螺旋霉素链霉菌SPM^r—248的发酵特性研究

试验了乙酸钠、甲硫氨酸、乙醇、正丙醇、正丁醇和豆油对螺旋霉素链霉菌 SPM~r-248发酵的影响。结果表明在发酵培养48h 时补入1.0%豆油可使螺旋霉素摇瓶发酵效价提高49%。在30 m~3发酵罐上应用该工艺,发酵效价与原工艺比较可提高30%,发酵指数提高18.9%。     

螺旋霉素生物合成代谢流量分析

通过对螺旋链霉菌的中间代谢产物及有机酸的分析 ,建立了螺旋霉素生物合成的动态流量分布图 ,并分析了螺旋霉素生物合成代谢网络的节点。分析认为 ,大环成环步骤和 FO- 1步骤在发酵中前期有一定的限速影响 ;同时由于 FO- 2、NSP- 2有一定的积累 ,若能减少两者的形成 ,将对提高发酵效率有积极的意义。摇瓶实验验证了添加葡萄糖对螺旋霉素生物合成代谢网络有影响 ,发酵效价提高了 2 6 .8%。     

亮氨酸对必特螺旋霉素发酵组分的影响

本文针对必特螺旋霉素发酵主要组分异戊酰基螺旋霉素以及异戊酰基螺旋霉素Ⅲ的提高，在摇瓶培养基试验中，通过一次性添加与分批添加终浓度为15．4mmol／L的亮氨酸，发现分批添加亮氨酸可以维持效价基本不变，而总异戊酰基螺旋霉素与异戊酰基螺旋霉素Ⅲ分别由对照的31．1％和12．0％提高至46．9％和19．5％。通过分析发酵过程的有机酸以及氨基酸的变化规律，讨论了亮氨酸提高必特螺旋霉素主要组分的作用机理，同时在15L发酵罐中对分批添加亮氨酸添加效果进行了验证试验，结果表明，发酵液必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素和异戊酰基螺旋霉素Ⅲ在96h分别提高至59．91％和21．45％。     

新一代必特螺旋霉素基因工程菌的微波诱变

本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果.以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticus NBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选.辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;不加盖不冷却,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100和120s.每次辐射5s后,冰上快速冷却20s再照射,并将照射时间累计.以不同的辐射时间设定为不同的微波处理剂量,计算致死率.结果 表明,必特菌株对微波敏感,微波辐射60s时致死率达到92.55%.微波诱变在以脉冲频率为2450MHz的800W家用微波炉条件下,其最佳作用方式为培养皿不加盖、冰上快速冷却,最佳辐射时间为50s.初筛摇瓶正突变率达到57.14%,复筛摇瓶发酵效价是出发菌株1.6倍以上的有10株,占初筛菌株的2%.最终筛选得到突变株Streptomyces spiramyceticus NBT-UM22,其必特螺旋霉素发酵产量是出发菌株的1.87倍,且组分比例无明显变化.     

响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。     

硝酸铵添加量对螺旋霉素发酵影响的初探

在螺旋霉素发酵中，硝酸铵作为辅加氮源添加。经试验，结果发现NH4N03加量对螺旋霉索发酵 呈明显影响。NH4N03加量为0.5％时,发酵效价最高.     

提高基因工程菌产二素链霉菌311—10产生酰化螺旋霉素的研究

基因工程菌产二素链霉菌(Str.ambofaciens)311-10是一株含麦迪霉素4″—羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌,可发酵直接产生酰化螺旋霉素。经质谱鉴定,所产生的酰化产物为4″—异戊酰、4″—丁酰及4″—丙酰螺旋霉素,并含有50～60％的螺旋霉素组份。为了提高酰化螺旋霉素的含量,研究了17种氨基酸及有关化合物对产二素链霉菌311-10菌株直接产生酰化螺旋霉素的影响。结果显示,在发酵过程中添加一定量α—羟基异丁酸或L—异亮氨酸,酰化螺旋霉素的的百分含量可从对照组的45％分别提高到73％和67％。如同时加入α-羟基异丁酸和L-异亮氨酸.则酰化螺旋霉素的含量可增至88％左右。研究表明含麦迪霉素4″—羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌能利用L—异亮氨酸或α—羟基异丁酸作为酰基的供体。从不同发酵时间加入试验表明合适的添加时间为发酵前期24小时左右。提示L—异亮氨酸或α—羟基异丁酸不只是提供酰化螺旋霉素4”—酰化酶酰基的供体,可能对4″—酰化酶基因的转录起诱导作用。 L—精氨酸能使酰化螺旋霉素组份下降至14％左右,并能抵消α-羟基异丁酸或L-异亮氨酸对酰化螺旋霉素的促进作用。 研究提示控制基因工程菌发酵条件,可以有效地获得所需基因工程产物。     

