核因子-κB途径介导脑源性神经营养因子促进多发性骨髓瘤细胞分泌基质金属蛋白酶-9

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)通过核转录因子(NF)-κB诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞基质金属蛋白酶(MMP)-9分泌的具体机制.方法 培养人MM细胞株RPMI 8226,使用明胶酶谱法检测.RPMI 8226细胞分泌的活性MMP-2、MMP-9水平的变化,用化学发光凝胶电泳迁移率分析(EMSA)法检测RPMI 8226细胞中NF-κB的活性.结果 以25、50、100和200μg/L浓度的BDNF刺激RPMI 8226细胞24 h后,其活性MMP-9的分泌水平分别为2.03±0.48、2.99±0.46、4.63±0.62和5.62±1.29μg/L,均明显高于对照组(P＜0.01),而MMP-2的表达在各浓度组之间的差异无统计学意义(P＞0.05).当BDNF作用浓度为100μg/L时,预先分别用1 mmol/L的NF-κB抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸脂(PDTC)和500 nmol/L的BDNF高亲和力受体TrkB的酪氨酸抑制剂K252a处理15 min和1 h后,K252α和PDTC(P＜0.001)均能显著抑制RPMI 8226细胞MMP-9的分泌(光密度值分别为867.52±101.81、727.98±92.05,对照组为1159.01±233.15,与对照组比,P值均＜0.01).随着BDNF浓度的升高,NF-κB的活化作用明显增强,于100μg/L BDNF加K252α预处理1 h后,6、12、24 h的3个时间点K252α均能明显抑制BDNF对NF-κB的激活作用(P＜0.05),且随BDNF作用时间的延长而增强.结论 BDNF促进MM细胞血管新生的能力可能是通过NF-κB信号转导途径激活MMP-9而实现的.     

脑源性神经营养因子激活其受体TrkB在多发性骨髓瘤发病机制中的作用

目的 研究异常表达的脑源性神经营养因子(BDNF)在多发性骨髓瘤(MM)发生、发展中的作用及其信号通路.方法 采用锥虫蓝拒染法检测BDNF对人MM细胞系RPMI8226、U266和KM3细胞存活的促进作用,MTT比色法观察BDNF对苯丙氨酸氮芥和长春新碱细胞毒作用的影响,Western blot检测BDNF对MM细胞TrkB磷酸化的影响.通过动物模型观察BDNF对肿瘤生长和实验动物存活时间的影响.结果 BDNF以浓度依赖性方式促进MM细胞的存活,50μg/L BDNF作用后存活细胞数较对照组明显增加.BDNF可明显降低苯丙氨酸氮芥和长春新碱的细胞毒性,50μg/LBDNF作用后,苯丙氨酸氮芥和长春新碱的EC50值分别为无BDNF作用时的2倍和3倍.体内实验表明BDNF可明显促进异种移植的MM裸鼠模型中肿瘤的生长,经BDNF处理和未经BDNF处理组肿块的平均体积分别为3240.9 mm3和1032.7 mm3(P＜0.05),生存时间分别为13 d和21 d(P＜0.05).MM细胞中异常表达的TrkB是BDNF的功能性受体,外源性BDNF作用后,MM细胞TrkB磷酸化水平明显增加,并且Trk抑制剂K252a可明显抑制BDNF诱导的MM细胞迁移.结论 外源性BDNF可磷酸化激活MM细胞表面TrkB受体,促进骨髓瘤细胞的增殖、存活、迁移并参与骨髓瘤细胞的化疗耐药,在MM的病理生理进程中起重要作用.     

