shRNA抑制GC-C基因表达对人胃癌SGC-7901细胞生物学功能的影响

目的 研究靶向鸟苷酸环化酶C(GC-C)的短发夹RNA(shRNA)对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能的影响.方法 构建针对人GC-C基因的shRNA真核表达载体,将其转染人人胃癌SGC-7901细胞,采用半定量RT-PCR和Westem blotting法检测细胞中GC-C在mRNA和蛋白水平的变化.以CCK-8法、流式细胞术和原位末端标记法检测转染GC-CshRNA真核表达载体的SGC-7901细胞增殖、凋亡及细胞周期等生物学指标的变化.结果 经DNA测序鉴定,所得到的表达载体插入片段序列与GenBank中的序列一致.shRNA-GC-C真核表达载体转染能有效抑制GC-C基因的表达,以shRNA-GC-CⅢ序列的抑制效果最佳.转染GC-C shRNA真核表达载体后SGC-7901细胞的增殖能力受到抑制(P<0.05);细胞形态发生改变,细胞体积缩小,核固缩,染色质浓缩聚集于核膜;流式细胞术检测显示G7峰前出现亚二倍体峰,转染48、72h后凋亡率分别为5.47%和5.63%(P<0.05).结论 靶向GC-C基因的shRNA可有效抑制人胃癌SGC-7901细胞生长,并促进细胞凋亡,该作用与下调靶基因GC-C的表达有关;GC-C可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.     

锌带蛋白基因ZNRD1高表达胃癌细胞模型的建立

为建立高表达ZNRD1胃癌细胞模型，通过分子克隆技术将ZNRD1基因全长cDNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ 的多克隆位点之间，对重组质粒进行酶切鉴定，经显微注射将重组质粒导入人胃癌细胞SGC7901，G418筛选后应用Nothern blot检测ZNRD1基因的表达。结果经酶切鉴定证实正确地构建了真核表达质粒，转染SGC7901细胞后获得有效表达。表明已成功地构建ZNRD1基因真核表达载体，并经显微注射法建立了高表达锌带蛋白基因ZNRD1的胃癌细胞模型，为深入研究ZNRD1的作用和机制奠定了基础。     

siRNA表达载体对MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达抑制的研究

目的构建人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,探讨该载体对人乳腺癌MCF-7细胞生长及hTERT基因表达的影响。方法设计针对hTERT基因的干扰靶序列,构建siRNA重组表达质粒pGenesil-hTERT,将该质粒酶切测序鉴定后,以脂质体转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot技术分别检测hTERT基因及其蛋白的表达,MTT法观察转染后MCF-7细胞生长情况。结果酶切电泳和测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。该质粒转染MCF-7细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低,MCF-7细胞生长抑制。结论内源性短发夹状siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖生长,这也为肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

arresten cDNA在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及活性鉴定

目的：构建arresten cDNA的分泌型真核表达载体，将其转染人胃癌SGC-7901细胞，探讨arresten体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR法将小鼠Igκ链信号序列的60个碱基拼接至arresten cDNA的氨基端，并克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )，然后以脂质体法将重组pcDNA3．1( )-arresten转染SGC-7901细胞，Western印迹检测arresten的分泌表达，最后，提取SGC-7901细胞培养上清，采用内皮细胞增殖抑制试验鉴定上清中arresten活性。结果：成功构建了arresten cDNA的分泌型真核表达载体，获得可表达arresten的SGC-7901细胞系，真核表达的arresten具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。结论：arresten是一种有效的血管生成抑制剂，其cDNA的真核表达载体的成功构建为针对人类胃癌的arresten抗血管基因治疗研究奠定基础。     

端粒植入对胃癌SGC-7901细胞生物学行为的影响

目的研究外源端粒片段植入对胃癌细胞生物学行为的影响，初步探讨端粒影响细胞生物学活性的作用机制。方法大规模制备含有端粒片段的质粒pSXneo-1．6-T2AG3，采用LipofectAMIN^TM2000介导的转染方式，将质粒转染胃癌细胞SGC-7901，检测细胞周期、细胞形态、细胞生长曲线和细胞周期相关基因表达的改变。结果端粒片段能够成功导入SGC-7901细胞，获得稳定的细胞株。端粒片段植入后细胞生长变慢，异型性减少，S期细胞减少，G0／G1和G2M期细胞比例增加，增殖指数减小，P21mRNA表达明显高于SGC-7901细胞（P〈0．05），caspase-3 mRNA在各组细胞的表达无显著差异（P〉0．05）。结论携带了1600bp端粒TTAGGG重复序列的真核表达载体pSXneo-1．6-T2AG3能够稳定转染至人胃癌SGC-7901细胞中，使细胞增殖减慢，P21 mRNA表达上调，但对caspase-3 mRNA表达无明显影响。     