豆油对螺旋霉素发酵的影响

以螺旋霉素链霉菌SPM1 1 0 8为出发菌株 ,经波长为 2 54nm、功率 30W的紫外诱变处理 50s,筛选豆油耐性突变株 ,得到一株螺旋霉素高产菌株SPM2 89,其发酵效价较出发菌株提高了 2 2 5 %。以此为试验菌株 ,采用含豆油培养基进行发酵试验 ,结果表明 ,豆油的最佳加入量为 2 0 % ,加入时间以 0～ 1 2h为宜。采用上述含豆油培养基并补加前体正丙醇 ,发酵效价比不添加前体提高 2 1 %。此工艺应用于 50m3发酵罐工业生产 ,月平均发酵水平较原工艺提高 30 %～ 50 % ,产品质量稍有提高     

环孢菌素A高产菌株摇瓶发酵及菌丝体的形态变化

研究雪白白僵菌CA411产环孢菌素A的摇瓶发酵条件,使该菌株的发酵效价提高了110%以上.采用补水发酵工艺,提高菌体生长速度,使发酵周期缩短2d.对摇瓶发酵过程中的细胞形态进行观察,初步揭示发酵各时期菌体形态变化.     

螺旋霉素产生菌螺旋霉素链霉菌遗传育种

本文是利用抗生素抗性与产量之间的相关性来进行螺旋霉素产生菌螺旋霉素链霉菌的遗传育种,旨在获得高效价菌株,从而提高螺旋霉素的生产水平。首先用正交试验法确定出发菌株最佳发酵培养基,并在此基础上通过紫外线诱变,和在螺旋霉素浓度梯度平板上筛选螺旋霉素抗性菌株。按上述方法理性化筛选得到的菌株多为正突变株。从本实验得到一株螺旋霉素抗性菌株SPM~r-248,其抗性较出发菌株提高300％,生产能力较出发菌株提高81.3％。菌株SPM~r-248的高效价生产性能遗传特性稳定。在7m~3罐做发酵放大,与出发菌株相比,发酵效价提高31.4％,发酵指数提高18.8％,具有一定的学术意义和经济价值。     

螺旋霉素的生物合成Ⅳ.发酵过程中ATP与SPM生物合成的关系

螺旋霉素的生物合成受碳、氮分解代谢物的阻遏和终点产物的抑制。螺旋霉素发酵对工艺条件很敏感,影响发酵过程的因素很多,且错综复杂。对发酵控制可资借鉴的参数极少。为此,本文研究了发酵过程中ATP的变化与螺旋霉素生物合成的关系,从中发现,过程ATP水平过高,对SPM生物合成不利,因基质主要用于初级代谢。另外,基础配方加油的批号比不加油的批号的ATP水平低,糖耗小,SPM单位平均增长42％。ATP含量高会抑制脂肪的代谢。发酵液的溶磷会影响ATP的含量,从而影响发酵单位。但发酵后期加入少量磷酸盐有利于SPM的合成,静息细胞系统中证明磷酸盐的作用在于减轻葡萄糖和NH_4~+的阻遏和SPM的反馈抑制,还促进SPM中三个糖的合成与连接。     

溶剂浸渍树脂的制备及其在提取螺旋霉素上的应用

溶剂浸渍树脂是一种正在发展的分离介质。本文首次研究了醋酸戊酯浸渍树脂吸附分离螺旋霉素的工艺条件。浸渍树脂对螺旋霉素的吸附量不低于大孔吸附剂,用pH为4含15％乙醇的醋酸缓冲液作为解吸剂。解吸率达到95％以上。直接合成制得的浸渍树脂对螺旋霉素的吸附量亦较高。研究表明,浸渍树脂在分离过程中溶剂的萃取作用和吸附剂的表面吸附作用同时发生。测定了浸渍树脂的吸附等温线和吸附、解吸条件,提出了从发酵液中提取螺旋霉素的工艺过程。     

