高压氧和氯化血红素联合干预对一氧化碳中毒大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的：观察高压氧和氯化血红素联合治疗对急性一氧化碳中毒大鼠脑海马内凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响，并与单纯应用高压氧治疗进行比较。方法：实验于2005-01／05在华北煤炭医学院解剖学实验室完成。取200只雄性SD大鼠随机分成4组各50只：①模型组：大鼠放入染毒罐，然后向罐内注入体积分数为0．998一氧化碳气体，60min后取出。②高压氧组：造模同模型组，造模后立即进行高压氧治疗，0，2MPa，升压30min，稳压给氧60min，减压40min。1次／d。③高压氧＋氯化血红素组：除给予高压氧组同样的处理外，于一氧化碳中毒后立即腹腔注射氯化血红素30mol／kg，3次／d。④对照组：不作任何处理。4组均于造模后1，3，5，7和14d各处死10只大鼠，分别行免疫组化染色和免疫蛋白印迹法，观察大鼠脑海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数和灰度值的变化。结果：200只大鼠全部进入结果分析。①脑海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数：模型组各个时间点显著高于对照组（P〈0．05），中毒后5d达高峰[（87．9&;#177;1．4）个／视野，P〈0．05]；高压氧组和高压氧＋氯化血红素组各个时间点阳性细胞数均低于模型组（P〈0．05）；而高压氧＋氯化血红素组低于高压氧组（P〈0．05）。②脑海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的灰度值：模型组各个时间点显著高于对照组（P〈0．05），中毒后5d达高峰（89．1&;#177;1．4）；高压氧组和高压氧＋氯化血红素组各个时间点均低于模型组（P〈0．05）；而高压氧＋氯化血红素组低于高压氧组（P〈0．05）。结论：急性一氧化碳中毒后大鼠脑海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达升高，高压氧和氯化血红素联合治疗显著降低其表达，效果优于单纯高压氧治疗。     

一氧化碳中毒大鼠脑红蛋白表达变化及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的:观察急性一氧化碳中毒后脑红蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化及氯化血红素对上述两者表达变化的影响。方法:实验于2005-01/08在华北煤炭医学院解剖学实验室完成。150只雄性SD大鼠随机分成3组,每组50只。①一氧化碳中毒组:大鼠放入染毒罐,静式吸入一氧化碳与空气的混合气60min。造模后分别于1,3,5,7和14d处死,每个时间点10只大鼠。②氯化血红素治疗组:除给予一氧化碳中毒组同样的处理外,于造模后立即注射氯化血红素(30mol/kg,3次/d)直至相应时间点处死,每个时间点10只大鼠。③对照组:不作任何处理,在相应时间点处死。各组大鼠分别行免疫组化染色和免疫蛋白印迹法,观察大鼠脑内的脑红蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化。结果:150只大鼠均进入结果分析。①免疫组化阳性神经细胞数目:一氧化碳中毒组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目持续下降,至中毒后14d最低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞逐渐增多,至中毒后5d达高峰,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。经氯化血红素治疗后,与中毒组相比脑红蛋白的表达明显增多,与中毒组相比差异有统计学意义(P<0.01);同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的阳性细胞数明显下降,与中毒组相比差异有统计学意义(P<0.05)。②免疫蛋白印迹灰度分析:一氧化碳中毒组脑红蛋白的表达持续下降,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达上升,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);氯化血红素治疗组与中毒组相比,脑红蛋白表达量上升(P<0.01);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达下降,治疗5d最显著(P<0.01)。结论:一氧化碳中毒后大鼠脑红蛋白表达呈持续下降;刺激脑红蛋白表达可抑制急性一氧化碳中毒后大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。     