多发性骨髓瘤细胞对共培养内皮细胞分化的影响及其机制的初步研究

目的 研究人多发性骨髓瘤（MM）细胞对内皮细胞分化为管状结构的影响及调控脑源性神经营养因子（BDNF）分泌的初步机制。方法 采用人MM细胞系RPM18226细胞或原代MM细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）混合共培养和隔离共培养；以同期单独培养的HUVEC为对照，对与MM细胞共培养的HUVEC进行Matrigel基质管状结构形成实验，评价MM细胞对HUVEC血管新生能力的影响；采用ELISA方法检测两种共培养体系培养上清中BDNF的含量；用抗人CD29和CD18的单克隆抗体（单抗）对MM细胞进行预处理后，在混合共培养的基础上进行管状结构形成实验并检测培养上清中BDNF的含量。结果 与同期单独培养的HUVEC相比，与RPM18226细胞隔离共培养的HUVEC形成的管状结构数量明显增多，但增加幅度（约75％）低于混合共培养体系（约113％）。原代MM细胞促HUVEC管状结构形成效应在隔离共培养体系和混合共培养体系分别为138％与188％。HUVEC单独培养上清中BDNF的含量为（12．4±5．1）ng／ml，RPM18226细胞混合共培养上清和隔离共培养上清的BDNF含量分别为（38．5±8．2）ng／ml和（31．6±7．2）ng／ml；原代MM细胞混合共培养上清和隔离共培养上清的BDNF含量分别为（37．1±8．7）ng／ml和（27．9±7．6）ng／ml。两种黏附分子抗体能不同程度地阻断混合共培养体系中MM细胞促HUVEC管状结构形成效应，并抑制BDNF的分泌。结论 MM细胞可刺激共培养HUVEC分化为管状结构；并受到MM细胞与HUVEC间可溶性细胞因子和黏附作用的共同调控，其调控机制与BDNF相关。     

脑源性神经营养因子单克隆抗体在NOD/SCID小鼠骨髓瘤模型体内的抗瘤活性

目的以多发性骨髓瘤（MM）细胞株RPMI8226异体移植小鼠为动物模型，评估抗脑源性神经营养因子（BDNF）单克隆抗体（单抗）在体内的抗肿瘤活性。方法选择糖尿病抵抗／重症联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠，皮下注射RPMI8226细胞建立骨髓瘤细胞异体移植动物模型。以20μg／只的BDNF单抗剂量于接种肿瘤细胞后第1、2、3天腹腔内注射或者以100μg／只的剂量于检测到瘤体后每周1次腹腔内注射。采用组织学方法检测瘤细胞的形态特征，免疫化学染色法分析瘤组织的微血管密度（MVD）。用^3H—TdR掺入法和Matrigel网状结构形成实验分别检测BDNF单抗对RPMI8226细胞体外增殖和PRMI8226细胞诱导的内皮细胞血管新生的影响。结果在NOD／SCID小鼠体内建立的骨髓瘤细胞异体移植动物模型，其皮下种植的成瘤率高，具有多种与浆细胞瘤相似的病理学特征。未治疗组小鼠皮下注射RPMI8226细胞后（20±2）d可检测到皮下肿瘤；接种肿瘤细胞后连续3d注射20μgBDNF单抗的治疗组，小鼠平均无肿瘤生存期延长为（30±6）d，而相应对照抗体治疗组无肿瘤生存期为（22±3）d，与未治疗组相比差异无统计学意义；同时，其中位存活时间为（57±7）d，与相应的对照抗体治疗组[（48±4）d]相比明显延长（P〈0．05）；治疗组小鼠自然死亡时肿瘤体积为（157．94-21．6）mm^3，较对照抗体组[（405．5±35．2）mm^3]明显缩小（P〈0．05）。对于接种肿瘤细胞后第27天起每周注射1次BDNF单抗（100μg／次）的治疗组，肿瘤的生长亦受到部分抑制，相应对照抗体组与未治疗组相比肿瘤生长差异无统计学意义；同时在BDNF单抗治疗组瘤体的组织切片中，观察到部分瘤细胞出现凋亡的形态学表现，坏死区被纤维结缔组织浸润。未治疗组瘤块的MVD为38个／0．216mm^2，BDNF单抗治疗组（100μg／次）MVD为11个／0．216mm^2，与未治疗组相比对照抗体治疗组瘤块的MVD没有明显下降（35个／0．216mm^2）（P〉0．05）。在体外，BDNF单抗可显著抑制RPMI8226细胞的增殖和其诱导的内皮细胞网状结构形成（抑制率为68．2％），而相应的对照抗体却无此效应。结论BDNF单抗可抑制皮下浆细胞瘤的生长和血管新生，BDNF是治疗MM的潜在靶点。     

