瘤内注射pSTbAT-脂质体复合物对裸鼠移植瘤抑制效应的实验研究

目的:构建血管生成抑制因子arresten基 因的真核表达载体,并观察瘤内注射质粒DNA 脂质 体复合物对裸鼠移植瘤生长的影响。方法:利用 PCR方法,由重组质粒pGEM Arr中扩增出基因;将 该基因定向克隆于真核表达载体中。20只裸鼠皮 下注射HepG 2细胞,成瘤后以成功构建的质粒 DNA 脂质体复合物瘤内注射,治疗后采用免疫组化 方法检测肿瘤血管密度,并利用arresten基因瘤内注 射的方法对抑制肿瘤的效果进行分析。结果:我们 成功构建arresten基因真核表达载体(pSTbAT)。实 验组肿瘤生长速度较对照组慢(实验组平均15.3个 阳性血管/10个视野,对照组平均112.5个阳性血 管/10个视野)。结论:瘤内注射arresten基因质粒 DNA复合物能抑制裸鼠移植瘤的血管生成,并能抑 制移植瘤的生长。     

瘤内注射pSTbAT-脂质体复合物对裸鼠移植瘤抑制效应的实验研究

目的：构建血管生成抑制因子arresten基因的真核表达载体，并观察瘤内注射质粒DNA-脂质体复合物对裸鼠移植瘤生长的影响。方法：利用PCR方法，由重组质粒pGEM-Arr中扩增出基因；将该基因定向克隆于真核表达载体中。20只裸鼠皮下注射Hepp2细胞，成瘤后以成功构建的质粒DNA-脂质体复合物瘤内注射，治疗后采用免疫组化方法检测肿瘤血管密度，并利用arresten基因瘤内注射的方法对抑制肿瘤的效果进行分析。结果：我们成功构建arresten基因真核表达载体(psTbAT)。实验组肿瘤生长速度较对照组慢(实验组平均15．3个阳性血管／10个视野，对照组平均112．5个阳性血管／10个视野)。结论：瘤内注射arresten基因质粒-DNA复合物能抑制裸鼠移植瘤的血管生成，并能抑制移植瘤的生长。     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的:建立稳定的基因工程细胞系.方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达.结果:通过Sal I和EcoR I双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确.采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFct蛋白表达,分子量为17KDa.结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外.     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的：建立稳定的基因工程细胞系。方法：将含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）全长cDNA插入表达载体pSNAV2．0，产生重组质粒pSNAV2．0-TNFα，利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中，G418筛选阳性克隆hTNF／293，采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果：通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明：在质粒pSNAV2．0中插入片段正确。采用RT—PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达，分子量为17KDa。结论：成功构建重组质粒pSNAV2．0-TNFα，真核表达载体构建正确，转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白，并能分泌到细胞外。     

表达白细胞介素-12质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用

目的 探讨瘤内注射mIL-12质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用。方法：构建真核表达质粒载体pDC511mIL-12，ELISA方法检测质粒载体在真核细胞中的表达，淋巴母细胞增殖法检测mIL-12的生物学活性；分别于小鼠肝癌H22皮下移植瘤内直接注射质粒DNA，观察各组小鼠存活时间、肿瘤体积变化及各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活性：注射质粒DNA后1月进行瘤体组织病理学观察：结果：mIL-12基因治疗组与空载体对照组相比，肿瘤生长显著受抑制(F=4．10，P=0．03)，小鼠存活期显著延长(X^2=4．48，P=0．03)．并且小鼠脾细胞CTL杀伤活性增强。质粒DNA瘤内注射1月后，pDC511mIL-12组肿瘤病灶炎性细胞浸润明显，病灶内肿瘤细胞广泛坏死。结论：瘤内注射mIL-12表达质粒DNA可抑制小鼠肝癌皮下移植瘤生长，能提高机体抗肿瘤免疫应答。     