高压氧和氯化血红素联合干预对一氧化碳中毒大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的:观察高压氧和氯化血红素联合治疗对急性一氧化碳中毒大鼠脑海马内凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响,并与单纯应用高压氧治疗进行比较。方法:实验于2005-01/05在华北煤炭医学院解剖学实验室完成。取200只雄性SD大鼠随机分成4组各50只:①模型组:大鼠放入染毒罐,然后向罐内注入体积分数为0.998一氧化碳气体,60min后取出。②高压氧组:造模同模型组,造模后立即进行高压氧治疗,0.2MPa,升压30min,稳压给氧60min,减压40min。1次/d。③高压氧 氯化血红素组:除给予高压氧组同样的处理外,于一氧化碳中毒后立即腹腔注射氯化血红素30mol/kg,3次/d。④对照组:不作任何处理。4组均于造模后1,3,5,7和14d各处死10只大鼠,分别行免疫组化染色和免疫蛋白印迹法,观察大鼠脑海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数和灰度值的变化。结果:200只大鼠全部进入结果分析。①脑海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数:模型组各个时间点显著高于对照组(P<0.05),中毒后5d达高峰犤(87.9±1.4)个/视野,P<0.05犦;高压氧组和高压氧 氯化血红素组各个时间点阳性细胞数均低于模型组(P<0.05);而高压氧 氯化血红素组低于高压氧组(P<0.05)。②脑海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的灰度值:模型组各个时间点显著高于对照组(P<0.05),中毒后5d达高峰(89.1±1.4);高压氧组和高压氧 氯化血红素组各个时间点均低于模型组(P<0.05);而高压氧 氯化血红素组低于高压氧组(P<0.05)。结论:急性一氧化碳中毒后大鼠脑海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达升高,高压氧和氯化血红素联合治疗显著降低其表达,效果优于单纯高压氧治疗。     

脑缺血缺氧性模型大鼠脑红蛋白表达变化及氯化血红素的刺激效应

目的：观察脑缺血缺氧性模型大鼠脑红蛋白表达的变化及氯化血红素对其表达的影响。 方法：实验于2006-0I／03在华北煤炭医学院神经内科实验室完成。150只雄性Wistar大鼠按数字表法随机分成3组，即模型组、氯化血红素组、对照组，每组50只。①模型组：动物麻醉后切开颈前皮肤，游离双侧颈总动脉，同时阻断双侧颈总动脉血流。缺血过程中动物出现眼发白、呼吸加快、竖毛、癫痫、抽搐等并发症为模型成功。②氯化血红素组：除给予模型组同样的处理外，于造模前注射氯化血红素9次（30mol／kg．腹膜注射，3次／d）。③对照组：为假手术组，同样麻醉，剥离双侧颈总动脉，但不阻断血流。分别在血流阻断（对照组在手术后）后1，5，15，30．60min将大鼠麻醉下断头，迅速取大脑。每组每个时间点10只大鼠。各组大鼠分别行免疫组化染色和免疫蛋白印迹法，观察大鼠脑内脑红蛋白表达变化： 结果：大鼠实验过程中无死亡，150只全部进入结果分析。①模型组大鼠脑红蛋白在缺血1min表达迅速增加达高峰，5min仍维持在高水平，与对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05）；缺血15min后迅速降低，以后又见缓慢升高，但与对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。②氯化血红素干预组缺血1min和5min脑红蛋白表达快速升高，但与模型组相比差异无显著性意义（P〉0．05）；缺血15min脑红蛋白仍维持在高水平，与模型组和对照组相比差异有显著性意义（P〈0．05）；缺血30min和60min脑红蛋白已迅速降低，与对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。 结论：脑缺血缺氧性模型大鼠脑红蛋白呈规律性变化；氯化血红素可以刺激脑缺血缺氧性模型大鼠脑红蛋白表达增多。     

环氧合酶2表达对帕金森病模型小鼠黑质细胞凋亡的影响

目的：观察环氧合酶2表达对帕金森病模型小鼠中脑黑质细胞凋亡的影响。方法：实验于2005—01／08在华北煤炭医学院解剖学教研室实验室完成。健康雄性C57BL／6N小鼠45只随机分为3组，每组15只。①模型组：皮下注射神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢毗啶（1-methyl-4-phenyl—1，2，3，6-tetrahydropyri-dine，MPTP）（30mg／kg，盐水溶），1次／d，连续5d。②环氧合酶2抑制剂组：在MPTP注射前3d经口给予环氧合酶2抑制剂Celecoxib（250mg／kg），1次／d，连续3d，随后在每天注射MPTP前3．0h给予1次Celecoxib，连续5d。③对照组：注射与模型组等体积生理盐水。所有动物于最后一次注射后24h处死。通过免疫组织化学和免疫蛋白印记法，观察帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元数量和黑质环氧合酶2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和多（ADP-核糖）聚合酶免疫反应阳性细胞数量的变化及腹侧中脑环氧合酶2、凋亡蛋白酶活化因子1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达水平的变化；观察给予环氧合酶2抑制剂Celecoxib后对上述变化的影响。结果：与对照小鼠相比，模型组小鼠多巴胺能神经元数量下降约63％（P〈0．01），黑质环氧合酶2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和多（ADP-核糖）聚合酶免疫反应阳性细胞数量增加（P〈0．01），腹侧中脑环氧合酶2、凋亡蛋白酶活化因子1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达水平大幅升高（P〈0．01）。环氧合酶2抑制剂组小鼠黑质多巴胺能神经元数量仅较对照组下降约37％（P〈0．01）。与模型组小鼠比较，黑质环氧合酶2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和多（ADP-核糖）聚合酶免疫反应阳性细胞数量减少（P〈0．01），腹侧中脑环氧合酶2、凋亡蛋白酶活化因子1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达水平明显下降（P〈0．01）。结论：帕金森病小鼠黑质细胞凋亡可能与环氧合酶2表达有关；环氧合酶2抑制剂Celecoxib对帕金森病小鼠具有神经保护作用。     

