大鼠生精小管体视学及PCNA、凋亡表达的发育变化研究

目的　探讨大鼠生精小管面积、管腔等体视学参数与生精细胞增殖、凋亡在发育过程中的变化及其之间的关系。　方法　应用免疫细胞化学、凋亡细胞原位检测和图像分析技术。　结果　大鼠从出生后生精小管平均面积逐渐增加 ,于生后 3月龄时达到最大 ,除与生后 6月龄组差异不显著外 ,与其他各组间差异显著 (P <0 0 5 ) ,6月龄后生精小管面积逐渐减少 ,2 5月龄时生精小管面积与 3周龄时相当 ;生精小管在 3周龄时开始出现管腔 ,在生后 6月龄时其平均面积最大 ,与其他各组间差异显著或极显著 (P <0 0 5或P <0 0 1) ,至生后 2 5月龄 ,管腔不明显 ,多被结缔组织填充 ;生精细胞间于生后 10月龄开始出现空泡 ,生后 2 5月龄空泡化明显 ,生精小管基膜及间质血管增生严重。PCNA及凋亡的阳性表达在生后 3周龄出现高峰 ,生后 2 5月龄细胞凋亡又出现 1个高峰。　结论　 1 生后 3周龄至 3月龄生精细胞增殖旺盛是生精小管平均面积迅速增大的原因之一。 2 生后一定阶段生精小管管腔的出现与生精细胞的凋亡有关 ,而生精小管管腔的出现有利于精子的生成与运输。 3 衰老大鼠生殖功能的下降与其组织结构的纤维化及生精小管基膜厚度增加等因素有关     

不同阶段生精小管组织学结构研究

目的探讨不同阶段人体睾丸生精小管面积、生精小管管腔面积变化和生精上皮在不同阶段的组织学特点,及其与生殖的关系。方法:应用常规组织制片技术和图像分析技术。结果①生精小管平均面积变化,从胚胎睾丸形成到青春期前,随睾丸逐渐发育增大,睾丸间质增多,但生精小管面积无明显增大;自青春期生精小管面积迅速增大,25岁左右达到峰值,45岁左右生精小管平均面积缓慢减少,55岁以后显著减少。②生精小管管腔面积变化,从胚胎睾丸形成到青春期前,生精小管几乎无管腔;青春期管腔开始出现并迅速增大,20岁左右达到峰值;于45岁左右管腔面积缓慢减少,55岁以后显著减少。③生精小管的组织学结构变化,从胚胎睾丸形成到青春期前,生精小管上皮由精原细胞和支持细胞组成,但随睾丸发育增大,睾丸间质增多,生精小管上皮和基膜间渐出现明显的间隙;青春期开始,生精小管上皮发育,生精细胞层数增加,管壁各级生精细胞典型,腔面可见精子;55岁后睾丸纤维化明显,生精小管皱缩,随年龄增长,生精上皮细胞数量渐减少,排列紊乱,基膜增厚。结论①生精细胞增殖旺盛是生精小管平均面积迅速增大的原因之一;生精细胞增殖旺盛的阶段是20～30岁,最佳时期是25岁左右。②生精小管管腔的出现与生精细胞的凋亡、基膜扩大的速率远远大于生精细胞的增殖水平有关,而生精小管管腔的出现有利于精子的生成与运输。③衰老睾丸生殖功能的下降与其组织结构的纤维化及生精小管基膜厚度增加等因素有关。     

高脂饮食诱导小鼠血糖增高损伤睾丸微血管功能

目的观察高脂饮食诱导C57BL/6雄性小鼠血糖升高对睾丸微血管功能及雄性生殖的影响。方法将小鼠随机分为对照组(control)和高脂组(HFD),各20只。HFD组高脂饮食20周,每周测血糖及体质量;腹腔注射伊文思蓝观察血睾屏障通透性;激光多普勒检测睾丸微循环血流量及微血管自律运动频率和振幅;HE染色观察睾丸组织形态;免疫组化检测睾丸微血管血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)及生精细胞增殖细胞核抗原PCNA表达;TUNEL染色法观察生精细胞凋亡。结果 HFD组小鼠体质量及血糖均高于对照组(P<0.01);血睾屏障完整性破坏,生精小管通透性增高;睾丸平均血流灌注水平及微血管自律运动频率和振幅均低于对照组(P<0.01);生精上皮细胞数量减少、生精上皮变薄;微血管内皮细胞CD31及生精细胞PCNA表达水平均低于对照组(P<0.01);生精细胞凋亡水平高于对照组(P<0.01)。结论高脂饮食可诱导小鼠血糖水平增高致睾丸微血管损伤破坏血睾屏障完整性使小鼠生精上皮结构受损。     

