稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

人肺癌细胞γ-干扰素基因的转染及特性分析

目的:建立转基因A549细胞株,从特性上进行分析,探讨其作为抗肿瘤瘤苗的可能性.方法:将pLXSN质粒与人IFN-γ基因体外重组,转染入人肺腺癌细胞株A549中,经筛选获得稳定表达γ-干扰素的A549-IFN-γ细胞株,对其生长特性、细胞表面MHC分子表达变化、IFN-γ的分泌量及致瘤性等方面进行了探讨.结果:转基因细胞株与原细胞株相比较,生长状态没有明显的变化,转基因细胞株可稳定表达并向细胞外分泌γ-干扰素;而且其细胞表面MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达明显增加,提示其免疫原性增强;裸鼠实验表明其致瘤性下降.结论:该转基因细胞株有可能成为治疗肺癌的转基因瘤苗.     

人IL4基因转染胃癌细胞及其表达

目的：评价人ＩＬ４ｃＤＮＡ转染胃癌细胞株分泌ＩＬ４的可行性和γ射线照射的安全性。方法：用脂质体转染法将人ＩＬ４ｃＤＮＡ转入ＳＧＣ－７９１０胃癌细胞株，并检测细胞分泌的Ｉ力５０Ｇｙγ射线照射对肿瘤细胞分泌的影响。结果：人ＩＬ４ｃＤＮＡ可以转入人胃癌细胞，并表达有活性ＩＬ４基因转染可以明显增强ＩＬ２激活的ＬＡＫ细胞的肿瘤杀伤作用。用大剂量的γ射线照射后，转染细胞仍可以持续分泌ＩＬ４３－４周。结论：人     

稳定表达外源野生型p53基因人胆囊癌细胞系的建立和鉴定

目的：建立稳定表达外源野生型p53（wtp53）基因的人胆囊癌细胞系。方法：在脂质体lipofectamine^TM 2000介导下，将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入胆囊癌细胞系GBC—SD中。经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应（PCR）证实外源野生型p53基因的整合，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果：野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC—SD，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论：GBC—SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。     

大肠杆菌偏嗜性人γ干扰素基因编码序列的克隆

目的：获得适于大肠杆菌表达的人γ干扰素(hlFN-γ)基因。方法：用大肠杆菌偏嗜性密码子替换已知hlFN-γ基因编码序列中相应的密码子，将重新设计后的编码序列分为六段进行人工化学合成，通过PCR拼接技术扩增出大肠杆菌偏嗜性hlFN-γ基因编码序列，并进行克隆及序列分析。结果：经序列分析证实，重组pGEM—hlFN-γ质粒含有与预期结果一致的hlFN-γ基因编码序列。结论：成功进行了大肠杆菌偏嗜性hlFN-γ基因的克隆，为hlFN-γ基因的体外高表达奠定了基础。     

逆转录病毒介导γ—干扰素基因修饰人肝癌细胞的建立

目的 建立γ－干扰素基因修饰人肝癌细胞。方法 以逆转录病毒载体ＬＸＳＮ将人原γ－干扰素基因转录入四种不同的人肝癌细胞株,经Ｇ４１８筛选均获得了抗性克隆。结果 基因组ＤＮＡ ＰＣＲ和细胞总ＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ结果均明显ＩＦＮ－γ基因已在染色体ＤＮＡ中整合并表达,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交进一步证实了目的基因的正确整合和表达。ＩＦＮ－γ生物活性检测结果表明,在基因修饰的四种不同个体人肝癌细     

转染人血纤溶酶原Kringle 5基因对人胰腺癌PC3细胞的影响

目的　将人血纤溶酶原Kringle 5基因导入人胰腺癌PC3细胞 ,观察其对人胰腺癌PC3细胞系的基因治疗作用。方法　将外源性Kringle 5通过脂质体转染法导入人胰腺癌PC3细胞 ,筛选阳性克隆 ,同时设空质粒组及PC3细胞为对照。采用RT PCR、免疫组织化学、MTT、电镜、流式细胞术等方法 ,鉴定及检测转染前后细胞超微结构、细胞周期及Kringle 5蛋白表达情况 ,并用血管内皮细胞增殖实验及裸鼠接种检测目的胰腺癌细胞株表达的Kringle 5蛋白抑制血管内皮细胞生长的活性及裸鼠移植瘤生长情况。结果　人血纤溶酶原Kringle 5基因及蛋白水平在胰腺癌PC3细胞系均可以稳定表达 ,能抑制ECV30 4血管内皮细胞生长及具有抑制裸鼠移植瘤生长的作用。结论　成功转染人Kringle 5基因的人胰腺癌PC3细胞可稳定表达Kringle 5蛋白 ,且具有抗血管内皮细胞增殖活性的良好作用 ,为进一步进行体内抗血管生成基因治疗奠定了基础。     