不同年龄大鼠坐骨神经损伤后睫状神经营养因子对脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达的影响

背景：天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3是一种促进细胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶，睫状神经营养因子具有多种生物活性，能保护损伤后多种神经元特别是运动神经元，减少神经细胞损伤的发生。目的：观察睫状神经营养因子对天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3在坐骨神经损伤后不同年龄大鼠脊髓组织中的表达以及在不同年龄阶段的变化规律和调控特点。设计：随机对照动物实验。单位：解放军第三军医大学野战外科研究所大坪医院超声科、第五研究室。材料：实验于2000-04／2001—12在解放军第三军医大学野战外科研究所完成。Wistar大鼠，体质量30～100g的幼年大鼠（鼠龄20d）、200—350g的成年大鼠（鼠龄4个月）、400-800g的老年大鼠（鼠龄18-24个月）各270只，雌雄不限，共810只。方法：①实验动物分组：各年龄组大鼠随机分为正常组（n=18）、睫状神经营养因子组（n=126）和生理盐水组（n=126），睫状神经营养因子组和生理盐水组分为术后1d、3d、1周、2周、4周、8周、12周组。②动物模型制作：睫状神经营养因子组和生理盐水组切除2mm右侧坐骨神经，用硅胶管连接近、远侧神经残端制作神经再生小室，睫状神经营养因子组再生小室内注入25mg／L重组睫状神经营养因子15μL，生理盐水组再生小室内注入生理盐水15μL。③待测标本的制作及检测：分别取各组动物6只，取脊髓L3-5节段，进行天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3免疫组织化学检测、天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性检测和Western blotting检测。主要观察指标：①免疫组织化学检测的各组大鼠脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的表达。②Western blotting检测脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的分布与表达强度变化。③天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性变化。结果：810只大鼠进入结果分析。①免疫组织化学检测各组大鼠脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的表达：损伤后各年龄组生理盐水组伤侧神经元天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3染色表达增强，伤后2周、4周明显增多、增强，8周、12周较少神经元表达阳性；睫状神经营养因子组损伤后各年龄组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达增强，伤后2周、4周最为明显。②Western blotting检测脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的分布与表达强度变化：各年龄正常组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达差异无显著性意义（P〉0．05）。与同龄正常组及对侧未伤侧比较，各年龄组生理盐水组及睫状神经营养因子组损伤后1周、2周、4周天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达增强，差异有显著性意义（P〈0．05～0．01）；睫状神经营养因子组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3幼年于损伤后1周、2周、4周，成年于2周、4周，老年于4周表达较生理盐水组减弱，差异有显著性意义（P〈0．05-0．01）。各组对侧未伤侧与正常组比较，差异无显著性意义（P〉0．05）。③天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性变化：幼年、成年、老年生理盐水组伤侧脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性升高，各时相点幼年大鼠天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性高于老年组及成年组（P〈0．05～0．01），幼年、成年、老年组睫状神经营养因子组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性低于生理盐水组（P〈0．05～0．01）。损伤后生理盐水组及睫状神经营养因子组对侧未伤侧天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性，除幼年伤后12周较正常组低外（P〈0．05），其余各组与正常组比较，差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：坐骨神经损伤后不同鼠龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达及活性增高，外源性睫状神经营养因子可减少脊髓神经元中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达及活性，起保护脊髓神经细胞的作用，其作用在幼年组、成年组及老年组依次减弱。     

乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡的影响

目的：观察乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后导致的细胞凋亡的影响。方法：实验于2005—09／2006—05在华中科技大学协和医院麻醉学实验室完成。纳入SD大鼠81只，先以“随机数字表法”分为糖尿病组（链尿佐菌素55mg／kg腹腔注射诱导，45只大鼠诱导成功36只，成模率80％）和正常对照组（36只）。以穿线结扎左冠脉制备心肌缺血再灌注模型，两组大鼠再分别随机分为假手术组、缺血再灌注组和乙酰半胱氨酸治疗组，每组12只。乙酰半胱氨酸给药组：100mg／kg（用蒸馏水配成50g/L的溶液）灌胃，2次／d，连续1周，手术前1h再腹腔注射乙酰半胱氨酸150mg／kg；其他各组给予等量的蒸馏水。反转录-聚合酶链反应和免疫蛋白印迹分析法检测心肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA和蛋白的表达。原位末端标记法检测心肌凋亡细胞并计算凋亡指数。同时检测丙二醛含量和肌酸激酶同工酶活性。结果：去除诱导糖尿病模型失败的9只大鼠，最终有72只大鼠进入结果分析。①糖尿病与正常假手术组之间相比，丙二醛、肌酸激酶同工酶、凋亡指数、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA和蛋白的表达水平差异无显著性意义（P〉0．05）。（砻缺血再灌注后，糖尿病和正常乙酰半胱氨酸治疗组丙二醛、肌酸激酶同工酶、凋亡指数、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA和蛋白的表达水平均低于各自对应的缺血再灌注组（P〈0．01），高于各自假手术组（P〈0．01）。（固上述参数糖尿病缺血再灌注组高于正常缺血再灌注组（P〈0．01），糖尿病乙酰半胱氨酸干预组高于正常乙酰半胱氨酸干预组（P〈0．01）。结论：乙酰半胱氨酸可抑制缺血再灌注后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA和蛋白的表达，减少缺血再灌注引起的糖尿病和非糖尿病大鼠心肌细胞凋亡，对缺血再灌注心肌有保护作用，但糖尿病组的疗效低于正常组。     

双后肢腰椎退行性变大鼠椎间盘半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达

目的：观察双后肢腰椎退行性变大鼠模型中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的表达变化。 方法：实验于2005-05／2006-03在上海中医药大学动物中心实验室完成。将20只雄性SD大鼠单纯随机分为正常组和模型组2组，各10只。模型组大鼠离断双肩关节，模拟直立行走，正常组不干预。3个月后，拉颈处死动物．取腰椎L3-4和L4-5，椎间盘，使用电镜观察腰椎间盘细胞微观形态；免疫组化法检测关节软骨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达，阳性表达为棕黄色，主要存在于细胞浆内，用平均灰度值和平均吸光度对阳性信号进行量化（灰度值越小表达信号越强，平均吸光度则反之）；反转录一聚合酶链反应法检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3mRNA的表达强度。 结果：20只大鼠均进入实验结果分析，无脱失。①正常组未见有明显凋亡细胞，而模型组椎间盘出现明显凋亡。②半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达：模型组明显高于正常组（平均灰度值：134．67&;#177;11．12，178、10&;#177;1．08，P＜0．01；平均吸光度：0．282&;#177;0．034，0．155&;#177;0．005，P＜0．01）。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA表达：模型组明显高于正常组（2．642&;#177;0．365．0．172&;#177;0．028，P＜0．01）。 结论：双后肢腰椎退行性变大鼠模型中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达增高，细胞凋亡增多。     

大鼠脑血肿周围组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达变化与尼莫地平的影响

目的：观察脑出血后血肿周围半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。及尼莫地平对其的影响。方法：实验于2004—07在大连医科大学中心实验室进行。取120只SD雄性大鼠随机分为3组：①尼莫地平组（n=50）：尾壳核注射自体股动脉血50μL复制脑出血模型，造模即刻腹腔注射尼莫地平1．6mg／kg（即8μL／g），以后每天1次。②模型组（n=50）：同前造模，术后腹腔注射等量生理盐水。③假手术组（n=20）：手术，但进针人尾壳核后不注血。各组分为术后6，24，48，72h、5d 5个时间点。造模动物醒后进行Bederson评分，评估其行为和神经功能缺陷（0—3分。评分越高，神经功能缺陷越重，评分≥2分为造模成功）。人组动物在以上5个时间点进行Bederson评分后，麻醉状态下处死取脑，经尾壳核行冠状切片，行免疫组化测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达。结果：80只大鼠进入结果分析。①Bederson评分：模型组、尼莫地平组大鼠醒后迅速出现偏瘫，24h后评分趋于稳定，至72h之间评分最高，然后逐渐下降，5d时仍有体征。模型组、尼莫地平组各时间点评分均高于对照组（P〈0．01），尼莫地平组术后48，72h评分低于模型组（P〈0.05）。②血肿周围组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达：假手术组进针侧脑组织表达很少，模型组6h后即有表达，24h达高峰，持续72h后逐渐下降，5d后仅有少量表达；尼莫地平组动态变化趋势与模型组相同，但各时间点的数值均较低，尤其是术后24～72h（P〈0．01）。结论：①脑出血后血肿周围组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达升高，提示其与脑出血血肿周围组织损伤有一定关系。②尼莫地平降低脑出血后血肿周围组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达，从而减轻细胞凋亡程度，对神经细胞起到保护作用，降低神经功能缺陷。     

