诱导内皮细胞产生HIAP-2mRNA和蛋白的表达,可能是剪切应力抑制内皮细胞凋亡发挥抗动脉粥样硬化作用的机制之一.     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

血流剪切应力诱导人脐带内皮细胞HIAP-2的表达

目的生理水平的血流剪切应力有抑制内皮细胞的凋亡等作用进而发挥抗动脉粥样硬化作用,本研究目的是阐明血流剪切应力抑制血管内皮细胞凋亡的分子机制.方法人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养于DMEM,当细胞融合时将细胞暴露于20 dyne/cm2的剪切应力,分别用Northern blot及Westem blot法检测human inhibitor of apoptosis protein-2(HIAP-2)mRNA及蛋白的表达.结果 HUVECs在静止状态下表达少量mAP-2mRNA及蛋白,在20 dyne/cm2的剪切应力2～6 h刺激下可诱导HUVECs产生HIAP-2 mR-NA,且量明显增加.HIAP-2蛋白在20 dyne/cm2剪切应力4～24 h刺激下表达明显增加.结论本研究证实生理水平剪切应力能够明显诱导内皮细胞产生HIAP-2 mRNA和蛋白的表达,这可能是剪切应力抑制内皮细胞凋亡发挥抗动脉粥样硬化作用的机制之一.