血管内皮生长因子C正、反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆血管内皮生长因子C（VEGF-C）基因,构建VEGF-C正、反义真核表达载体,鉴定并分析其基因序列。方法从处于对数生长期的人SGC-7901细胞中提取组织总RNA,用RT-PCR方法扩增出VEGF-C基因的正、反义全长cDNA。利用大肠杆菌转化并制备质粒pCI-neo和pcDNA3。分别用XbaI＋EcoRⅠ及HindⅢ＋EcoRⅠ双酶切两组质粒和VEGF-C cDNA,并将正、反义VEGF-C cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3和pCI-neo中。酶切鉴定、质粒双向测序鉴定重组基因。结果扩增出VEGF-C基因全长cDNA,大小约1.3kb。克隆出正、反义重组质粒为pcDNA3-sense VEGF-C,pCI-neo-antisense VEGF-C,电泳结果显示条带大小约6.8kb。碱基测序证实重组质粒中导入的DNA片段碱基序列与预期的设计路线相符且两片段互补、方向相反。结论正确克隆VEGF-C基因,成功构建了VEGF-C正、反义真核表达载体,为下一步研究反义VEGF-C转染VEGF-C基因高表达的肿瘤细胞后对其体外生长的影响创造了条件,也为进一步研究VEGF-C在胃癌新生淋巴管的形成和转移中的作用奠定了基础。     

靶向肿瘤腺病毒介导IL-24抑制人胃癌细胞增殖

目的 探讨人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子特异驱动IL-24的重组腺病毒（Ad-phTERT-IL-24）对人胃癌SGC-7901细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 将Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌SGC-7901细胞,采用荧光实时定量PCR及Western blot检测IL-24表达;采用CCK-8方法检测细胞生长曲线;采用Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 与以PBS代替病毒液处理的SGC-7901细胞相比,感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901细胞内IL-24 表达明显升高（P＜0.01）,于第5、6 d吸光度明显下降（P＜0.05）,细胞侵袭能力亦显著降低（P＜0.05）.结论 Ad-phTERT-IL-24可有效上调人胃癌SGC-7901细胞IL-24表达,进而抑制细胞增殖及侵袭能力.     

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素（ puromycin,puro）筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR,RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。     

ZNRD1基因的克隆及其反义核酸对胃癌耐药细胞阿霉素蓄积的影响

为获得ZNRD1基因的编友区序列，构建反义真核表达载体，通过检测ZNRD1基因反义核酸转染对胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR阿霉素（ADM）积蓄能力的影响，评价ZNRD1在抗胃癌细胞多药耐药性方面的应用前景。用PCR方法扩增目的基因序列，PCR产物经DNA序列测定证实后，采用分子克隆技术，将所获目的基因全长cDNA片段按反方向克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ 的多克隆位点之间，对重组质粒进行酶切鉴定。用脂质体介导法将ZNRD1反义核酸转染SGC7901／VCR，流式细胞仪（FACS）检测SGC7901／VCR细胞内阿霉素的蓄积量。结果应用PCR反应扩增出特异性片段，经DNA序列,下实与文献报道的ZNRD1基因编码区序列一致；构建了反义真核表达载体pcDNA3.1-ZNRD1；转染SGC7901／VCR细胞后，可提高细胞内ADM蓄积量。ZNRD1反义核酸转染后，胃癌多药耐药细胞株SGC7901／VCR对抗肿瘤药物ADM的积蓄作用提高，提示ZNRD1反义核酸具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

siRNA真核表达载体构建及对细胞MSTN基因抑制的研究

肌肉生长抑制素是肌肉生长的负调控因子。本研究为了得到有效抑制绵羊MSTN基因的siRNA分子,设计8对siRNA寡聚核苷酸引物,经退火与pSilencerTM4.1-CMV neo连接构建siRNA真核表达载体,转染C2C12细胞后,利用RT-PCR及real time PCR检测干扰效果。结果显示,8条siRNA分子中有3条对MSTN基因有显著的抑制作用,其中psi-mstn-717和psi-mstn-986分子对MSTN mRNA抑制效率分别达到61%和53%。本研究证实载体表达siRNA能有效抑制细胞MSTN mRNA的表达,下一步筛选的siRNA将用于体内实验。     