环磷酰胺对大鼠睾丸和附睾的影响

目的探讨抗肿瘤药物所致大鼠睾丸和附睾损害,为寻找男性不育症中药治疗的研究提供理论依据。方法选用16只15周龄SD大鼠随机分为对照组和实验组,每组8只;实验组腹腔注射环磷酰胺20mg·kg-1·d-1,连续5d,用药2个月后,应用HE染色法研究大鼠睾丸、附睾远期组织学变化,用原位缺口末端标记法(TUNEL方法)检测生精细胞凋亡。结果实验组大鼠体重、睾丸和附睾重量均显著减轻(P<0.01),睾丸生精小管直径缩小、间距增宽、生精上皮变薄、生精细胞层次和数量减少、生精小管腔多未见精子形成,实验组睾丸生精小管直径、面积、生精上皮细胞数、均显著低于对照组(P<0.01);实验组生精细胞凋亡增多,与对照组比较,生精细胞显著凋亡(P<0.01);附睾管管腔内腔内精子稀少,含有大量脱落细胞,管壁变薄。结论环磷酰胺对大鼠睾丸、附睾远期损害明显,促进生精细胞凋亡。     

衰老大鼠睾丸生精细胞增殖凋亡及相关因素的变化

目的:观察衰老大鼠睾丸生精细胞增殖、凋亡及相关因素的变化。方法:D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型。SP免疫组织化学法观察睾丸生精细胞衰老过程中增殖细胞核抗原(PCNA)和端粒酶的表达,TUNEL法观察生精细胞的凋亡,原位杂交、Western印迹分析观察生精细胞p53基因的表达。结果:与正常大鼠相比,衰老大鼠睾丸PCNA阳性细胞率显著下降,端粒酶阳性细胞数明显减少,凋亡管数和凋亡阳性细胞率显著升高,p53 mRNA阳性细胞率和p53蛋白含量均有所升高。结论:衰老大鼠睾丸生精细胞增殖能力下降、凋亡增多,睾丸机能减退。     

淫羊藿苷调节雄性大鼠生殖功能

目的:探讨淫羊藿苷在环磷酰胺诱导的大鼠睾丸生精障碍动物模型中的作用,研究淫羊霍苷对睾丸功能的影响.方法:分为空白对照组、阴性对照组、模型组、淫羊藿苷治疗组;H-E染色观察睾丸组织结构变化,TUNEL方法检测睾丸生殖细胞凋亡,放射免疫法检测血清睾酮.结果:睾丸H-E染色切片观察显示模型组睾丸生精小管直径缩小,间距增宽,生精上皮变薄,生殖细胞数量减少,生精小管多未见精子形成,与空白对照组比较其生精小管结构变化显著;淫羊藿苷治疗组与模型组比较生精小管壁增厚,含有精子的生精小管明显增多.睾丸生精小管中生殖细胞凋亡的观察模型组与空白对照组比较其生殖细胞凋亡增多,变化显著;淫羊藿苷治疗组与模型组比较生精小管中生殖细胞凋亡数量明显减少.模型组与空白对照组比较血清睾酮明显降低;淫羊藿苷治疗组与模型组比较其血清睾酮明显增加.结论:淫羊藿苷对环磷酰胺诱导生精障碍的睾丸具有改善睾丸生精小管结构、减少生殖细胞凋亡、促进精子发生和间质细胞分泌睾酮的功能.     

