双重杂合性突变Arg304Gln和Arg304Trp导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症

目的 探讨1例遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factorⅦ，FⅦ)缺陷症及其家系基因突变的类型。方法 检测凝血指标以明确诊断；用DNA直接测序法对先证者及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子和其侧翼以及启动子进行分析，寻找基因突变；将含突变序列克隆人pGEM T—easy质粒载体中，对所得两条染色体相应序列分别测序，以确定不同突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶Msp Ⅰ对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析，证实测序所发现的突变。结果 先证者在第8外显子上有两种基因突变：11348位C→T突变和11349位G→A突变。pGEM T—easy质粒克隆测序结果显示上述两种突变位于不同的染色体上。为不同染色体同一编码区Arg(CGG)304Trp(TGG)和Arg(CGG)304Gln(CAG)双重杂合性突变。其父亲、母亲分别为11349位G→A和11348位C→T杂合突变；其弟弟FⅦ基因为正常野生型；其哥哥和先证者的3个子女均为杂合性突变。聚合酶链反应辅助限制性酶切证实了先证者及其家系成员的基因突变。结论 先证者FⅦ基因突变为不同染色体同一编码区Arg304Trp和Arg304Gln双重杂合性突变，此种突变类型的组合尚属首例。     

九例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的分子发病机制与临床特性

目的 探讨9个遗传性凝血因子Ⅶ( coagulation factorⅦ,FⅦ)缺陷症家系的基因突变类型与临床特征.方法 检测凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间及FⅦ活性和抗原等指标以明确诊断;用PCR法扩增先证者F7基因的全部外显子及侧翼序列、5′和3′非翻译区.PCR产物纯化后直接测序,寻找基因突变,用反向测序证实所发生的突变.结果 9个家系中的先证者凝血酶原时间均延长,FⅦ活性在2.0％～6.0％之间,7例先证者的FⅦ抗原显著减低.共发现8种F7基因突变,其中g.8355 A＞T(Gln100Leu)、g.11243T＞C(Ser269Pro)和g.11520_11521insT 3种突变为首次发现;6种突变发生在催化区;缺失突变和插入突变各1种,其余均为错义突变;所有的基因突变均来自先证者的父亲和(或)母亲,发现5个家系存在近亲婚配.g.27_28delCT、Cys329Gly、Arg304Trp和His348Gln突变在无亲缘关系的家系中重复出现.不同基因突变类型的临床表型有较大差异:2例His348Gln及1例Arg304Trp纯合突变可表现为轻型和无症状,2例g.27_28delCT纯合、杂合突变分别表现为中型、无症状,4例双杂合突变分别表现为1例(Ser269Pro和Cys329Gly)无症状、2例(Arg304Trp和Cys329Gly与Arg277Cys和g.11520_11521insT)轻型、1例(Gln100Leu和His348Gln)中型.结论 中国汉族人群中存在导致F7基因缺陷的突变热点.遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的临床表型与FⅦ活性、F7基因突变类型无明显的相关性.     

纯合子Cys329Gly导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系基因突变分析

目的对1个姨表近亲婚配的遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系进行表型和F7基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法检测先证者及其家系成员(共4代9人)凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FⅦ活性(FⅦ:C)等来明确诊断。PCR扩增先证者全部外显子及其侧翼序列、5′和3′非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,PCR产物纯化后直接测序,寻找突变位点,以反向测序验证所发生的突变;使用生物信息学软件(Poly Phen-2和Mutation Taster)预测突变位点对蛋白质功能的影响,利用Py MOL软件构建正常FⅦ蛋白空间模型,进行定点突变观察构型改变。结果先证者PT(36.1s)和FⅦ:C(2%)明显异常,家系中其余8位成员PT均略高于正常对照组和FⅦ:C均略低于正常对照组;基因分析显示先证者F7基因第8外显子存在c.1165 TG纯合型突变,即TGT→GGT(Cys329Gly),8位家系成员的F7基因分析均显示c.1165有杂合型突变;两种生物信息学软件都提示此突变会引起蛋白功能变化,有致病性;F7基因蛋白构型显示突变后329位点与310位点之间二硫键消失,周边静电磁场发生改变。结论该家系F7基因存在Cys329Gly突变,是引起FⅦ缺陷症的主要分子机制,推测先证者纯合Cys329Gly突变基因分别遗传自近亲结婚的杂合子父母。     

