单纯疱疹病毒1型糖蛋白gD的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)糖蛋白D(glycoprotein D,gD)并制备多克隆抗体。方法双酶切pcDNA 3.1-HSV1-gD和pFastBacTM I质粒,gD基因克隆到pFastBacTM I载体,连接产物转化E.coli DH10Bac感受态细胞并鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD。将构建正确的重组杆粒转染Sf9细胞包装杆状病毒。杆状病毒经传代扩增后,诱导重组gD蛋白的表达,使用Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组gD蛋白,进行15%SDS-PAGE电泳鉴定并采用肽指纹图谱分析纯化的gD蛋白。将纯化的gD蛋白进行热稳定性试验检测其在不同缓冲液条件下的稳定性。用重组gD蛋白免疫小鼠,利用ELISA法检测血清抗体滴度。结果成功构建重组质粒pFastBacTM I-gD,转化E.coli DH10Bac感受态细胞后,经蓝白斑筛选鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,鉴定正确的重组质粒感染Sf9细胞,包装出重组杆状病毒,获得滴度为8×108 pfu/ml的P3代杆状病毒。重组杆状病毒再次感染Sf9细胞能够表达高纯度可溶性的重组gD蛋白。不同缓冲液条件下重组gD蛋白稳定性良好。用gD蛋白免疫小鼠,获得ELISA效价为1×105的多克隆抗体。结论成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,表达的HSV-1 gD蛋白稳定及免疫原性良好,制备的抗gD蛋白多克隆抗体滴度高,为HSV-1的亚单位疫苗的制备鉴定了基础。     

EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2A对胃癌细胞增殖的影响

目的:构建EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的腺病毒表达载体,探讨LMP2A表达对胃癌细胞的作用.方法:RT-PCR扩增获取目的基因LMP2A,采用AdEasy系统构建携带目的基因的重组腺病毒载体pAd-2A,脂质体法将重组质粒pAd-2A转染HEK293细胞包装重组腺病毒.用重组腺病毒感染靶细胞SGC(胃癌细胞),通过MTT实验、流式细胞分析、激光共聚焦检测目的基因LMP2A表达对靶细胞增殖的影响.结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实,目的基因LMP2A正确插入重组质粒,HEK293细胞成功包装出具有稳定感染性的重组腺病毒,命名为vAd-2A,经测定病毒滴度为3.16×10~(12)pfu/L.MTT实验、流式细胞分析以及激光共聚焦检测结果显示,感染腺病毒vAd-2A的SGC细胞增殖旺盛(感染vAd-2A细胞vs感染vAd细胞和未感染病毒细胞,P<0.01),S期细胞比例升高(24 h:35.2%±5.1%vs 14.0%±3.4%,13.2%±4.6%,P<0.01;48 h:25.6%±4.1%vs 12.9%±2.6%,12.5%±3.2%,P<0.01),LMP2A可诱导细胞周期调节蛋白cyclinE的表达.结论:成功构建了EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的重组腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒,同时证实LMP2A可通过诱导cyclinE的表达促进SGC细胞增殖.     

人基质金属蛋白酶-1的基因克隆、表达及其产物抗原性的分析

目的 构建人基质金属蛋白酶-1(MMP-1)基因重组质粒的克隆，获得具有抗原性的人MMP-1融合蛋白。方法 从人肝组织提取总RNA，以此为模板，逆转录巢式PCR扩增MMP-1全编码区基因片段，构建含目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达MMP-1重组质粒菌，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot对重组蛋白进行分析鉴定。结果 经核苷酸序列测定和免疫印迹鉴定，成功地构建了人MMP-1重组质粒基因工程菌，并表达具有MMP-1抗原性的融合蛋白。结论 构建了人MMP-1重组质粒克隆，获得了具有抗原性的MMP-1融合蛋白，这将有助于今后制备MMP-1多克隆抗体。     

大鼠ANT1基因腺病毒载体的构建及体外表达

目的 构建大鼠线粒体蛋白ANT1基因的腺病毒载体,并检测其在体外培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达.方法 将大鼠线粒体膜蛋白腺(嘌呤核)苷酸移位酶(adenine nucleotide translocase,ANT)1基因片段克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV上,在细菌中将穿梭质粒和pAdXsi载体进行重组,经脂质体转染HEK293细胞对重组腺病毒包装、扩增,用其感染体外培养的VSMC.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,荧光显微镜观察转染效率.用Western印迹检测转染后ANT1在VSMC中的表达.结果 酶切鉴定及PCR结果表明ANT1基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达2×1011 pfu/ml,Western印迹检测ANT1在VSMC中表达明显高于对照组(P<0.05).结论 成功构建了含大鼠ANT1基因的重组腺病毒载体并在VSMCs有效表达,为以后将Ad-ANT1应用于VSMCs凋亡的研究奠定了基础.     