人γ-干扰素真核表达载体的构建及其体外抑制HBV的作用

目的 观察携带人γ干扰素(IFN-γ)基因的真核表达载体(pcDNA3.1-IFN-γ)体外转染hepG2.2.15细胞后抑制乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 利用PCR技术和基因重组方法构建表达人IFN-γ的真核表达载体,体外转染hepG2.2.15细胞后收集细胞培养上清液,用ELISA法检测人IFN-γ蛋白的分泌量.并分别用荧光定量PCR和ELISA试剂盒检测细胞培养上清中病毒释放的HBV-DNA和HBeAg、HBsAg抗原含量.结果 转染pcDNA3.1-IFN-γ组细胞HBeAg含量比空载体阴性对照组和空白2.2.15细胞对照组下降了49%,而两个对照组间HBeAg含鼍无显著差异;HBsAg含量比宅载体阴性对照组下降了35%、比空白2.2.15细胞对照组下降了33%,两个对照组问HBsAg含量无显著差异.同时,转染pcDNA3.1-IFN-γ组细胞上清中HBVDNA含量比两个对照组均显著降低,而对照组间HBVDNA含量无显著差异.结论 成功构建了人IFN-γ真核表达载体并可以在体外有效抑制HBV复制,为将人IFN-γ应用于抗HBV的基因治疗奠定基础.     

大鼠γ-干扰素基因转染大鼠肺泡巨噬细胞和气道上皮细胞的实验研究

目的：构建重组大鼠γ－干扰素真核表达载体，探讨其转染大鼠肺泡巨噬细胞（AM）和气道上皮细胞的可行性及表达水平。方法：采用RT－PCR技术克隆了大鼠γ－干扰素，并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN上，构成真核表达重组载体，将重组载体转染培养的AM和气道上皮细胞，用PCR法鉴定重组载体整合在细胞基因组DNA中，并检测细胞培养上清中γ－干扰素浓度和活性。结果：DNA测序证明，构建的重组载体中γ－干扰素的基因方向正确，DNA序列与Gene Bank中大鼠的γ－干扰素cDNA序列相同，转染后AM和气道上皮细胞基因组DNA的PCR产物电泳可见转染的重组载体DNA片段条带，pLXSN-IFN载体组的AM和气道上皮细胞培养上清中大鼠γ－干扰素学和活性显著高于pLXSN空载体组（P＜0．01）结论：本研究构建的大鼠γ－干扰素重组表达载体可成功地转染大鼠AM和气道上皮细胞，整合入基因组DNA，并分泌有活性的γ－干扰素，为进一步的体内基因转染研究奠定基础。     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901／V …

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体，经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，并检测ｂａｘ基因在转导株的表达。方法 采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ｃｍｖ的多克隆位点之间，以脂质体倡导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，Ｇ４１８筛选克隆细胞，Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达。结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ，将之转入细胞后，经Ｇ４１８筛选３０ｄ     

SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

目的：利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系．方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株．采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化．结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制．结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法．     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

含重组人血小板生成素基因的小鼠成纤维细胞的克隆筛选与鉴定

目的:获取稳定表达重组人血小板生成素(thrombopoie tin, TPO)的NIH3T3成纤维细胞克隆,为开展成纤维细胞介导的TPO基因治疗研究提供细胞学基础.方法:以重组人T PO cDNA为目的基因, 构建真核细胞表达重组体pcDNA3/TPO,藉脂质体将其转染于NIH3T3细胞,经G418筛选,获得稳定表达重组人TPO的细胞克隆,应用PCR、RT-PCR及Western印迹等技术鉴定目的基因的导入及表达.结果:pcDNA3/TPO可藉脂质体转染NIH3T3细胞,转染细胞可稳定表达并分泌TPO.结论:已获得所需细胞克隆,为应用人TPO cDNA进行基因治疗奠定了基础.     