一个遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症家系的临床特征与基因突变分析

目的 探讨一个遗传性凝血因子Ⅹ（FⅩ）缺陷症家系的临床特征与基因突变关系。方法 调查家系，采用Sanger测序法分析先证者F10基因8个外显子及其侧翼序列，并对家系成员相同突变位点进行检测。通过凝血酶生成试验评估家系成员FⅩ的促凝活性。ClustalX-2.1-win和在线生物信息学软件（PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster）分别用于分析突变位点氨基酸的保守性和致病性；Swiss-PdbViewer软件用于蛋白质空间结构和突变氨基酸相互作用分析。结果 先证者FⅩ活性（FⅩ:C）和FⅩ抗原（FⅩ:Ag）分别降低至7%和14%（参考范围分别为：90%～114%和90%～110%）；先证者平素无自发性出血现象，外伤后也无明显出血异常。基因测序发现先证者F10基因第4号外显子存在c.361T>C(p.Cys121Arg)杂合错义突变及第8号外显子存在c.979C>T(p.Arg327Trp)杂合错义突变；其母亲和女儿为p.Arg327Trp的杂合子，二姐和儿子为p.Cys121Arg的杂合子。先证者凝血酶生成潜力比值和峰高比值下降，而其延迟时间和达峰时间延...     

双重杂合性突变Arg304Gln和Arg304Trp导致的遗传性凝血因子缺陷症

目的　探讨 1例遗传性凝血因子 (coagulation factor ,F )缺陷症及其家系基因突变的类型。方法　检测凝血指标以明确诊断 ;用 DNA直接测序法对先证者及其家庭成员 F 基因的全部外显子和其侧翼以及启动子进行分析 ,寻找基因突变 ;将含突变序列克隆入 p GEM T- easy质粒载体中 ,对所得两条染色体相应序列分别测序 ,以确定不同突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶 Msp 对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析 ,证实测序所发现的突变。结果　先证者在第 8外显子上有两种基因突变 :11348位 C→ T突变和 11349位 G→ A突变。 p GEM T- easy质粒克隆测序结果显示上述两种突变位于不同的染色体上。为不同染色体同一编码区 Arg(CGG) 30 4 Trp(TGG)和 Arg(CGG) 30 4 Gln(CAG)双重杂合性突变。其父亲、母亲分别为 11349位 G→ A和 11348位 C→ T杂合突变 ;其弟弟 F 基因为正常野生型 ;其哥哥和先证者的 3个子女均为杂合性突变。聚合酶链反应辅助限制性酶切证实了先证者及其家系成员的基因突变。结论　先证者 F 基因突变为不同染色体同一编码区 Arg30 4 Trp和 Arg30 4 Gln双重杂合性突变 ,此种突变类型的组合尚属首例。     

纯合子His348G1n导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系分析

目的 对1个姨表近亲结婚的遗传性凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅦ,FⅦ)缺乏症家系进行基因突变检测,探讨其分子发病机制.方法 检测凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原、血浆凝血因子活性等指标以明确诊断;用DNA直接测序法对先证者及家系成员FⅦ基因的全部外显子及侧翼、5'和3'非翻译区进行分析,寻找基因突变,用反向测序证实所发生的突变.结果 先证者PT(30.9 s)和FⅦ活性(3%)明显异常,女儿、父亲和母亲的PT(分别为21.2 s、16.3 s和16.1 s)稍延长和FⅦ活性(分别为22%、25%和35%)减低,胞弟各指标均在正常范围内;先证者FⅦ基因第8外显子的11482位为纯合T→G导致氨基酸His348Gln;女儿、父亲和母亲为His348Gln杂合子,胞弟为正常野生型.结论 该遗传性FⅦ缺乏症家系为纯合子错义突变His348Gln,推测此突变遗传自近亲结婚具有该杂合子的父母.