螺旋霉素产生菌的He-Ne激光诱变效果及其数量分析

目的利用He-Ne激光选育螺旋霉素产生菌生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens）的高产菌。方法利用功率密度为0．4mW／cm^2的He-Ne激光器，以不同的时间辐照螺旋霉素产生菌，筛选高产突变株。结果在激光照射8h的条件下，得到一株发酵效价比对照提高了38．6％的高产菌株，而且组分较出发菌株优异。结论通过对辐照剂量与致死率及正突变率问关系的数量分析，得到了一个基于自限模型和正态分布模型的用连续函数表达的诱变效果数学模型，根据模型优化的最优值，确定了He-Ne激光诱变的最佳作用时间为9h。     

A82846B生产菌株选育及发酵培养基的优化

以荒漠拟孢囊菌SIPI-HT47为出发菌株,发酵合成奥利万星中间体A82846B。应用紫外和NTG诱变,结合自身抗性及氯化盐耐受筛选,获得1株高产突变株,命名为FH-32-322,发酵效价较出发菌株提高172.5%。通过PB试验、爬坡试验和响应面试验设计优化发酵培养基组成,确定最佳摇瓶发酵配方。在优化后的发酵培养基上,突变株FH-32-322摇瓶发酵效价达到1 013 mg/L,较原工艺提高85.9%。     

用絮凝和大网格吸附法提取螺旋霉素

本文报道用絮凝法预处理螺旋霉素发酵液和用大网格吸附法提取螺旋霉素。试验结果表明:絮凝剂F-A加量为0.6～0.9％,F-B为40ppm,絮凝时pH7.5,筛选出S10和4006两种国产大网格吸附树脂,在pH8.5、流速1/25～1/35 1/分时进行吸附,用醋酸丁酯解吸,解吸收率可达96％,该工艺适用于工业生产。     

格尔德霉素发酵工艺的优化

目的研究格尔德霉素产生菌吸水链霉菌SIPI.A.2039的发酵工艺,以提高产生菌生物合成格尔德霉素的能力。方法以本实验室保藏的吸水链霉菌SIPI.A.2039为出发菌株,从摇床转速、摇瓶装量、碳源、50L发酵罐参数等方面进行发酵工艺的优化研究。结果采用经过优化获得的发酵培养基和培养条件,发酵周期为144h时,格尔德霉素的摇瓶发酵效价可由原来的230μg/mL提高至2500μg/mL。在50L发酵罐中采用优化的溶解氧和补料工艺能够使格尔德霉素的发酵效价达到3700μg/mL,并使发酵周期比摇瓶缩短了48h。结论本实验得到的结果比国内外报道的格尔德霉素的发酵效价提高了两倍以上,该发酵工艺已经达到了产业化的要求。     

原生质体ARTP诱变选育阿维拉霉素高产菌株

目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平。方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S. viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究。结果 S. viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为：以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min。以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3%,其中,阿维拉霉素A占组分含量81%,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4%,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定。另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4%。结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力。     

产多杀菌素刺糖多孢菌的诱变选育

目的 采用甲基磺酸乙酯(EMS)、核糖体工程育种和常压室温等离子体(ARTP)方法处理产多杀菌素刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa) SIIA-1802,采用含蛋氨酸培养基筛选得到高产菌株。方法 首轮采用EMS诱变;第二轮采用链霉 素抗性育种;第三轮采用ARTP诱变育种进一步巩固育种成效;采用对照和添加蛋氨酸的发酵培养基考察突变菌株的发酵水 平。结果 出发株刺糖多孢菌SIIA-1802经过EMS诱变、链霉素抗性筛选和ARTP诱变得到的突变株ESA-611,发酵水平提高了 671.8%,采用含有蛋氨酸的发酵培养基进行筛选,发酵水平进一步提高了57.6%。在ARTP诱变过程中,筛选到一株多杀菌素A 显著下降,但产生较高水平多杀菌素J的菌株ESA-598。结论 本方法简单经济,突变效率高,能够快速获得传代稳定的多杀菌 素高产突变株。另外,通过诱变拓宽了代谢产物谱,得到了具有更高潜在价值的组分。