锰诱导大鼠生精细胞凋亡过程中半胱氨酸酶-3mRNA与增殖细胞核抗原表达变化

目的:研究氯化锰对生精细胞凋亡过程半胱氨酸酶3(caspase-3)mRNA和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响,探讨两者在生精细胞凋亡过程中的作用。方法:雄性SD大鼠随机分为空白对照组、低剂量(15 mg/kg MnCl_2)和高剂量(30mg/kg MnCl_2)组。MnCl_2组分别染锰4周和6周,空白对照组给予等容生理盐水,给药途径均为腹腔注射,TUNEL法检测睾丸生精细胞凋亡,原位杂交和免疫组织化学(SABC)检测生精细胞caspase-3 mRNA和PCNA和表达。结果:与空白对照组比较,各染锰组生精细胞凋亡指数(AI)均升高,caspase-3 mRNA阳性细胞率均显著升高,染锰4周:PCNA阳性细胞率显著降低,染锰6周反而升高。染锰剂量相同,6周与4周组比较,生精细胞AI与caspase-3 mRNA阳性细胞率、PCNA阳性细胞率均显著升高。染锰时间相同,高剂量组与低剂量组比较,生精细胞AI与caspase-3 mRNA阳性细胞率均显著升高,PCNA阳性细胞率显著降低。各组大鼠生精细胞AI与caspase-3 mRNA阳性细胞率呈正相关,与PCNA阳性细胞率呈负相关,而caspase-3 mRNA阳性细胞率与PCNA阳性细胞率呈负相关。结论:锰可诱导大鼠生精细胞caspase-3mRNA表达,促使生精细胞凋亡并且抑制细胞增殖,产生生殖毒性效应。     

葛根素减轻乙醇导致大鼠生精细胞的凋亡

目的 观察乙醇导致大鼠生精细胞的凋亡及葛根素的干预。方法 将大鼠30 只,随机均分为对照组、乙醇组及葛根素干预组。于实验第40天免疫组织化学法（SABC）检测左侧睾丸各组Bcl-2、Bax 蛋白在生精细胞的表达; RT-PCR检测右侧睾丸各组Bcl-2及Bax mRNA的表达;TUNEL 法检测生精细胞的凋亡。结果 醇组平均每个生精小管断面中Bcl-2 蛋白阳性细胞数和A值低于对照组(P<0.01),而平均每个生精小管断面中Bax 蛋白的阳性细胞数和A值高于对照组(P<0.01);乙醇组Bax mRNA表达较葛根素干预组及对照组强（P<0.05）,而Bcl-2 mRNA表达较葛根素干预组及对照组弱（P<0.05）;乙醇组每个生精小管横切面中的凋亡细胞数目高于对照组(P< 0.01),葛根素干预组显著缓解上述变化。结论 根素对乙醇导致的大鼠生精细胞凋亡有干预作用。     

大鼠视网膜发育过程中细胞增殖与凋亡的形态学

目的:观察视网膜发育过程中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达变化及细胞凋亡状态。方法:14~20 d胎鼠(E14-20 d)、生后0~15 d幼鼠(P0-15)及成年鼠(P36),取出眼球组织,免疫组织化学显色及原位末端标记(TUNEL)观察PCNA的表达和细胞凋亡变化。结果:发育早期E14~P7,可观察到有较强PCNA阳性表达,P9时PCNA阳性细胞数目明显减少,P15开始未见明显PCNA阳性表达。E18可观察到凋亡细胞,随着发育的进行,凋亡细胞逐渐增多,P7时凋亡细胞数目最多,之后又逐渐减少,成熟的视网膜组织内未见明显凋亡细胞。结论:在视网膜神经细胞发育过程中,细胞的增殖和凋亡呈现了有序的动态变化,正是这种有序的增殖和凋亡的平衡才使视网膜最终发育成了正常的组织结构及功能。     

模拟高原缺氧环境对大鼠生殖细胞凋亡的影响

目的观察模拟高原缺氧环境条件对雄性SD大鼠生殖细胞形态及凋亡的影响。方法随机将20只SD雄性大鼠分为两组,对照组置650m海拔高度饲养,低氧组置模拟6000m海拔高度低压氧舱饲养。饲养14天后脱颈处死大鼠,采集睾丸组织标本,HE染色观察睾丸组织形态学变化。采用TUNEL法检测高原缺氧大鼠生殖细胞凋亡的影响。结果与对照组比较,可见高原缺氧组大鼠睾丸组织生精小管间隙增宽,部分生精小管中初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞减少,间质血管充血、扩张,部分生精小管内精细胞数量明显减少,初级、次级精母细胞变性、脱落、坏死。高原缺氧组睾丸内发生生殖细胞凋亡的生精小管数量[每100个生精小管中含有1、2、3及3个以上凋亡细胞的小管数分别为(6.80±1.40)、(3,20±0.38)、(2.80±0.60)个]均显著的高于常氧对照组[每100个生精小管中含有1、2、3及3个以上凋亡细胞的小管数分别为(3.70±0.69)、(1.40±0.56)、(0.60±0.48)个,P0.05]。结论高原低氧环境可能是通过诱发生殖细胞凋亡途径,导致大鼠睾丸生殖机能损伤。     