Abstract：

Obiective To investigate the gene mutation and the molecular pathogenesis of an inherited coagulation factor Ⅶ (F Ⅶ ) deficiency pedigree with consanguineous marriage. Methods The diagnosis was validated by coagulant parameter assay on the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time, fibrinogen and coagulation factor activity. F Ⅶ gene mutations were analyzed in the proband and other family members by direct DNA sequencing of the PCR products of all exons, exon-intron boundaries and 5' and 3' untranslated sequences. The mutations were confirmed by reverse sequencing.Results The values of PT and FⅦ activity in the proband were significantly abnormal, they were 30. 9 s and 3% respectively. The PT of her daughter, father and mother was slightly extended to 21.2 s, 16.3 s and 16. 1 s respectively, and the FⅦ activity was reduced to 22%, 25% and 35% respectively. The coagulant parameters of her younger brother were within normal range. Homozygous T→G transition at position 11482 in exon 8 was identified in the proband resulting in His348Gln, and heterozygosity for His348Gln was confirmed in her daughter and her parents, and the normal wild-type was observed in her younger brother. Conclusion Homozygous missense mutation of His348Gln was found in a pedigree of hereditary FⅦ deficiency. The mutation was inherited from her heterozygote parents.     

一个近亲结婚导致的遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系的基因突变分析

目的 对1个姨表近亲结婚的遗传性凝血因子Ⅴ (coagulation factor Ⅴ,FⅤ)缺陷症家系进行基因分析,探讨其分子发病机制.方法 检测先证者及其家系成员的凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)、血浆FⅤ活性(FⅤ∶C)和血浆FⅤ抗原(FⅤ∶Ag)等凝血指标进行表型诊断.用DNA直接测序法分析先证者及家系成员F5基因的全部外显子及侧翼、5’和3’非翻译区,发现突变位点用反向测序予以证实.结果 先证者PT和APTT均明显延长,分别为23.5s和50.5s,其FⅤ∶C(8％)和FⅤ∶Ag(＜1％)极度减低;同样先证者的妹妹PT和APTT也显著延长,分别为24.1s和62.4 s,其FⅤ∶C(7％)和FⅤ;Ag(＜1％)也极度减低;家系其他成员的PT及APTT均在正常参考范围.先证者的F5基因第5外显子测序发现其29170位为纯合突变T→C,导致190位氨基酸苯丙氨酸变为丝氨酸(Phe190Ser),先证者的妹妹同样为纯合Phe190Ser突变;大哥、大姐、大女儿、小女儿和外甥女均为Phe190Ser杂合突变,其FⅤ∶C也有所减低(分别为57％、73％、72％、66％、75％);两个弟弟为正常野生型,其FⅤ∶C和FⅤ∶Ag均在正常水平.结论 该遗传性FⅤ缺陷症家系先证者及其妹妹F5基因第5外显子存在g.29170T→C纯合型错义突变,导致Phe190Ser.其原因推测与其父母近亲结婚有关.Phe190Ser与该遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系FⅤ水平降低有关.     

一例P．Gly400Val和P．Arg532Ter导致的遗传性FXI缺陷症患者的临床表型CSCD

目的分析1例遗传性凝血因子XI（FXI）缺陷症患者的临床表型和基因突变特征。方法用凝固法检测先证者及家系成员活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time, APTT）、凝血酶原时间（prothrombintime,PT）、凝血因子Ⅺ活性（FⅪactivity,FXI：C）,ELISA方法检测凝血因子Ⅺ抗原（FXI antigen,FXI：Ag）。对F11基因第1～15外显子及其侧翼序列进行PCR扩增、纯化和测序,寻找突变位点并用Pymol软件对突变进行分析。结果先证者APTT为70．3S,明显延长,FXI：C和FⅪ：Ag同时下降为6％和1．9％。先证者儿子FⅪ：C和FⅪ：Ag均下降为31％和39％。测序结果显示先证者携带F11基因第11外显子C．1296G〉T（P．Gly400Val）错义突变和第14外显子C．1691A〉T（P．Arg532Ter）无义突变;先证者儿子为C．1296G〉T（P．Gly400Val）杂合突变携带者。Pymol软件分析显示P．Gly400Val突变导致FⅪ蛋白氢键数量变化,使蛋白质二级结构改变。根据人类基因突变数据库（HGMD professional 2016．4）,F11 NM_13142C．1691A〉T（p．Arg532Ter）为未报道过的新突变,根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）2015年指南判断为功能缺失型突变。结论F11NM_13142 C．1296G〉T（p．Gly400Val）和F11 NM_13142C．1691A〉T（P．Arg532Ter）复合杂合突变是导致先证者遗传性FXI缺陷症的致病原因,引起FXI抗原和活性同时下降。     