多发性骨髓瘤细胞激活内皮细胞脑源性神经营养因子自分泌环

目的在体外共培养体系中研究人多发性骨髓瘤（MM）细胞对正常内皮细胞的作用。方法建立人MM细胞株RPMI8226与正常人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的体外共培养体系；以同期单独培养的HUVEC为对照，对与RPMI8226细胞共培养的HUVEC进行脑源性神经营养因子（BDNF）及其特异性受体TrkB基因的半定量RT—PCR分析和蛋白的Western blot分析，采用ELISA方法检测共培养体系培养上清中BDNF的含量；在转换共培养实验的基础上应用Transwell小室迁移实验、网状结构形成实验评价与RPMI8226细胞共培养激活的HUVEC对正常HUVEC血管新生能力的影响。结果与同期单独培养的HUVEC相比，经共培养后的HUVEC不仅上清中BDNF的含量增加[分别为（12．4±5．1）ng／ml和（31．6±7．2）ng／ml，P〈0．05]，RT-PCR结果显示HUVEC常规表达BDNF，与RPMI8226细胞共培养后HUVEC BDNF表达量约为前者的1．7倍（P〈0．05）；单独培养的HUVEC几乎不表达TrkB，共培养的RPMI8226细胞明显上调HUVEC TrkB的表达（为前者的4．4倍，P〈0．05），Western blot结果与上述结果相符；经RPMI8226细胞活化的内皮细胞可明显促进HUVEC迁移和网状结构形成，与未活化的内皮细胞相比迁移指数和网状结构数量分别增加了99％和72％，抗BDNF抗体可部分抑制其活性。结论MM细胞通过可溶性的细胞因子介导，激活内皮细胞的BDNF／TrkB自分泌环，继而实现内皮细胞的自促进血管新生效应。     

多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子对血管新生作用的研究

目的研究多发性骨髓瘤(MM)细胞脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平及其与MM细胞诱导的血管新生的关系。方法采用RT-PCR法、Western blot法及ELISA法检测MM细胞系KM3、RPMI8226细胞BDNF的表达及分泌。采用MTT法观察MM细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用;用改良的Boyden小室法观察MM细胞培养上清液对HUVEC迁移的影响;采用体外小管形成实验,观察MM细胞培养上清液对HUVEC分化的影响。结果KM3、RPMI8226细胞不仅表达BDNF mRNA,也表达和分泌BDNF蛋白,BDNF的基础分泌水平在其生物学作用范围内。KM3、RPMI8226细胞培养上清液均可明显促进HUVEC增殖,含50.0%KM3细胞培养上清液组和完全KM3细胞培养上清液组HUVEC数分别为对照组的(1.85±0.23)倍和(2.16±0.29)倍(P<0.05),抗人类BDNF中和抗体可部分抑制其促增殖活性;含50.0%KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为1.85±0.23,完全KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为2.16±0.29,与对照组比较,差异有统计学意义(P值均<0.05),并可明显促进基质胶中网状毛细血管形成(P<0.01),抗BDNF中和抗体可明显抑制其作用。结论MM细胞表达和分泌BDNF,BDNF可能参与MM细胞诱导的血管新生。     