新生小鼠睾丸组织移植到裸鼠体内不同时期移植物的组织学观察

目的 通过测量不同发育时期移植物的重量及观察其中生精小管结构和生精细胞组成情况,对去势雄性小鼠中移植的新生小鼠睾丸组织生长和发育进行系统观察.方法 将出生1～2d昆明小鼠睾丸移植到7～12周去势雄性免疫缺陷小鼠背部;在移植后不同时间段 (分为3d、1～11周和3～6月16个组)取出移植物,计算移植物的回收率,测定移植物重量,观察移植物中生精小管结构及生精细胞的组成.结果 从移植的450个新生小鼠睾丸组织,回收到405个移植物,总回收率为90.0%.重量比移植前增加约40倍.移植物中生精小管的发育及各阶段生精细胞出现时间与在正常小鼠中所见基本相同.移植时间超过8周后,生精上皮的退化现象显著增加.结论 将新生小鼠睾丸组织异位移植到受体背部后的发育进程与在体情况相同,第1次生精波结束后的时间应为获取精子细胞和精子的最佳时间,大约是移植后5～7周.     

Immunohistochemical analysis of the vimentin filaments in Sertoli cells is a powerful tool for the prediction of spermatogenic dysfunction

The close interaction between male germ cells and Sertoli cells, a type of somatic cell found in the seminiferous tubules of mammalian testis, is essential for the normal progression of spermatogenesis in mammals. Vimentin is an intermediate filament protein that primarily provides mechanical support, preserves cell shape, and maintains the nuclear position, and it is often used as a marker to identify Sertoli cells. Vimentin is known to be involved in many diseases and aging processes; however, how vimentin is related to spermatogenic dysfunction and the associated functional changes is still unclear. In a previous study, we reported that vitamin E deficiency affected the testes, epididymis, and spermatozoa of mice, accelerating the progression of senescence. In this study, we focused on the Sertoli cell marker vimentin and explored the relationship between the cytoskeletal system of Sertoli cells and spermatogenic dysfunction using testis tissue sections that caused male reproductive dysfunction with vitamin E deficiency. The immunohistochemical analysis showed that the proportion of the vimentin-positive area in seminiferous tubule cross-sections was significantly increased in testis tissue sections of the vitamin E-deficient group compared with the proportion in the control group. The histological analysis of testis tissue sections from the vitamin E-deficient group showed that vimentin-positive Sertoli cells were greatly extended from the basement membrane, along with an increased abundance of vimentin. These findings suggest that vimentin may be a potential indicator for detecting spermatogenic dysfunction.     

己烯雌酚对幼年香猪睾丸与附睾雌激素受体和一氧化氮合酶表达和分布的影响

目的 探讨己烯雌酚（DES）对幼年香猪睾丸和附睾中雌激素受体（ERs）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响,及DES对诱导雄性动物生精异常的作用机制。 方法 将20只20～25日龄幼年雄性香猪分成４组,对照组只注射生理盐水,实验组经腹腔每天注射DES(实验1组：0.03mg/kg;实验2组：0.3mg/kg;实验3组：3mg/kg),连续注射9d。最后１次注射24h后手术取出左侧睾丸和附睾组织经中性多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规制备5μm石蜡切片,采用免疫组织化学SP法检测睾丸和附睾组织中ERα、ERβ和eNOS的表达。 结果 ERα只在输出小管上皮细胞胞核中表达;ERβ在输出小管上皮细胞、间质细胞及附睾管上皮细胞胞核中均有表达,在睾丸生精小管细胞胞质中也有少量表达。DES能够使ERα在输出小管中的表达率显著下降（P<0.05）。随着DES用量的增多,ERβ在输出小管和附睾管中的表达率显著升高（P<0.05）,当DES用量为3mg/kg时ERβ在输出小管和附睾管中的表达率明显高于用量0.03mg/kg和0.3mg/kg（P<0.05）。但0.03mg/kg用量的DES却使睾丸生精小管中ERβ的表达率显著性下降（P<0.05）,并在0.3mg/kg和3mg/kg用量时在睾丸生精小管中未能检测到ERβ受体的表达。eNOS在睾丸生精小管细胞和输出小管上皮细胞中都有表达,DES能促进eNOS在睾丸生精小管细胞中表达（P<0.05）而降低其在输出小管细胞中表达（P<0.05）。结论 DES明显影响ERs和eNOS在睾丸和附睾中的表达。     