2型猪链球菌中国强毒株溶血素样蛋白基因的原核表达及其抗血清制备

目的克隆2型猪链球菌溶血素样蛋白(Hemolysin-like protein,HLP)编码基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测多抗血清。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的抗血清。结论在原核系统中成功地表达了hlp基因编码的蛋白,并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究hlp基因的功能奠定了基础。     

腺病毒介导的环氧合酶-2反义RNA对肝癌细胞株生长的影响

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)的表达与肝癌的关系,并构建表达人COX-2反义RNA的腺病毒载体,研究其对人肝癌细胞生长的抑制作用。方法采用免疫组织化学法探讨34例肝癌组织COX-2 的表达与肝癌病理特征的关系。采用基因重组法把人COX-2的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码COX-2反义RNA的重组腺病毒--Ad-AShcox-2。经聚合酶链反应法鉴定为阳性克隆者大量扩增、纯化,转染人肝癌细胞株SMMC-7402和SMMC-7721,采用免疫细胞化学、细胞集落形成率及流式细胞术检测其对肝癌细胞生长、凋亡及细胞周期分布的影响。结果34例肝癌组织中有28例COX-2高度表达,阳性率达82.4%; COX-2的表达水平与肝癌的病理分级有关,与甲胎蛋白、细胞类型、有无肝内转移无关。成功构建、扩增、纯化得到编码COX-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,滴度达1.06×1012PFU/ml;Ad-AShcox- 2转染两种肝癌细胞株后,发现高度表达COX-2的SMMC-7402 COX-2表达水平明显降低,细胞凋亡率明显增加,出现G1期阻滞,与Ad-LacZ组及空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);而不表达COX- 2的SMMC-7721变化不明显。细胞集落形成实验显示SMMC-7402细胞集落形成率较低(2.7%±0.94%); 而SMMC-7721     

不同型别登革病毒融合外膜基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建登革病毒1型和2型外膜蛋白(E蛋白)DⅢ区融合基因的重组腺病毒,在BHK-21细胞中表达。方法用PCR法扩增登革病毒1型和2型EDⅢ基因,依次克隆入pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCDNA-D1/D2EDⅢ。以此为模板,扩增包含CMV启动子-D1/D2EDⅢ-BGHpA的表达片段,与pENTR4载体连接形成质粒pENTR4-D1/D2EDⅢ,与pAd/PL-DEST进行体外同源重组,形成重组腺病毒载体pAd-D1/D2EDⅢ,在293A细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒,进一步感染BHK-21细胞,用间接免疫荧光法和Westernblot法检测重组蛋白在细胞中的表达情况。结果重组腺病毒构建成功,转染293A细胞后获得2×109pfu/mL滴度的重组腺病毒,感染哺乳动物细胞后能够表达1型和2型EDⅢ区目的蛋白。结论不同型别融合基因的重组腺病毒表达载体能有效地表达相应型别的目的蛋白,为进一步构建单一的四价重组腺病毒应用于登革疫苗研究奠定基础。     

猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备

目的通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体。方法采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度。结果covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应。结论成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coliBL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础。     

BVDV-1 VLPs的构建及免疫原性研究北大核心CSCD

目的利用C、E0、E1和E2蛋白构建BVDV病毒样颗粒,并评价BVDV-1 VLPs的免疫原性。方法以BVDV-BA株为模板通过反转录得到C、E0、E1和E2基因,再将C、E0、E1和E2基因分别克隆至PEASY-Blunt Simple克隆载体上。提取质粒摇菌扩大培养,将得到的C、E0、E1和E2基因克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10.Bac大肠埃希菌感受态细胞,通过蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-C、rB-E0、rB-E1和rB-E2。将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒;再用构建的4种重组杆状病毒同时感染SF9悬浮细胞,72 h后收集细胞沉淀进行超声破碎,利用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过Western blot和透射电镜进行鉴定。将获得的BVDV-1 VLPs联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体水平评价VLPs的免疫原性。结果成功克隆出C、E0、E1和E2基因,并构建C、E0、E1和E2蛋白的杆状病毒。通过纯化和鉴定,在20%~30%蔗糖层获得由C、E0、E1和E2蛋白组成结构完整的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。BVDV-1 VLPs能够显著增加免疫小鼠的特异性抗体表达水平。结论构建并获得了由C、E0、E1和E2蛋白组成,并具备良好免疫原性的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。     