表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立

过去的研究证实脑源性神经营养因子(BDNF)在体外具有促进多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖并诱导MM血管新生的能力。本研究探讨BDNF/TrkB途径是否为治疗MM的潜在靶点,并比较两种途径建立人MMNOD/SCID小鼠模型的优缺点,为深入探索治疗MM的新靶点奠定基础。选择糖尿病抵抗/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,通过皮下注射或尾静脉注射人骨髓瘤细胞株RPMI8226建立两种异体移植动物模型。观察荷瘤后小鼠的生长状态,测量皮下瘤块的体积;荷瘤后3周,每周经眼眶后静脉丛采血,检测血清中人源λ轻链含量、Ca2 浓度和血浆中人源BDNF浓度,并计数红细胞;小鼠死后,采用组织学方法观察瘤细胞的形态特征,流式细胞术检测小鼠外周血和骨髓中人源性CD38 细胞比例,采用计算机X线数字摄影观察小鼠全身骨密度的改变和骨质破坏情况。结果表明:皮下注射模型的成瘤率高(5/5),具有多种与浆细胞瘤相似的病理学特征,但其骨髓中未检测到MM细胞,血清中钙离子浓度不高,M蛋白浓度升高不明显且未发现溶骨性损害的组织学和影像学证据。尾静脉注射模型成瘤率相对较低(4/7),骨髓中可检测到呈浸润生长的人CD38 细胞;而且在荷瘤3周后,血清中即可检测到人源M蛋白;随着肿瘤的生长,M蛋白水平、钙离子浓度逐渐升高,并有溶骨性损害的影像学证据。两种模型血浆中人源BDNF的水平亦逐渐升高,9周时浓度分别为(73±11)pg/ml和(105±18)pg/ml。结论:本研究成功建立了两种高表达BDNF的MM荷瘤NOD/SCID小鼠模型,两种模型相互结合应用,为探索MM治疗的新靶点BDNF/TrkB提供了合适的动物模型。     

抗脑源性神经营养因子单克隆抗体在骨髓瘤异体移植动物模型中的抗肿瘤效应

为探索BDNF／TrkB途径是否可能成为治疗MM的潜在靶点、抗脑源性神经营养因子（BDNF）单克隆抗体能否阻碍疾病的发展，用骨髓瘤异体移植的动物模型评估在体内BDNF单克隆抗体的抗肿瘤活性。选择糖尿病抵抗／重症联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠，皮下注射人骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞建立异体移植动物模型。抗体以20μg/只的剂量于接种肿瘤细胞后第1、2、3天腹腔内注射或者以100μg／只的剂量于检测到瘤体后每周1次腹腔内注射。采用组织学方法检测瘤细胞的形态特征，以免疫组织化学染色法分析瘤组织的微血管密度，应用^3H—TdR掺入法和Matrigel网状结构形成实验分别检测BDNF单克隆抗体对RPMI8226细胞体外增殖和PRMI8226细胞诱导的内皮细胞血管新生的影响。结果表明：在建立的骨髓瘤细胞异体移植动物模型内，多次注射BDNF单克隆抗体可缩小肿瘤体积，降低瘤组织微血管密度，延长无病生存期和生存时间，而且BDNF单克隆抗体可显著抑制体外RPMI8226细胞的增殖和诱导内皮细胞血管新生，而相应的对照抗体却无此效应。结论：BDNF单克隆抗体可抑制动物模型中皮下浆细胞瘤的生长和血管新生：     