肿瘤相关基因SNC90 cDNA真核细胞表达型重组质粒的构建及其转染研究 *

目的:构建肿瘤相关基因SNC90哺乳动物细胞表达型载体并进行转染研究.方法:肿瘤相关基因SNC90cDNA片断亚克隆至哺乳动物细胞表达型质粒pREP9中,并运用脂质体和电穿孔法将重组质粒pREP9-SN90转入3株人大肠癌细胞中,用G418筛选抗性细胞克隆.结果:重组体pREP9-SN90对SW1116,COLO205和SW620肠癌细胞株克隆形成均有一定的抑制作用,抑制率分别为72.2%,74.2%和59.7%.结论:这提示肿瘤相关基因SNC90对肠癌细胞生长起负性调节作用.     

人TNFα真核表达载体的构建及其在人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM中的稳定表达

目的：构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha （hTNF-α） 基因的真核表达载体,建立稳定表达hTNF-α基因的细胞模型.方法： 应用RT-PCR 的方法从分离的正常人外周血单核细胞（LPS刺激）中,扩增出hTNF-αcDNA ,连接至载体pMD18-T vector中,经酶切鉴定与序列测定证实;以亚克隆法构建于真核表达载体pBK-CMV的相应酶切位点, 转化至大肠埃希菌DH5α,最后将表达的pBK-hTNFα重组蛋白行SDS-PAGE电泳,并作考马斯亮蓝染色分析,Western blot鉴定;经脂质体Lipofectamine2000转染HepG2/ADM细胞后,经G418筛选,通过ELISA、RT-PCR方法检测其在体外转染肝癌耐药细胞HepG2/ADM后hTNFα基因和蛋白的表达.结果：自正常人外周血单核细胞中克隆的hTNF-αcDNA 成功连接到pMD18-T vector,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切、经序列测定证实,与Genbank的序列完全一致;pBK-hTNFα的克隆表达重组蛋白经Western blot证实此蛋白为hTNFα.克隆基因正确插入载体pBK-CMV中.pBK-hTNFα经脂质体介导转染肝癌耐药细胞后, ELISA、RT-PCR方法检测到其在转染细胞中稳定表达.结论：通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF-αcDNA 全长的真核表达载体pBK-hTNFα.     

融合自杀基因对鼻咽癌细胞的体内杀伤作用

[目的]研究融合自杀基因对鼻咽癌细胞的体内杀伤作用.[方法]培养鼻咽癌CNE-2细胞,建立裸鼠荷瘤模型.随机分为6组,每组5只,A组:脂质体包裹质粒瘤内注射瘤内组;B组:脂质体包裹质粒瘤内注射+肿瘤局部照射γ射线(总剂量9Gy)组;C组:脂质体包裹质粒瘤内注射+腹腔注射5氟胞嘧啶(5-Fc)组;D组:脂质体包裹质粒瘤内注射+肿瘤局部照射γ射线(总剂量9Gy)+腹腔注射5-Fc组;E组:肿瘤局部照射γ射线(总剂量9Gy)+腹腔注射5-Fc,以及空白对照组.记录肿瘤体积变化;计算各组肿瘤抑制率,绘制肿瘤生长曲线;取肿瘤组织进行病理观察;鉴定肿瘤组织中CD/UPRT.UL49基因.肿瘤体积变化的比较采用单向方差分析,组间多重比较采用LSD法.[结果]成功建立鼻咽癌裸鼠荷瘤模型,生长曲线显示:5组瘤体积差异有统计学意义(F=720.684,P＜0.01),测序结果证实,除E组外,其余各处理组均检测到目的基因,且Western blot检测结果示:B和D组肿瘤组织内自杀基因的表达高于其余各组.病理切片证实肿块为低分化鳞癌,其中D组肿瘤组织在干预作用下出现明显坏死.[结论] E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49自杀基因载体联合前药5-Fc在放射线的作用下,可明显抑制鼻咽癌移植瘤的生长,转染该融合自杀基因可增强放疗敏感性,为鼻咽癌的基因—放射治疗开辟了新思路.     