一个遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系表型与基因突变分析

目的 对一个由F5基因复合杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅴ（FⅤ）缺陷症家系进行表型和基因型分析，探讨其分子致病机制。方法 检测先证者及其家系成员（共3代7名成员）凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FⅠB）、凝血酶时间（TT）、血浆FⅤ活性（FⅤ:C）、FⅤ抗原（FⅤ:Ag）及其他相关凝血指标以明确诊断。通过自动校正凝血酶曲线法检测凝血酶生成量；用DNA直接测序法分析先证者F5基因的全部外显子、侧翼、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域；并用相应的生物信息学软件分析突变对蛋白功能的影响。结果先证者PT和APTT较正常对照明显延长，分别为17.9s/13.2s和46.9s/36s;FⅤ:C和FⅤ:Ag显著下降，分别为24%和28%；其父亲(Ⅰ1)、母亲(Ⅰ2)、妹妹(Ⅱ3)和儿子(Ⅲ1)FⅤ:C和FⅤ:Ag水平均有不同程度下降。基因分析显示，先证者第13号外显子存在c.2390＿2390delC杂合缺失突变（p.Pro798Leufs*13）以及第25号外显子存在c.6665A>G杂合错义突变（p.Asp2222Gly）；其父亲和妹妹为c....     

一个中国G6PD缺乏症家系致病基因的突变分析

目的对一个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症家系成员G6PD基因13个外显子全面测序,识别致病的突变位点及其遗传模式。方法在G6PD缺乏症高发区广东惠州地区收集到一个G6PD缺乏症核心家系,包括先证者(儿子)、患病母亲和正常父亲。取家系成员的外周血样,并提取基因组DNA,用PCR和DNA测序法对G6PD基因全部外显子进行序列分析。结果先证者及其母亲在G6PD基因第2号外显子出现同一点突变(c.95AG,p.His32Arg),该突变引起组氨酸被精氨酸替换(CACCGC)。然而先证者父亲在G6PD基因的13个外显子均未出现突变。3种生物信息学软件均预测该突变对蛋白质功能具有较强的危害性。结论该家系中c.95AG呈X连锁显性遗传,是G6PD缺乏症的致病突变位点之一。     

一个遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症家系中凝血因子Ⅴ基因两种新突变的鉴定

目的对一个遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症家系进行凝血因子Ⅴ（factorⅤ，FⅤ）基因突变的检测，探讨先天性凝血因子Ⅴ缺乏症的分子发病机理。方法PCR结合直接测序方法对先证者的FⅤ基因全部25个外显子及其旁侧序列进行分析，鉴别其中可能存在的基因变异。应用PCR产物反向测序法或PCR限制性内切酶分析技术对突变位点进行确证。随机选择100名健康体检者作为正常对照。结果先证者FⅤ基因存在两种突变，分别是第11外显子区的A1763C错义突变和位于第16内含子3′端剪接位点的G-T突变；家系分析表明这两个突变是双杂合子型，前者遗传自父亲，后者遗传自母亲。100名健康对照者均未发现A1763C错义突变。结论第11外显子A1763C错义突变和第16内含子3′端的剪接位点突变使先证者呈现双重杂合子型，可能是先证者FⅤ先天性缺乏的原因。     