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染人卵巢癌细胞的生物学特性

目的：将β-葡萄糖醛酸苷酶(βG)基因转入卵巢癌细胞系3AO，建立高表达BG的卵巢癌细胞模型，并观察转染细胞的生物学特性．方法：构建真核表达的逆转录病毒载体pcDNA3．1-βG，利用阳离子脂质体将其转入人卵巢癌细胞株，用mRNA打点杂交、Western Bloling鉴定其转录与表达水平，并通过检测细胞生长、增殖及形态学的变化观察转染细胞的     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株，研究野生型ｐ５３蛋白在诱导瘤细胞凋亡中的作用。方法：用ＤＮＡ转染技术将７重组野生型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ８６０３中，用ＰＣＲ技术监测外源性ｐ５３基因在瘤细胞中存在的稳定性；用免疫组化方法检测在地塞米松的诱导下瘤细胞中ｐ５３的表达情况；用相差显微镜去观察凋亡瘤细胞的形态特点；用细胞凋亡原位检测技术标记并统计凋亡的瘤细胞数。结果：成功地将重组野性型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ８６０３中，在ｇｐｔ选择培养基中培养两周后，分离生长出阳性细胞克隆；经ＰＣＲ证实外源性ｐ５３基因在瘤细胞内稳定存在并可随瘤细胞分裂而传给子代；当向培养液中加入１μｍｏｌ／Ｌ地塞松（Ｄｅｘ）后，８ｈ即可用免疫组化方法检测到ｐ５３蛋白的表达并可观察到瘤细胞出现凋亡的一系列形态学改变，转染后的瘤细胞凋亡率高达９０％。结论：当人骨肉瘤细胞株中重组野生型ｐ５３基因诱导过表达时，瘤细胞呈现凋亡，本实验为骨肉瘤的基因治疗提供了理论依据。     

尾静脉高压注射质粒DNA后体内表达的规律

目的研究小鼠尾静脉高压注射质粒DNA后，目的基因在体内分布表达的规律，以及该方法的转基因效率。方法将LacZ质粒按小鼠体重比稀释到一定的PBS中，经尾静脉快速高压注射导入小鼠体内，通过X-gal染色的方法在不同时间点观察目的基因在肝脏和其他脏器中的分布规律。结果含有CMV启动子的LaeZ裸质粒经小鼠尾静脉高压注射途径导入体内，24h后即开始表达，第3天出现表达高峰，1周后表达消失，基因转染率达5％-6％；用脂质体包裹质粒DNA后，再进行尾静脉高压注射，质粒在肝脏的表达效率可达18％-20％。结论应用尾静脉高压注射脂质体／质粒DNA复合物途径，目的基因在小鼠肝脏获得高效表达，该方法可以广泛应用于基因治疗的实验研究。     

利用RNA干扰技术沉默p53基因突变子175H的效果评价

目的：在p53基因缺失型细胞株H1299中转染p53基因突变子175H,构建H1299-175H细胞模型,并观察小发夹环RNA（shRNA）的基因沉默效果。方法：采用引物重叠PCR定点突变技术合成p53基因突变子175H,并利用基因重组技术构建出表达载体,以脂质体转染法建立细胞模型;合成针对p53-175H的shRNA并构建出反转录病毒表达载体Psuper-175HR,应用磷酸钙共沉淀法导入包装293T细胞,并收集假病毒颗粒感染H1299细胞。应用Western blotting法检测P53蛋白表达。结果：转染p53基因突变子175H的H1299-175H细胞模型P53蛋白表达阳性;H1299-175H细胞模型转染shRNA后,P53蛋白表达下调。结论：成功构建H1299-175H细胞模型;构建的Psuper-175HR基因沉默载体可以有效地抑制p53基因突变子175H的表达。     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子，并观察hTERT启动子调控下tk／GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物，以HepG2基因组DNA为模板，用PCR方法扩增hTERT启动子；分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体：将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后。通过RT—PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况；用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp～ 40bp的核心启动子。RT-PCR和B-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达．hTERT启动子调控的tk／GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞，表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

重组人细胞因子基因在转基因中药细胞中的瞬时表达

目的 利用转基因中药表达人细胞因子基因，探讨培育基因修饰（GM）中药的可行性，方法 将体外扩增分别获得的人α-干扰素基因与RANTES基因酶切回收后插入中间载体，用EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定重组子，由大肠杆菌分离重组质粒并导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens，通过加入卡那霉素（Km)和利福平（Rif)筛选含重组双元载体的转化子，用叶盘共培养法转化苦瓜和夏枯草外植体。结果 经RT-PCR检测到人α-干扰素基因与RANTES基因在中药转化愈伤组织中的瞬时表达。结论 首次报道了重组人α-干扰素基因与RANTES基因在转基因苦瓜和夏枯草细胞中的表达。为探讨利用转基因中药抗病毒尤其是抗艾滋病开创了新途径。     

降钙素基因相关肽基因体外转染人脐静脉内皮细胞

目的：观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ,ＣＧＲＰ）基因对人脐静脉内皮细胞的作用,探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建含有ＣＧＲＰｃＤＮＡ的逆转录病毒载体,体外转染人脐静脉内皮细胞。用ＲＴＰＣＲ及放射免疫法分析检测基因表达水平。应用细胞计数及流式细胞仪观察ＣＧＲＰ基因对内皮细胞生长的影响。结果：逆转录病毒载体能有效地将外源性基因导入血管内皮细胞并稳定表达。导入ＣＧＲＰ基因可以促进内皮细胞的分裂增殖,从而加速损伤内皮的修复。结论：ＣＧＲＰ基因有可能作为动脉粥样硬化及再狭窄基因治疗的有效候选基因