miR-29a抑制胃癌细胞内靶基因VEGF-A的表达及意义

目的 验证胃癌细胞株SGC-7901内miR-29a对靶基因VEGF-A的直接调控作用.方法 采用负载miR-29a的腺病毒载体（Ad-miR29a）感染人胃癌细胞株SGC-7901,上调SGC-7901细胞内miR-29a的表达丰度后,采用RT-qPCR及Western blot法分别检测SGC-7901细胞内VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达;进一步采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-29a是否通过结合在VEGF-A 3＇UTR而直接抑制靶基因表达.结果 与感染阴性对照Ad-LacZ的SGC-7901细胞相比,感染Ad-miR29a的SGC-7901细胞内VEGF-A蛋白表达下降（0.42±0.02 vs.0.91±0.03,P＜0.01）,且VEGF-A mRNA水平亦下调（0.75±0.21 vs.1.15±0.25,P＜0.05）;荧光素酶实验显示,与阴性对照相比,转染miR-29a mimic后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性明显下降（0.56±0.13 vs.0.93±0.06,P＜0.05）;而在VEGF-A 3＇UTR与miR-29a的结合位点被突变之后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性得以恢复.结论 miR-29a通过结合于VEGF-A 3＇UTR相应位点,直接抑制VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达.miR-29a可能成为胃癌基因治疗的有效靶标.     

洛铂抑制胃癌SGC-7901细胞增殖及其机制的初步研究

目的观察洛铂对胃癌细胞SGC-7901细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法将对数生长期的SGC-7901细胞分阴性对照组（不加药物）和实验组（加入不同浓度洛铂）,采用倒置显微镜观察不同浓度下细胞生长状态;MTT法观察对细胞的增殖抑制;Western印迹方法分析不同浓度洛铂对SGC-7901细胞内Bcl-2蛋白表达水平的影响。结果倒置显微镜下观察,洛铂能抑制细胞增殖,出现明显的凋亡学形态特征。MTT法显示洛铂能抑制细胞增殖,并呈浓度及时间依赖关系。Western印迹结果显示洛铂能使SGC-7901细胞Bcl-2蛋白表达水平下降。结论洛铂能明显抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,诱导凋亡,可能与调节SGC-7901细胞Bcl-2蛋白表达水平相关。     

人端粒相关蛋白T-STAR的克隆及其与端粒酶催化亚单位hTERT的相互作用研究

目的克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用。方法构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与报告质粒共转染入胃腺癌细胞株SGC-7901,以pM-53 pVP16-T、pM3-VP16为阳性对照,以pM53 pVP16-CP为阴性对照;以pM-hTERT pVP16、pM pVP16-T-STAR、pM pVP16为交叉阴性对照。ELISA法检测报告基因CAT的表达。结果成功构建真核表达载体pGBKT7-hTERT,将获得的阳性克隆测序,并进行同源性比较证实为是已收录的人cDNA序列T-STAR。pGBKT7-hTERT和pVP16-T-STAR共转染之后,报告基因CAT的表达(A值为0.258)显著高于阴性对照(A值为0.002~0.015)。结论T-STAR与hTERT在胃癌细胞内发生了相互作用,T-STAR可能是人端粒相关蛋白新成员,通过hTER参与端粒酶活性的调控。     

MGr1-Ag表达上调及下调的胃癌细胞株的建立及鉴定

为研究胃癌细胞耐药相关新基因MGr1 Ag对胃癌耐药细胞多药耐药性的调节作用及其机制。克隆MGr1 Ag的全长cDNA并构建其正反义真核表达载体 ,以脂质体介导法将正、反义真核表达载体分别转染入人胃癌细胞系MGC80 3与人胃癌多药耐药细胞系SGC790 1/VCR中。结果显示 ,经RT PCR扩增出大小约为 1.0kb的基因片段 ,成功克隆入pUCm T载体 ,经DNA测序证实为MGr1 Ag基因。将其克隆入pCDNA3 .1/V5 His后 ,经限制性核酸内切酶酶切鉴定 ,获得携有MGr1 Ag基因真核表达载体pCD NA3 1/V5 His MGr1 Ag及其反义表达载体pCDNA3 .1/V5 His anMGr1 Ag。以脂质体介导法将MGr1 Ag的正、反义真核表达载体分别转染入MGC80 3与SGC790 1/VCR中 ,经Westernblot证实 ,成功建立了MGr1 Ag表达上调及下调的胃癌细胞株 ,为研究MGr1 Ag参与耐药的分子机制奠定了基础