S1P2受体shRNA腺病毒载体的构建及筛选

目的 为探讨S1P2受体介导血管内皮细胞衰老的机制,构建和筛选特异性S1P2受体shRNA腺病毒载体.方法 设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle载体,测序正确后经脂质体介导转染人肺动脉内皮细胞(HPAEC),通过RT-PCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,提取质粒DNA,经双酶切,回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段,亚克隆到腺病毒表达载体(pAdeno-X),筛选出正确重组子,转染HEK 293A细胞,收集重组的腺病毒,测定病毒滴度,通过Western blot方法检测S1P2受体沉默效果.结果 测序结果证实所构建的pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA质粒正确,并从4对ds oligos筛选出对S1P2受体沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,经亚克隆到腺病毒表达载体.转染人肺动脉内皮细胞后,Western印迹检测显示构建的腺病毒载体pAdeno-shRNA对S1P2受体蛋白的沉默有明显效果.结论 成功地构建和筛选出介导特异性shRNA-S1P2的重组腺病毒.     

人乳腺癌细胞中HPV16 E6/E7与COX-2表达的关系

目的 探讨人乳腺癌细胞中高危型人乳头瘤病毒16型(HPV16) E6/E7与COX-2表达的关系.方法 以HPV16 E6/E7表达阴性的人乳腺癌细胞系MCF-7和分别稳定高表达HPV16 E6、E7和同时高表达E6/E7的乳腺癌细胞系MCF-7-E6、MCF-7-E7、MCF-7-E6/E7及空转细胞MCF-7-vec为研究对象,通过RT-PCR和Western印迹方法检测各乳腺癌细胞系中COX-2基因及蛋白的表达情况.结果 所有细胞系中COX-2 mRNA及蛋白均有阳性表达,且MCF-7-E6、MCF-7-E7和MCF-7-E6/E7细胞中的表达水平要显著高于MCF-7-vect和MCF-7亲本细胞(mRNA:F=135.236,P ＜0.01;蛋白:F =146.125,P＜0.01),而MCF-7-E6、MCF-7-E7和MCF-7-E6/E7细胞中COX-2 mRNA及蛋白的表达水平无显著性差异,MCF-7-vect空转和MCF-7亲本细胞中COX-2 mRNA及蛋白的表达水平也无显著性差异.结论 人乳腺癌中HPV16 E6/E7与COX-2的表达间可能存在密切关系.     

GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白原核表达及蛋白纯化

目的利用原核表达系统,表达了GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白,优化诱导条件并进行蛋白的纯化。方法扩增诺如病毒的VP1基因,克隆至pET32a(+)载体,构建重组质粒pET32a-VP1。将pET32a-VP1转化至大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG进行诱导表达并优化诱导条件。利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。结果成功扩增大小为1 659 bp的诺如病毒VP1基因。PCR检测重组质粒pET32a-VP1构建成功。将重组质粒转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达70×10~3的VP1重组蛋白,优化的最佳诱导表达条件为37℃,0.6 mmol/L IPTG诱导5 h。重组蛋白以包涵体的形式表达,并SDS-PAGE鉴定镍柱纯化产物为单一电泳条带的目的蛋白。结论利用原核表达系统成功构建了重组质粒pET32a-VP1,并表达纯化了诺如病毒VP1重组蛋白,为单克隆及多克隆抗体的制备、检测试剂盒以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin多克隆抗体的制备及鉴定

目的 原核表达刚地弓形虫过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin,Prx)并制备多克隆抗体。方法 PCR技术扩增弓形虫cDNA中的prx基因,克隆至pET-28a(+)载体,构建prx/pET-28a(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)Rosetta中诱导表达。亲和层析纯化重组Prx蛋白,并制备兔多克隆抗体,蛋白印迹技术对多克隆抗体进行鉴定。结果 成功从弓形虫cDNA中扩增出prx目的基因,构建了prx/pET-28a(+)重组质粒,获得抗Prx重组蛋白的多克隆抗体。蛋白印迹技术检测出弓形虫Prx的特异性条带。结论 重组弓形虫Prx制备的多克隆抗体能检测Prx在弓形虫速殖子表达。     