一个遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系的表型与基因型分析

目的对1个姨表近亲婚配的遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系进行实验室表型和F12基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法检测先证者及其家系成员(共3代6人)血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ:C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ:C)、FⅫ活性(FⅫ:C)和FⅫ抗原(FⅪ:Ag)等指标,明确临床表型诊断。采用DNA直接测序法分析先证者F12基因所有外显子、侧翼、启动子区及家系成员相应的突变位点区域,并用反向测序证实所发现的突变。用ClustalX-2.1-win软件分析突变氨基酸的保守性;突变对蛋白质功能的影响则应用四个生物信息学评分软件(PolyPhen-2,PROVEAN,SIFT和MutationTaster)进行分析。结果先证者APTT(102.8s)、FⅫ:C(2%)和FⅪ:Ag(2%)明显异常;家系其他成员APTT正常,其姐姐、大女儿、二女儿和外孙的FⅫ:C和FⅫ:Ag均减低为正常对照的一半左右,表现为交叉反应物质(CRM)阴性型。基因测序发现先证者F12基因第13号外显子存在c.1556TG纯合突变,导致p.Leu519Arg;其姐姐、大女儿、二女儿和外孙均存在c.1556TG杂合突变。保守性分析结果显示Leu519在同源物种间呈高度保守;四个生物信息学软件对该突变预测的评分结果均显示为有害突变。结论F12基因13号外显子区p.Leu519Arg突变是导致该家系遗传性FⅫ缺陷症发病的原因;推测先证者纯合p.Leu519Arg突变基因分别遗传自近亲结婚的父母。     

F12基因起始密码子c.1A>G变异所致遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症一家系的遗传学分析

目的探讨1个姨表近亲婚配的遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系的临床特征与遗传学病因。方法选取2021年7月12日于瑞安市人民医院泌尿外科就诊的1个遗传性FⅫ缺陷症家系为研究对象。收集家系临床资料, 抽取受试者外周静脉血样, 分别进行凝血指标检测与基因检测, 采用Sanger测序进行家系验证, 并对候选变异进行生物信息学分析。结果遗传性FⅫ缺陷症家系成员共3代6人, 包括先证者及其父亲、母亲、妻子、妹妹和儿子。先证者为男性, 51岁, 临床表现为肾结石。凝血指标检测结果显示, 先证者活化部分凝血活酶时间(APTT)显著延长, FⅫ活性(FⅫ:C)与FⅫ抗原(FⅫ:Ag)均极度降低;先证者父亲、母亲、妹妹和儿子FⅫ:C和FⅫ:Ag均降低至正常参考值下限的一半左右。基因检测结果提示, 先证者F12基因第1外显子起始密码子存在c.1A>G(p.Arg2Tyr)纯合错义变异。经Sanger测序验证, 先证者父亲、母亲、妹妹和儿子均携带F12基因c.1A>G杂合变异, 先证者妻子未见该变异。该变异在HGMD数据库未见报道。经SIFT在线软件分析, 预测该变异为有害性变异;经Swiss-...     

F12基因复合杂合变异致遗传性FⅫ缺陷症一个家系的遗传学分析

目的对1个遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系进行实验室表型和基因变异分析, 初步探讨其分子发病机制。方法选取2021年7月17日因"慢性胃炎"就诊于宁波市第二医院的1例遗传性FⅫ缺陷症男性先证者及其家系成员(共3代7人)作为研究对象。检测先证者及其家系成员凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ:C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ:C)、FⅫ活性(FⅫ:C)和FⅫ抗原(FⅫ:Ag)等指标以明确诊断。采用DNA直接测序分析F12基因的所有外显子、侧翼、5′和3′非翻译区及家系成员相应的变异位点区域, 用克隆测序进一步证实所发生的变异。用生物信息学软件分析变异对蛋白功能的影响。结果先证者为47岁男性, APTT为180.0 s, 明显延长, FⅫ:C和FⅫ:Ag均<1.0%, 极度降低。先证者父亲、母亲、弟弟、大儿子及小儿子FⅫ:C和FⅫ:Ag均有不同程度降低。基因分析显示先证者F12基因第10外显子存在c.1092₁093insC(p.Lys365Glnfs*69)杂合插入变异及第14外显子存在c.179...     