Proliferation and apoptosis of spermatogonia in postpuberal boar (Sus domesticus) testes with spontaneous unilateral and bilateral abdominal cryptorchidism

Cryptorchidism is a frequent male sexual disorder in mammals, which affects the histology of the tunica propria, interstitial tissue, blood vessels, seminiferous epithelium and testis functioning. In this paper, proliferation and apoptosis were examined in the seminiferous epithelium of both testes from unaffected boars and from boars suffering unilateral and bilateral cryptorchidism. In germ cells, proliferation was studied using the immunohistochemical PCNA technique, and apoptosis was analysed by in situ TUNEL labelling. An index was obtained for the proliferation and apoptosis observed in seminiferous tubules. In abdominal testes the epithelium contained few spermatogonia and Sertoli cells. In the testes of unaffected boars, numerous spermatogonia proliferated, whereas in cryptorchid testes such proliferation was lower and the proliferation/apoptosis ratio diminished. In the unaffected group, the TUNEL-positive germ cells were spermatogonia and spermatocytes in different phases of meiosis. In abdominal testes, the TUNEL-positive germ cells were spermatogonia alone. The apoptosis index of both abdominal and scrotal testes was similar. In conclusion, spontaneous cryptorchid testes showed a lower rate of spermatogonia proliferation in the seminiferous epithelium.     

亚硝酸盐暴露致雄性小鼠生殖毒性的探讨

目的 探讨亚硝酸盐暴露对雄性小鼠生殖毒性的分子机制。 方法 36只2月龄健康雄性小鼠,随机分为对照组(生理盐水）、低剂量组（60 mg/kg）和高剂量组（120 mg/kg）,每组12只进行亚硝酸盐灌胃3个月,观察小鼠的生长状况,HE染色法观察睾丸组织病理变化,免疫荧光和Western blotting方法分析检测睾丸组织细胞增殖与凋亡情况及DNA甲基化、组蛋白去乙酰化相关酶的表达情况。 结果 亚硝酸盐暴露组小鼠较对照组小鼠体重增加缓慢,睾丸指数降低（P<0.01）,形态发生病理性改变;亚硝酸盐暴露组小鼠睾丸组织细胞增殖较对照组明显减少,细胞凋亡较对照组明显增加（P<0.01）;同时DNA甲基化和组蛋白去乙酰化水平高于对照组（P<0.01）,且均具有剂量依赖性。 结论 亚硝酸盐暴露通过抑制雄性小鼠生长发育及睾丸生精细胞增殖,诱导睾丸生精细胞凋亡,造成雄性生殖毒性;DNA甲基化及组蛋白去乙酰化水平升高,提示表观遗传学可能参与了亚硝酸盐暴露对雄性生殖系统的损伤过程及调控机制。     

db/db自发性糖尿病小鼠睾丸生殖细胞增殖及凋亡研究

目的　研究糖尿病对生殖细胞增殖和凋亡的影响。　方法　以免疫组织化学ABC法检测增殖细胞核抗原 (proliferationcellnucleusantigen ,PCNA)检测生殖细胞的增殖情况 ,电镜和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法 (TUNEL)检测凋亡的生殖细胞。　结果　PCNA阳性率随糖尿病病程进展 (糖尿病组 )和年龄增加 (对照组 )均呈明显下降趋势 ,但每年龄段糖尿病组PCNA阳性率均明显低于相应正常对照组。凋亡管横断面数及凋亡阳性率糖尿病组均较正常高 ,而且随糖尿病病程进展呈明显增加趋势 ,对照组中随加龄二者有增加。电镜下 ,糖尿病组小鼠睾丸精原细胞、精母细胞和精子细胞均可见到核染色质凝集、边集 ,凋亡小体形成和降解等凋亡过程。　结论　db/db自发性糖尿病小鼠睾丸生殖细胞PCNA表达减弱 ,TUNEL标记凋亡细胞增加 ,说明糖尿病使生殖细胞增殖与凋亡的平衡破坏 ,这可能是糖尿病生殖功能障碍的原因