CD40不同形式的活化对CD40突变的RPMI8226细胞增殖和表型的影响

目的 分析CD40抗体或配体不同形式刺激对RPMI8226细胞增殖及表面共刺激分子和黏附分子表达的影响,探讨RPMI8226细胞CD40基因突变在其生物学行为中的作用.方法 用RT-PCR方法和DNA序列测定检测RPMI8226细胞CD40基因突变体,分析RPMI8226细胞经CD40抗体或配体四种不同方式(CD40单抗、CD40单抗包板、rhsCD40L和CD40L转基因细胞)刺激后,其体外生长曲线、细胞表型及细胞周期的变化,并利用激光共聚焦显微镜对RPMI8226细胞表面CD40信号转导体的形成进行初步分析.结果 RPMI8226细胞表达CD40突变体(TCA→TTA,Ser→Leu),但是该点突变并未影响hmuCD40的抗原表位.三种激发CD40活化的分子(CD40单抗、rhsCD40L和CD40L转基因细胞)并不影响RPMI8226细胞的体外增殖,但是CD40单抗包板能明显抑制RPMI8226细胞的增殖[(2.5±0.6)×105 vs (7.8±1.2)×105,P＜0.05],并产生明显的G1期阻滞[(58.0±3.6)% vs (42.0±2.3)%,P＜0.05].RPMI8226细胞上黏附分子和共刺激分子的表达无明显变化.激光共聚焦显微镜分析结果显示,在CD40被激活后能形成CD40信号传导的复合体.结论 RPMI8226细胞高表达一种CD40基因突变体,该突变体能在被激活后形成相应的信号传导复合体.     

蛋白酶体抑制剂诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡及对Notch 1和NF-κB表达的影响

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的发生、发展与骨髓微环境关系密切，有多种信号通路参与。Notch信号是造血微环境调节造血细胞增殖分化的重要信号通路，其中Notch1与血液肿瘤的发生、发展较为密切。骨髓瘤是高度依赖NF-κB的恶性肿瘤，后者与肿瘤细胞的发生和转移、增殖和凋亡、耐药相关。已证实NF—KB2家族是Notch信号通路的一个靶基因。蛋白酶体抑制剂Bortezomib已获美国FDA批准用于治疗难治及复发多发性骨髓瘤，但其诱导骨髓瘤细胞凋亡的机制尚未完全明确。本研究探讨bortezomib诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡和对Notch1、NF-κB表达水平的影响，采用透射电子显微镜检、流式细胞术及原位缺口末端标记技术观察药物对MM细胞凋亡的影响．用RT—PCR法和免疫荧光细胞化学染色分析分别检测细胞凋亡时Notch1及NF—κB的表达情况。结果表明：RPM18226细胞高表达Notch1和NF—κB；随着bortezomib作用浓度的增高，RPM18226细胞出现典型的凋亡改变，Notch1的表达逐渐降低，NF-κB在胞核表达减少，胞浆表达增多。这种改变在浓度升高到一定数值时与对照相比具有显著性差异（P〈0．05）。结论：bortezomib治疗多发性骨髓瘤机制中有Notch1和NF—κB两条通路的参与．二者可能存在一定的联系，提示Notch1信号可能作为MM治疗的潜在靶点，为相关新药的研发提供一定实验基础。     

Inhibition of hypoxia-inducible factor-1alpha in RPMI8226 myeloma cells results in reduced tumor growth in nude mice

OBJECTIVE: To explore the influence of inhibition of hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) by RNA interference (RNAi) on tumorigenesis of human myeloma cell line (HMCL) RPMI8226 cells in nude mice. METHOD: RNAi vector of HIF-1alpha was constructed with commercial shRNA expression vector pSilencer 2. 1-U6 hygro. RT-PCR and western blot were used to detect HIF-1alpha mRNA and protein expression respectively. Vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion and cell cycle changes were detected by ELISA and flow cytometry respectively. Expression of target gene of HIF-1alpha, VEGF and Glut-1 were tested under hypoxia condition. Tumorigenesis was observed after transfected cells were injected subcutaneously in nude mice. RESULTS: After interference, expression of HIF-1alpha decreased significantly at both mRNA and protein level. Under normoxia condition, VEGF concentrations in HIF-la inhibited cells (RPMI8226-il and RPMI8226-i2) and non-inhibited cells (RPMI8226-c and RPMI8226) showed no differences. While under hypoxia condition, VEGF concentration in the above four cells was (506.0 +/- 53.2), (494.7 +/- 63.1), (984.4 +/- 61.9) and (938.2 +/- 62.2) pg/ml, respectively, being significantly lower in RPMI8226-il and RPMI8226-i2 cells than in RPMI8226-c and RPMI8226 cells (P <0.05). HIF-1alpha interference was found to suppress the cells shift from S-phase to G1 induced by hypoxia. VEGF and Glut-1 expressions were markedly attenuated (P <0.05). The growth rate of HIF-1alpha inhibition tumors in subcutaneous xenograft model decreased drastically. CONCLUSIONS: RNAi inhibits HIF-1alpha expression. Reduced tumor growth by HIF-1alpha inhibition may partly through inhibiton of angiogenesis and glycolysis metabolism.     