一个遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症家系的表型及基因突变分析CSCD

目的探讨一个遗传性凝血因子Ⅴ（coagulation factor Ⅴ,FⅤ）缺陷症家系的表型特征及其分子致病机制。 方法在STAGO全自动血凝仪上检测先证者及家系成员（3代6名成员）凝血酶原时间（prothrombin time,PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）、纤维蛋白原（fibrinogen,FIB）、血浆凝血因子Ⅱ活性（coagulation factor Ⅱ activity,FⅡ∶C）、FⅤ活性（FⅤ activity,FⅤ∶C ）、凝血因子Ⅶ活性（coagulation factor Ⅶ activity,FⅦ∶C）和凝血因子Ⅹ活性（coagulation factor Ⅹ activity,FⅩ∶C）活性;ELISA方法检测FⅤ抗原（FⅤ antigen,FⅤ∶Ag）。采用DNA直接测序法分析先证者F5基因的全部外显子、侧翼序列、5′和3′端非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,发现突变位点后用反向测序予以证实。采用ClustalX软件分析突变位点的保守性,同时用生物信息学预测软件（PROVEAN和MutationTaster）分析突变对蛋白质功能的影响,用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行蛋白模型和氨基酸相互作用分析。结果先证者PT和APTT均稍延长,分别为15.2 s和41.8 s,FⅤ∶C和FⅤ∶Ag降低,分别为55%和62%;其父亲和儿子FⅤ∶C和FⅤ∶Ag也均有不同程度下降（分别为60%、65%和31%、40%）。先证者F5基因第6外显子上发现c.911G〉A杂合突变,导致Gly276Glu;其父亲和儿子也为Gly276Glu杂合子;母亲、哥哥和丈夫为正常野生型。保守性分析结果表明,Gly276在同源物种间高度保守;两个生物信息学软件对该突变的预测结果一致：PROVEAN（评分－6.214分）结果预示为有害突变;MutationTaster（评分0.976分）结果预示可引起相应疾病;突变蛋白模型分析显示,在野生型蛋白质中,Gly276的主链与Ile298之间有两个氢键,当Gly276突变为Glu276后,原有的氢键没有改变,但由于Glu侧链延长,与周围氨基酸之间增加了空间位阻,导致蛋白质稳定性下降。结论该先证者F5基因第6外显子存在c.911G〉A杂合突变,导致Gly276Glu,此突变遗传自父亲,且与该家系FⅤ水平减低有关。     

一个FGA基因杂合错义突变导致遗传性异常纤维蛋白原血症家系分析

目的对一个FGA基因杂合错义突变导致遗传性异常纤维蛋白原(Fg)血症家系进行表型和基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法采用凝固法检测先证者及其家系成员(共3代8人)的血浆纤维蛋白原活性(Fg:C)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT);免疫比浊法检测纤维蛋白原抗原(Fg:Ag)、D-二聚体(D-D)和纤维蛋白(原)降解产物(FDPs)含量;凝血酶法做纤维蛋白聚合试验。采用DNA直接测序法对先证者Fg的FGA、FGB及FGG基因所有外显子和侧翼序列、5′和3′非翻译区进行片段扩增测序,发现突变位点后用反向测序予以证实,并检测家系成员相应的突变位点区域。用ClustalX-2.1-win软件分析突变位点基因的保守性;用Mutation taster、Provean和Polyphen-2等在线生物信息学软件预测突变位点对蛋白质功能可能存在的潜在影响;并采用Pymol软件分析突变前后蛋白质空间结构及分子间作用力的改变。结果先证者TT为45.7s,明显延长,PT稍延长;Fg:C为0.91g/L,显著降低;其母亲、儿子和小女儿TT、PT和Fg:C的结果与先证者类似;先证者及家系其他人员Fg:Ag、APTT、FDPs、D-D均在正常范围内。与正常对照相比,先证者凝血酶诱导的纤维蛋白聚集曲线斜率和最大聚集率明显降低。基因检测结果显示先证者FGA基因第6外显子存在c.2185GA杂合错义突变导致p.Glu710Lys,其母亲、儿子和小女儿均存在c.2185GA杂合错义突变。Glu710位点在同源物种中高度保守;生物信息学软件预测显示该突变位点会影响蛋白质功能;蛋白质模型分析表明,Glu710是一种带负电荷的极性氨基酸,在野生型中与Arg838形成氢键,当突变为Lys710后变为带正电荷的极性氨基酸,突变没有破坏氢键的天然网络,但Lys710与Arg838之间的静电吸引力消失,该位点的侧链缩短,从而降低了稳定性。结论本研究发现了纤维蛋白原α链c.2185GA杂合错义突变引起Fg分子间静电变化,降低了结构稳定性,其与该家系引起异常纤维蛋白原血症有关。     