电针对急性脊髓损伤后Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的：观察电针治疗对大鼠脊髓损伤后神经细胞再生修复过程中Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响．并与甲基强的松龙进行阳性对照。 方法：实验于2003-04／2004-06在佳木斯医学院中心实验室进行。①将健康成年Wistar大鼠64只单纯随机分为模型组、电针组、甲基强的松龙组及假手术组4组（n=16），除假手术组外。其他3组大鼠采用改良的Allen’s捶击法（50g&;#183;cm）制成大鼠T10脊髓损伤模型，假手术组仅切除椎板。不损伤脊髓。②电针组在损伤后即刻取督脉上的大椎和命门两穴进行治疗，电针频率2Hz,疏密波形,强度2．5mA，以针刺处肌肉轻微抖动为宜，持续30min。甲基强的松龙组在损伤后即刻尾静脉内注射30mg／kg甲基强的松龙。模型组和假手术组不做治疗。③各组分别于术后6,24h各处死8只。应用免疫组织化学方法及图像定量分析法观察各组脊髓损伤早期Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达。 结果：经补充后61只大鼠进入结果分析。①脊髓损伤后6h：电针及甲基强的松龙组Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数少于假手术组（P〈0．05）。灰度值高于假手术和模型组相（P〈0．05,0．01）。②脊髓损伤后24h：电针及甲基强的松龙组Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数少于假手术组和模型组（P〈0．05），灰度值高于假手术和模型组（P〈0．05，0．01）；但电针与甲基强的松龙组组问差异不显著（P〉0．05）。 结论：电针可使Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达下调，从而抑制细胞凋亡，保护神经细胞，对损伤脊髓的修复有积极的治疗作用，其效果与甲基强的松龙相似。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

DKK1真核表达质粒的构建及表达产物鉴定

目的构建人DKK1基因的真核表达质粒,表达、纯化、鉴定其表达产物。方法自宫颈癌组织提取癌细胞,抽提mRNA,RT-PCR获得人DKK1基因片断,构建重组质粒pCMV-HA2/DKK1,EcoRⅠ酶切、测序鉴定重组质粒;借助脂质体将载体瞬时转染入Free-Style293-F细胞(无血清培养)蛋白印迹法检测DKK1蛋白。结果 RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pCMV-HA2/DKK1重组质粒构建成功;DKK1蛋白分泌表达在Free-Style293-F细胞培养液中,WesternBlot鉴定表达产物为DKK1蛋白。结论成功构建了人DKK1的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步的DKK1蛋白对肿瘤发生中的生物学活性研究奠定基础。     

Synthetic inotropes inhibit the expression of adhesion molecules and augment the expression of L-selectin in polymorphonuclear neutrophils

OBJECTIVES: To elucidate differential functional and phenotypic changes in response to clinically relevant synthetic inotropes plus the generation of oxidative free radicals by polymorphonuclear neutrophils (PMN), and changes in the expression of L-selectin and Mac-1 on the surface of PMN were examined in the presence of dobutamine and dopexamine in pharmacological concentrations. DESIGN: Prospective, in vitro study. SETTING: Research laboratory. SUBJECTS: Human PMN obtained from healthy donors. INTERVENTIONS: PMN were pretreated with dobutamine 147.99 nM or 147,990 nM, or dopexamine 100 nM or 100,000 nM, followed by stimulation with FMLP. Stimulated neutrophils were incubated with antibiodies against CD11b or CD62l and assessed by flow cytometry. Additional probes were assessed by flow cytometry for the generation of oxidative free radicals. MEASUREMENTS AND MAIN RESULTS: Low concentrations of both synthetic inotropes significantly inhibit the suppression of CD62l expression following stimulation with N-formyl-l-methionyl-l-leucyl-l-phenylalanine; high concentrations antagonize this effect. High concentrations of both synthetic inotropes suppresses the expression of CD11b. Neither dobutamine nor dopexamine modified the generation of oxidative free radicals. CONCLUSIONS: While the upregulation of Mac-1 expression is inhibited in a dose-dependent manner, the expression of L-selectin is enhanced at low concentrations of dobutamine and dopexamine and partly counter-regulated at high concentrations. It seems that synthetic inotropes can modulate the immunomodulatory ability by inhibition of PMN rolling and modification of PMN adherence and diapedese.     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的:构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4,PF4)的真核表达载体,并在真核细胞中表达,为研究其生物学功能奠定基础。方法:人工合成PF4基因模板,通过PCR方法扩增PF4-cDNA,然后克隆至pUC19克隆载体,经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果:获得了PF4-cDNA基因,序列分析表明,该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明,PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示,此载体成功转染至COS7细胞中,并获得有效表达。结论:利用基因工程技术,成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体,并在真核细胞中获得有效表达,为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。     