人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞对共培养内皮细胞的作用

目的 在体外共培养体系中研究人多发性骨髓瘤(MM)细胞对人正常内皮细胞的作用.方法 建立人MM细胞株RPMI8226细胞与正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的体外共培养体系;以同期单独培养的HUVEC为对照,用电子显微镜和光学显微镜对与RPMI8226细胞共培养的HUVEC进行细胞超微结构和细胞形态学观察;用刮痕迁移实验、管状结构形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力;并以Western blot和流式细胞术分别检测脑源性神经营养因子(BDNF)、Endoglin与TrkB、Tie2、β3,整合素、血管细胞黏附分子-1蛋白的表达.结果 与同期单独培养的正常内皮细胞对照相比,共培养后的部分内皮细胞胞体伸展并首尾排列成一行;超微结构出现胞核增大、核仁增大、核质比例增大,内质网疏松、变形,细胞表面纤毛减少;共培养体系中细胞管状结构形成数量和迁移细胞数较单独培养体系分别增加了112%和136%;BDNF、Endoglin、TrkB、Tie2、β3整合素和血管细胞黏附分子-1蛋白的表达亦明显上调.结论 MM细胞与人正常内皮细胞共培养后,内皮细胞有明显的趋瘤特征和较强的血管新生能力,推测MM患者骨髓中骨髓瘤细胞通过对相邻内皮细胞的作用促进血管新生,且新生血管的内皮细胞性质与行为不同于正常内皮细胞.     

脂肪酸合成酶抑制剂抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的 明确脂肪酸合成酶（FAS）在人多发性骨髓瘤（MM）细胞中的高表达；探讨FAS抑制剂抑制MM细胞增殖及诱导其凋亡的机制。方法 通过RT-PCR方法检测FAS在MM细胞系U266、RPMI8226细胞中的表达；以MM细胞系U266细胞为模型，MTT法观察FAS抑制剂浅蓝菌素（cerulenin）对U266细胞增殖抑制率；以流式细胞术检测经cerulenin处理后U266细胞Annexin V的表达及细胞周期变化。结果 MM细胞系U266、RPMI8226细胞均有FAS mRNA的高表达，而健康献血员外周血单个核细胞（PBMNC）中不表达FAS mRNA；cerulenin对U266细胞增殖有显著的抑制作用，并呈剂量-效应相关；20μg／ml的cerulenin作用于U266细胞12h，细胞早期凋亡率为56．9％，24h细胞早期凋亡率为69．3％，而对照组分别为4．3％和1．8％（P＜0．01）；细胞周期DNA分析发现，20μg／mlcerulenin作用于U266细胞12h，S期细胞从对照组的9．7％上升至20．3％，作用24h，S期细胞上升为29．8％。结论 FAS在MM细胞中高表达；FAS抑制剂可抑制U266细胞的增殖；DNA合成阻止在S期，其抑制增殖的作用可能是通过促进U266细胞早期凋亡；FAS可能是一个潜在的抗MM的靶位。     