复合杂合性蛋白C基因突变导致的遗传性蛋白C缺陷症家系分析

目的 对1个遗传性蛋白C(proteinC,PC)缺陷症家系进行蛋白 C基因(protein C gene,PROC)突变检测,探讨其分子发病机制.方法 通过检测先证者及其家系成员(共4代15人)血浆蛋白C活性(protein C activity,PC∶A)、蛋白C抗原含量(protein C antigen,PC∶Ag)及其他凝血指标进行表型分析;用PCR法扩增先证者PROC的9个外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后测序,发现突变位点则反向测序予以证实;针对先证者的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测.结果 先证者PC∶ A和PC∶Ag明显降低,分别为26％和18.60％,家系中其他成员中有7人PC∶A降低,6人PC∶Ag降低.先证者的PROC第7外显子存在g.6128T＞G杂合错义突变导致p.Phe139Val,第9外显子存在g.8478G＞C杂合错义突变导致p.Asp255His;其祖母、父亲、三姑和四姑均存在g.6128T＞G杂合突变,母亲、二舅、妹妹和儿子均存在g.8478G＞C杂合突变.存在g.8478G＞C突变的成员PC∶A下降明显.结论 先证者PROCg.6128T＞G和g.8478G＞C突变分别来自其父系家族和母系家族,该复合杂合错义突变是导致遗传性PC缺陷症的分子基础.     

遗传性FⅪ缺陷症一家系的F11基因新复合杂合变异分析

目的对1个复合杂合变异导致的遗传性凝血因子Ⅺ(coagulation factorⅪ,FⅪ)缺陷症家系进行表型和基因变异分析,探讨其发病的分子机制。方法检测先证者及其家系成员(共3代11人)的活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)、血浆FⅪ活性(FⅪactivity,FⅪ∶C)及FⅪ抗原(FⅪantigen,FⅪ∶Ag)等指标以明确诊断;用Sanger测序法分析先证者F11基因的所有外显子及侧翼序列、5′和3′非翻译区及家系成员相应的变异位点区域,用反向测序予以证实。用PolyPhen-2和SIFT软件分析变异对蛋白质功能的影响;用Swiss-PdbViewer软件对变异位点进行蛋白模型和氨基酸相互作用分析。结果先证者和其姐姐APTT、FⅪ∶C、FⅪ∶Ag均明显异常,分别为73.0 s、10.0%、15.0%和87.1 s、2.0%、11.5%;其部分家系成员的APTT稍有延长,FⅪ∶C和FⅪ∶Ag也均有不同程度的下降。基因分析发现先证者及其姐姐F11基因第7外显子存在c.738G>A杂合变异(p.Trp228stop),第9外显子存在c.938G>T杂合变异(p.Ser295Ile);其父亲、妹妹、女儿均为p.Trp228stop的杂合子,而母亲、外甥则为p.Ser295Ile的杂合子。p.Ser295Ile变异PolyPhen-2评分结果为0.840分,预示此变异很可能是有害变异;SIFT评分结果为0.00分,预示此变异为有害变异,可影响蛋白质功能;模型分析显示p.Ser295Ile变异破坏了氨基酸间其中一个氢键的联系,使蛋白结构发生变化,不稳定性增加。结论该先证者的F11基因第7外显子存在c.738G>A(p.Trp228stop)杂合变异及第9外显子存在c.938G>T(p.Ser295Ile)杂合变异;p.Trp228stop遗传自父亲,p.Ser295Ile遗传自母亲,且与该家系FⅪ水平降低有关。     