血管生成抑制素和IL—7联合治疗的肿瘤抑制效应

目的 探讨采用裸质粒DNA肿瘤内直接注射入方法,以观察血管生成抑制素（Angiostatin）,和IL－7联合治疗肿瘤的可行性,及其可能机制。方法 将构建的血管生成抑制素、IL－7基因真核表达质粒（每次100μg／只）,分别或联合注射到接种U14肿瘤细胞5天后的荷瘤鼠体内,以后每隔7天注射一次、共三次。观察荷瘤鼠的存活率、肿块生长情况、以及小鼠整体免疫功能,并对肿瘤对照组与联合基因治疗组的肿瘤组织进行病理学及细胞凋亡分析。结果 血管生成抑制素、IL－7、以及两者联合治疗均可不同程度地增加荷瘤鼠的存活率、抑制肿瘤生长和转移、调节免疫功能,以联合基因治疗组更显著。病理分析表明联合治疗组肿瘤血管形成显著减少,基底部有大量的淋巴细胞浸润,肿瘤细胞的凋亡率明显升高。结论 直接裸质粒DNA注射血管生成抑制素和IL－7基因可能成为一种方便、有效的肿瘤治疗方法。     

siRNA沉默PI3K基因激活FoxO3α基因并抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤生长的实验研究

目的:探讨应用小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)基因对人乳腺癌细胞MCF-7中抑癌基因FoxO3α的表达及人乳腺癌裸鼠移植瘤模型的肿瘤生长的影响.方法:构建PI3K基因siRNA质粒Psilencerl.0-U6-PI3K-siRNA;乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠背部皮下接种,建立人乳腺癌裸鼠移植瘤动物模型,成瘤后将实验动物分3组,每组9只,1组注射Psilencerl.0-U6-PI3K-siRNA质粒、另2组分别注射Psilencerl.0-U6空质粒或0.9%的氯化钠溶液作为对照.观察肿瘤体积变化、裸鼠生存时间;并用Western印迹法检测瘤组织中FoxO3α和PI3K的表达.结果:PI3K-siRNA质粒治疗组裸鼠的肿瘤体积明显缩小(P＜0.01),平均生存时间显著延长(P＜0.01);肿瘤内PI3K基因表达水平明显下降,而FoxO3α基因的表达水平明显升高.结论:PI3K基因siRNA能够明显抑制人乳腺癌裸鼠移植模型的PI3K基因的表达,上调抑癌基因FoxO3α的表达,抑制肿瘤生长,延长荷瘤鼠的生存时间.     

抗腺癌肿瘤疫苗对小鼠Lewis肺癌的防治研究

本研究观察了本室制备的抗腺癌肿瘤疫苗的抑瘤效果.将C57小鼠随机分为实验组及对照组.实验组即抗腺癌肿瘤疫苗 环磷酰胺(Cyclo)组,其又根据抗腺癌肿瘤疫苗的不同剂量分为5组(0.1μg、0.5μg a、0.5μg b、15μg);对照组:0.9%NaCl a组,0.9%NaCl b组,BCG组及单纯Cyclo组.实验组自-57天起每间隔2周于鼠尾根部双侧皮下肿瘤疫苗免疫1次,此外在-45天给予实验组鼠腹腔注射Cyclo 3 mg/只;与此同时NaCl组相应给予0.9%NaCl注射液;BCG组除在-57天于尾根部双侧皮下注射BCG 0.25mg/只外,在接种Lewis肺癌细胞后,待肿瘤长径至0.8cm时,于肿瘤基底部注射BCG,剂量同前;单纯Cyclo组于-57天、-10天给予C57小鼠腹腔注射Cyclo 3mg/只.各组C57小鼠均于0天接     