Ritual: the final expression of care

Hospice nurses know that all their patients will die. There are several potential benefits of including rituals and healing practices into the hospice care setting for staff. Evidence suggests that not only does it provide an outlet for hospice workers to express their grief and reflect on their work in an accepting environment; providing closure for their patient's passing but it has also been shown to decrease the risk of burnout and compassion fatigue. This article discusses the important aspects of grief rituals and provides an illustrative example of one such ritual.     

Subcellular trafficking of the cytoplasmic expression system

Cationic liposomes have provided many advantages over viral vector formulations; however, the problem of inefficient gene expression remains. This is due in part to the nuclear membrane, which limits DNA entry into the nucleus. Cytoplasmic expression systems using T7 RNA polymerase have been developed to express genes in the cytoplasm and avoid the need for nuclear import of DNA. Although these systems show improved transgene expression, little is known about how they function in transfected cells. Direct comparisons between a cytoplasmic and nuclear expression system were carried out with a 293 cell line stably expressing T7 RNA polymerase. A formulation for optimal reporter gene expression was developed and used in conjunction with a variety of subcellular trafficking inhibitors to study the process of DNA endocytosis. Transfected cells were also studied at different stages of the cell cycle to determine the dependence of each system on mitosis. These results showed that cytoplasmic and nuclear expression systems utilize similar endocytosis pathways to the point of endosomal release. Once DNA is released into the cytoplasm, the cytoplasmic expression system shows immediate expression that is proportional to the amount of DNA released. In contrast, DNA targeted for nuclear expression requires additional time for nuclear entry. The level of nuclear expression is also restricted by the limited amount of DNA that is imported into the nucleus. Finally, mitosis is required for effective nuclear expression but not for cytoplasmic expression. Therefore, the cytoplasmic expression system has considerable advantages over traditional nuclear expression systems and may be an effective method for transfecting nondividing cells. Efficient expression of genes delivered by nonviral vectors is hindered owing to poor nuclear transport of plasmid DNA. A potential solution to this problem would be to use a cytoplasmic expression system. Previous studies have shown that this method produces enhanced gene expression when compared with traditional nuclear expression systems; however, the actual mechanisms by which the cytoplasmic expression system works remains unknown. This article focuses on a direct comparison between cytoplasmic and nuclear expression in terms of optimal DNA delivery formulations, intracellular trafficking of DNA, and cell cycle dependence. These results indicate that the cytoplasmic expression system has two primary advantages over nuclear expression in that it does not rely on nuclear DNA transport or mitosis for efficient expression.     

DRAM基因真核表达载体的构建及其表达对HepG_2细胞的作用

目的:构建DRAM全长cDNA的真核表达载体pEGFP-DRAM,观察DRAM在人肝细胞HepG2中的作用。方法:应用RT-PCR技术扩增获得DRAM全长cNDA,克隆扩增产物,经酶切、DNA测序鉴定正确后,构成pEGFP-DRAM的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HepG2细胞,在激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察DRAM的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期和死亡细胞,MTS法检测细胞增殖能力,Westernblot鉴定细胞表达蛋白质的水平,并在透射电子显微镜下观察自噬体。结果:构建完成的真核表达重组质粒pEGFP-DRAM,经DNA测序证实与GenBank中的人DRAM cDNA序列一致。LSCM下可观察到转染DRAM的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。流式细胞分析仪检测显示,转染DRAM的HepG2死亡细胞明显增高(P<0.05);G1期细胞百分数则明显减少(P<0.05);MTS法检测结果显示转染DRAM的HepG2细胞增殖力明显增高(P