一个Gly341Arg纯合突变所致遗传性FⅫ缺陷症近亲婚配家系的分析CSCD

目的对一个姨表近亲婚配的遗传性凝血因子Ⅻ（coagulation factor FⅫ,Ⅻ）缺陷症家系进行实验室表型和F衄基因突变的分析,探讨其分子发病机制。方法检测先证者及9名家系成员活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）等凝血常规功能、FⅫ活性（FⅫactivity,FⅫ：c）和FⅫ抗原（FⅫantigen,FⅫ：Ag）含量,进行表型诊断;用DNA直接测序法分析先证者FⅫ基因所有14个外显子、侧翼、5’和3＇非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,用反向测序证实突变。采用ClustalX-2．1-win软件分析突变氨基酸的保守性,并同时采用4个生物信息学评分软件（PolyPhen-2,PROVEAN,SIFT和Mutation Taster）分析突变对蛋白质功能的影响。结果先证者（IV2）和哥哥（Ⅳ1）APTT明显延长（分别为61．6s和68．6s）,FⅫ：C和FⅫ：Ag分别降低为12％、10％和11％、10％;先证者祖母（Ⅱ2）、外祖母（Ⅱ3）、父亲（Ⅲz）、母亲（Ⅲ6）、大姑（Ⅲ1）和大姨（Ⅲ5）APTT正常,FⅫ：C和FⅫ：Ag均降低约为正常值的一半;先证者小姑（Ⅲ3）和大舅（Ⅲ4）各项指标及家系成员其它指标均正常。基因测序发现先证者（IV。）和其哥哥（Ⅳ1）FⅫ基因第10外显子存在c．1078G〉A（P．Gly341Arg）纯合错义突变;先证者祖母（Ⅱ2）、外祖母（Ⅲ3）、父亲（Ⅲ2）、母亲（Ⅲ6）、大姑（Ⅲ1）和大姨（Ⅲ5）均存在P．Gly341Arg杂合错义突变;先证者小姑（Ⅲ3）和大舅（Ⅲ4）为正常野生型。ClustalX-2．1-win软件保守性分析结果表明,Gly341在同源物种间高度保守。4个生物信息学软件对该突变的预测结果一致：PolyPhen-2评分（0．934分）、PROVEAN评分（-6．214分）均预示为有害突变;Mutation Taster评分（0．976分）预示可引起相应疾病;SIFT评分（0．01分）预示可影响蛋白质功能。结论Gly341Arg纯合错义突变是该家系遗传性FⅫ缺陷症的分子发病机制,与先证者父母近亲结婚有关。     

F5基因复合杂合变异导致遗传性凝血因子V缺陷症1个家系分析

目的 探讨一种F5基因新变异导致复合杂合性遗传性凝血因子Ⅴ(FⅤ)缺陷症家系的分子致病机制。方法 检测先证者及其家系成员(3代10人)的相关凝血指标。通过CAT法检测凝血酶生成量。应用直接测序法分析先证者F5基因全部外显子及其侧翼序列。使用计算机预测软件分析变异氨基酸位点的保守性及变异后对蛋白质功能的影响。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)变异评级指南对变异位点进行评级。结果 先证者凝血酶原时间(PT)为25.2 s、活化部分凝血活酶时间(APTT)为84.4 s,均显著延长;血浆FⅤ活性(FⅤ:C)和FⅤ抗原(FⅤ:Ag)分别为6%和8%,极度降低。先证者凝血酶生成量降低和达峰时间延长。基因测序发现先证者第13外显子存在父源c.4594C>T(p.Gln1532^*)杂合无义变异和第25外显子存在母源c.6665A>G(p.Asp2222Gly)杂合错义变异。保守性分析表明Gln1532呈高度保守;3种在线生信学软件Mutation Taster、SIFT及PolyPhen-2均显示该两种变异为有害变异;蛋白质模型分析表明p.Gln1532<...