人肿瘤坏死因子—α基因真核表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha(hTNF—α)基因的真核表达载体。方法：应用RT—PCR的方法从足月妊高征患者的胎盘组织中，扩增出hTNF—αcDNA，连接至载体pMD l8—T vec-tor中，经酶切鉴定与序列测定证实后，以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3．1-mvc-hjs(—)A，B，C的相应酶切位点，通过RT—PCR方法检测其在体外转导绒癌耐药细胞后hTNF—α基因的表达。结果：自胎盘中克隆的hTNF—α cDNA经序列测定证实，与Genbank的序列完全一致；用EcoR I和Ⅱind Ⅲ双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1-myc-hjs(—)A，B，C。经脂质体介导转导绒癌耐药细胞后，检测到其在转导的细胞中稳定表达。结论：通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF—αcDNA全长的真核表达载体。     

脂质体介导mIL-12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠实验性肝癌的治疗作用

背景与目的：白细胞介素-12及MHCⅠ基因均已单独用于肿瘤基因治疗,为探索两者的抗肿瘤协同效应,本研究探讨小鼠白细胞介素-12（mIL-12)基因与同种异型的MHCⅠ（小鼠为H-2K）基因联合治疗Balb/C小鼠实验性肝癌。方法：分别应用含mIL-12基因,C57BL/6小鼠H-2K^bcDNA及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的真核表达质粒载体pcDNA3。体外经新型脂质体LipofectAMINE2000(LF2000)介导转染小鼠肝癌细胞株MM45T.Li,检测转染细胞外源基因的表达,将经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2K^b转染的MM45T.Li细胞,注射于小鼠皮下,观察致瘤性的变化,在荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射上述脂质体-DNA复合物,观察瘤体生长情况及小鼠生存期的改变。结果：LF2000介导pcDNA3/GFP转染MM45T.Li细胞的最佳条件为脂质体与DNA为3：1（μg：μg）,转染效率达30%,经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2K^b转染的MM45T.Li细胞,RT-PCR检测有mIL-12和H-2K^bcDNA的特异扩增片段,WesternBlot检测显著有57kDaH-2K^b蛋白表达,ELISA检测mIL-12分泌量达48ng/ml/10^6细胞,经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2K^b转染的MM45T.Li细胞,其致瘤性下降;荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射该脂质体-DNA复合物,FACS检测显示小鼠脾脏淋巴细胞中CD3^ ,CD4^ 和CD8^ 的数量治疗组较对照组高,肿瘤生长相对缓慢,且pcDNA3/mILp-12与pcDNA3/H-2K^b联合治疗具有一定的正协同效应。结论：mIL-12基因与MHCⅠ基因联合治疗小鼠肝癌具有正协同效应,增强了抗肿瘤效果。     

稳定表达人MAGE-1基因小鼠黑色素瘤细胞系的建立

目的:构建真核表达载体,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中稳定表达。方法:用PCR方法扩增质粒pUC19-MAGE-1中目的基因MAGE-1,连接到真核表达载体pCDNA3.1中,构建真核表达pCDNA3.1-MAGE-1,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G418筛选阳性克隆(B16-MAGE-1),用RT-PCR和Western blot检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;分别以2×105个B16细胞和B16-MAGE-1接种于C57BL/6小鼠右侧背部皮下,观察B16-MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:用PT-PCR与Western bolt分别在B16-MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组共20只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠黑色素瘤B16细胞系,并保持很好的致瘤能力,为研究MAGE家族在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。     

不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCG1),以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌,观察不同剂量的质粒(pCG1)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明,注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别,而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后第15～20天左右表达量最高,平均约91ng/ml。生物学活性检测结果显示,注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

瘤体内直接注射白介素2质粒复合物治疗小鼠肝癌

目的研究瘤体内直接注射白介素2质粒/阳离子脂质体复合物治疗小鼠肝癌的效果.方法将小鼠白介素2表达质粒(VR1110)与阳离子脂质体(Transfectam)按适当比例混合而形成复合物(VR1110/Transfectam).通过瘤体内直接注射此复合物治疗小鼠肝癌模型,并和卡介苗(BCG)的治疗相比较.结果瘤体内注射VR1110/Transfectam后,可在肿瘤组织中检测到小鼠IL-2 mRNA的表达.VR1110/Transfectam治疗组以及VR111/Transfectam/BCG治疗组肿瘤生长较其它组明显减慢,均显著提高小鼠的生存率(R＜0.05),但二者相差不明显.结论瘤体内直接注射VR1110/Transfectam复合物对小鼠肝癌的治疗作用明显,效果优于卡介苗,且方法简单,适合临床应用.     