2型猪链球菌低分子量酪氨酸磷酸酶的制备及酶学研究

目的 表达纯化2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)低分子量酪氨酸磷酸酶(Low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP),测定LMW-PTP磷酸酶活性并鉴定其酶活性位点,为后续的功能鉴定奠定基础。方法 分别构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A和pET28a:LMW-PTPR39A,重组质粒转化E.coil BL21(DE3),筛选阳性转化子,通过IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定表达产物。镍柱亲和层析纯化得到重组蛋白经Western blot鉴定,野生型LMW-PTP免疫新西兰兔制备兔多克隆抗体。以对硝基苯酚二钠六水(PNPP-Na)为底物检测重组蛋白的磷酸酶活性。结果 成功构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A、pET28a:LMW-PTPR39A,在大肠杆菌中野生型和突变型LMW-PTP均以包涵体的形式存在,相对分子量为23 kDa,包涵体经镍柱纯化及透析复性获得纯度较高的野生型和突变型LMW-PTP。制备得到的抗LMW-PTP的兔多克隆抗体的效价为1∶102 400,且重组蛋白均能与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应。对野生型蛋白进行磷酸酶活性检测显示其具有酶活性,酶活为2.1 nmol/(min·μg),突变型LMW-PTPC33A、LMW-PTPR39A无磷酸酶活性。结论 成功表达了具有磷酸酶活性的LMW-PTP,并鉴定出Cys³³和Arg³⁹是LMW-PTP的活性位点。为后续寻找LMW-PTP在2型猪链球菌致病过程中毒力相关的靶蛋白奠定了基础。     

Nrdp1 siRNA重组腺病毒载体的构建及其对心肌肥大的影响

目的构建及鉴定神经调节素受体蛋白1(Nrdp1)基因siRNA重组腺病毒载体,初步研究Nrdp1基因对心肌细胞肥大的影响。方法设计并合成Nrdp1的siRNA靶向DNA序列,克隆至穿梭载体GV119中,并与腺病毒骨架质粒Ad Max在BJ5183细菌中进行同源重组,转染HEK293细胞,包装得到含si Nrdp1的重组腺病毒,实时定量PCR及Western blot检测重组腺病毒对新生大鼠原代心肌细胞Nrdp1表达的影响。然后利用血管紧张素Ⅱ和沉默Nrdp1的腺病毒干预体外培养的新生大鼠原代心肌细胞,实时定量PCR检测心肌肥大标志基因(ANF、β-MHC、Skeletal-α-actin)的表达。结果酶切后PCR分析、测序鉴定表明,干扰Nrdp1腺病毒构建成功,病毒纯化后滴度为1.5E+9 PFU/m L;重组干扰Nrdp1腺病毒可在蛋白水平和mRNA水平明显抑制Nrdp1的表达(P0.001);沉默Nrdp1基因后,可明显上调血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大标志基因ANF、β-MHC和Skeletal-α-actin的表达(P0.01)。结论构建的Nrdp1 siRNA重组腺病毒能有效地抑制新生大鼠原代心肌细胞中Nrdp1表达,且Nrdp1基因沉默后可加重AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。     

smad7和uPA双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的通过引入内部核糖体进入位点序列,构建并鉴定smad7和uPA基因共表达的腺病毒载体.方法PCR扩增uPA和smad7全长cDNA的片段,先后亚克隆入pIRES质粒;更换酶切位点后,将smad7-IRES-uPA片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,再与pAdEasy-1质粒在RJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.酶切鉴定后在293细胞中包装成重组腺病毒Adsmad7/uPA.RT-PCR检测Adsmad7/uPA在L02肝细胞中的表达.结果该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,均与预期结果一致;转染AD-293细胞后,2天可观察到GFP明显表达;RT-PCR检测到转染后的L02细胞中smad7和uPA表达增强.结论成功构建了smad7和uPA双基因共表达重组腺病毒载体,为研究mad7和uPA双基因共表达对大鼠肝纤维化的预防、治疗作用奠定基础.     