HSA基因转染小鼠淋巴细胞EL-4诱导宿主的体内抗瘤效应

将热稳定抗原(Heat-stable Antigen,简称HSA)的cDNA与质粒载体(PcDNA3)连接,构建成真核表达载体,通过电穿孔的方法将重组质粒导入到小鼠淋巴瘤细胞EL-4中,使其表达抗性基因和HSA分子,通过高剂量G418(400μg/ml)选择培养和有限稀释法克隆,获得高比例表达HSA的阳性细胞克隆,以提供活化T细胞所必需的协同刺激信号,从而诱导宿主体内有效的抗肿瘤免疫应答。实验发现:表达HSA的EL-4淋巴瘤细胞在同系小鼠(C57BL/6)体内的致瘤性明显较野生型肿瘤弱。HSA~ EL-4瘤细胞经丝裂霉素灭活后,腹腔免疫同系小鼠后可获得对低剂量(2×10~3/鼠)野生型瘤细胞EL-4攻击的免疫保护效应。用HSA~ 瘤细胞灭活后作为瘤苗治疗早期带瘤动物显示一定的治疗效果。     

热休克蛋白90α的表达及其对体内肿瘤生长的影响

目的 探讨ｈｓｐ９０α对体内肿瘤生长的影响及机理。方法 利用克隆技术构建了ｈｓｐ９０α融合表达质粒ｐＭａｌ－ｈｓｐ９０α。ＤＢＡ／２小鼠接种肿瘤细胞前,皮下注射融合蛋白,每隔１天测肿瘤大小,２５天后,＾５１Ｃｒ释放法测ＮＫ细胞活性。结果 注射热休克帽白组小鼠抗ｈｓｐ９０ａ抗体升高,肿瘤生长快,ＮＫ细胞活性低,结论 ｈｓｐ９０α对肿瘤生长的影响与不鼠体内的ＮＫ细胞活性降低有关。     

基因治疗研究的历史、现状与未来

β趋化因子家族的TCA3是一种小鼠糖蛋白,可能参与宿主防御反应,为了评定TCA3在体内的功能,将TCA3 cDNA转染异源性CHD和同源性P_(3x)和J_(558)细胞,注入小鼠体内发现在裸鼠及免疫缺陷SCID鼠均可削弱肿瘤生长,提示TCA3可以通过非依赖淋巴细胞介导的免疫来影响肿瘤生长,在正常鼠内肿瘤生长受抑,3周后,63%小鼠体内肿瘤完全消除,其抑制作用显著强于免疫缺陷型小鼠,这表明TCA3抗瘤效应在完整的免疫系统存在下增强,首次注射转染细胞使肿瘤完全消除2～10周后,再次注射末转染瘤细胞,发现:如果第二次注入同源瘤细胞则肿瘤受抑,反之,肿瘤生长,这提示TCA3诱导抗瘤免疫具有抗原特异性,可使免疫活性宿主产生针对同源瘤细胞特异性记忆反应,将相同数量的TCA3转染细胞与未转染细胞混合注射同源小鼠,肿瘤受抑.如将二者分别在两个部位同时注射,对肿瘤生长无抑制作用,可能是TCA3仅影响趋化因子附近的细胞生长,最终出现肿瘤,提示TCA3抑瘤作用是短暂性的,一些瘤细胞发生免疫逃避,在TCA3作用消除,特异性T细胞免疫诱导前迅速增长所致.为了检测瘤体内注射TCA3是否具有抗瘤效应,先用20ng可溶性rTCA3 J_(58)5注射,以后连续5天在肿瘤接种部位注射10ul 20ng rTCA3.9只鼠中有4只在3周后仍无肿瘤生长,且其中3只在注射2×10~7J_(558)