GFP示踪FLAG抗原表位标记BMP2转基因腺病毒穿梭质粒的构建

目的构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）目的蛋白和示踪绿色荧光蛋白（GFP）报告分子的腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1。方法采用PCR技术对pcDNA3-BMP2携带的BMP2基因诱变,去除翻译终止密码子后的基因序列并添加新的酶切识别位点XhoⅠ。测序检测诱变情况,将诱变后的BMP2基因定向导入pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1,将质粒分别转染人胚肾细胞HEK293A和兔骨髓间充质干细胞（MSCs）。通过限制性内切酶酶切图谱分析该质粒;采用荧光显微镜检查和免疫组化SP法测定HEK293A中的GFP和MSCs中的BMP2,行重组腺病毒穿梭质粒鉴定。结果质粒pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1经双酶切鉴定图谱分析构建正确,HEK293A、MSCs中均有GFP和BMP2表达。结论 pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1构建成功。     

重组丙型肝炎病毒包膜蛋白2抗体检测的临床意义

我们利用在大肠杆菌中表达的重组E2蛋白进行抗体检测并分析其临床意义。1.材料与方法:（1）材料:收集100份献血员血清标本,及158例丙型肝炎（丙肝）患者、20例乙型肝炎（乙肝）患者、20例非甲非戊型肝炎患者的血清标本。检测抗-E2所用重组E2蛋白（aa385-aa730）在大肠杆菌中表达并经变性条件纯化（表达所用 HCV E2 cDNA来自Ib型 HCV克隆）。（2）方法:建立血清抗-E2 ELISA检测方法:E2包被抗原 0.15μg/孔包被96孔酶标反应板,酶标二抗抗体为山羊抗人IgG-HRP,TMB显色,在AT838酶     

SARS病毒Spike蛋白重组腺病毒疫苗的构建及其免疫学分析

目的构建基于sARS病毒Spike（S）蛋白的重组腺病毒,并对该重组腺病毒进行初步鉴定和免疫学探讨。方法通过全基因合成得到全长S蛋白基因,利用Ad5腺病毒系统构建S蛋白基因的重组腺病毒,采用间接免疫荧光（IFA）试验和蛋白免疫印迹法（Western blot）对S蛋白的表达进行鉴定,再用重组腺病毒免疫小鼠,观察小鼠抗体诱生情况,从而对该重组腺病毒的免疫效果进行初步评价。结果PCR扩增重组腺病毒质粒外源片段,大小为800bp,与预期值一致;Western blot和IFA结果表明,重组腺病毒（rAd-S）表达S蛋白能被马抗SARS血清识别;ELISA检测结果显示,rAd-S能刺激小鼠机体产生抗体。结论重组腺病毒系统成功表达了SARS病毒S蛋白,免疫小鼠产生S蛋白特异的抗体。     

沙门菌Omp D介导的rBCG口服疫苗的制备与鉴定

目的 利用重组BCG (rBCG)技术,构建能以串联和并联形式、在细菌表面表达Der p2和Omp D抗原的两种rBCG 口服疫苗.方法 经PCR法分别扩增获得Der p2和Omp D基因,测序正确后将两者克隆入原核表达载体pProEX HTb,获得pProEX HTb Der p2-Omp D质粒.①串联表达:将Der p2-Omp D融合基因亚克隆入穿梭胞壁表达载体pCW,经酶切鉴定阳性命名为pCW Der p2-Omp D 质粒.将此重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,构建可胞壁串联表达Der p2-Omp D融合蛋白的rBCG;②并联表达:构建pCW-Der p2与pCW-Omp D两种质粒,并将二者同时电穿导入BCG感受态细胞,以构建胞壁并联表达Der p2和Omp D蛋白的rBCG.经潮霉素抗性筛选的阳性克隆,均采用以下三种方式进行鉴定:PCR特异性扩增目的基因片段;用兔抗Der p2多克隆抗体与兔抗Omp D多克隆抗体对阳性克隆分别进行斑点免疫杂交法和间接免疫荧光法鉴定.结果 采用基因工程手段制备出以胞壁形式串联和并联表达Der p2和Omp D蛋白的两种rBCG口服疫苗,并通过PCR、斑点免疫杂交法及间 接免疫荧光法分别进行鉴定.结论 两种rBCG 口服疫苗构建成功,为体外实验和临床应用提供基础.