DAPT对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖和凋亡的影响

本研究旨在探讨DAPT对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226体外增殖的抑制作用及相关机制。用CCK-8法检测RPMI8226细胞的增殖率,用流式细胞术检测凋亡率,用Western blot法检测RPMI8226细胞Notchl、Hes1蛋白表达情况。结果表明,DAPT 0.5-5.0μmol/L作用于RPMI8226细胞24-72 h后,细胞增殖水平明显下降,呈时间和浓度依赖性(r=1.000)。不同浓度的DAPT能诱导RPMI8226细胞发生凋亡,与对照组相比差异有统计学显著性;随着DAPT浓度的增加,Notch1、Hes1蛋白的表达逐渐下调(rNotch=-0.979,rHes1=-0.988)。结论:DAPT能够抑制RPMI8226细胞的增殖,其机制可能与RPMI8226细胞中Notch1、Hes1蛋白的下调有关。     

酪氨酸激酶抑制剂逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞的耐药性

为了探讨酪氨酸激酶抑制剂STI571对RPMI8226细胞黏附、黏附诱导耐药以及靶细胞Rac1mRNA表达的影响,本研究采用结晶紫染色法分析了RPMI8226细胞与纤连蛋白(fibronectin,FN)的黏附率,用MTT法检测瘤细胞的增殖性,并用半定量RT-PCR研究Rac1mRNA水平的变化。结果显示:RPMI8226细胞与FN黏附1、6、12小时,其黏附率分别为(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%;用20μmol/LSTI571处理1、6、12小时后黏附率分别降为(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%;组间差异显著(P<0.05);阿霉素作用后,FN黏附组细胞IC50值[(1.46±0.04)μmol/L]显著高于BSA组[(0.78±0.03)μmol/L](P<0.05);FN联合STI571组IC50值[(0.81±0.05)μmol/L]与BSA联合STI571组[(0.74±0.02)μmol/L]相比无显著性差异(P>0.05),但却低于FN组(P<0.05);半定量RT-PCR显示,Rac1mRNA水平在20μmol/LSTI571处理14小时后明显下降。结论:STI571能降低RPMI8226细胞与FN的黏附率、逆转黏附介导的阿霉素耐药,并且可以下调其Rac1mRNA水平。     

Study on the relationship of beta-catenin level and sensitivity to Bortezomib of myeloma cell lines

OBJECTIVE: To explore the relationship of beta-catenin and sensitivity to Bortezomib of myeloma cell lines. METHODS: Myeloma cell lines RPMI8226, CZ-1 and NCI-H929 were treated with Bortezomib and 2ME2, alone or in combination. Typan blue dye exclusion and modified MTT were used to assess the cell viability with or without treatment. Annexin V-FITC and PI staining was performed to detect apoptosis rate. RT-PCR was used to detect beta-catenin mRNA and western blot to analyze beta-catenin protein. RESULTS: The basic expression level of beta-catenin was different in tested myeloma cell lines: RPMI8226 was the most while NCI-H929 the least and CZ-1 the intermediate. IC50 of RPMI8226, CZ-1 and NCI-H929 were (49.8 +/- 0.6), (24.7 +/- 0.4) and (8.4 +/- 0.2) nmol/L, respectively. After the treatment of Bortezomib (at 0, 1, 5, 10 nmol/L), beta-catenin level of tested cell lines accumulated in a time and dose dependant manner for western blot, while no significant change was observed in the result of RT-PCR. The beta-catenin protein levels in the Bortezomib (5 nmol/L) and 2ME2 (1 micromol/L) treated cell group were much lower than that in Bortezomib (5 nmol/L) group, the decrease of the gray scale of beta-catenin/beta-actin was 64.03% for RPMI8226, 52.56% for CZ-1, 51.48% for NCI-H929, and the apoptosis rates were 8.00, 1.86 and 1.19 times increase compared to untreated group. CONCLUSION: Myeloma cell lines with higher beta-catenin level are less sensitive to Bortezomib, and combination treatment of low dose 2ME2 and Bortezomib can reduce beta-catenin accumulation and enhance the sensitivity to Bortezomib.     

氟达拉滨诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及其基因表达分析

目的 探讨氟达拉滨诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡及其分子机制.方法 用MTT法检测氟达拉滨对MM细胞的生长抑制作用;用流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法分析凋亡蛋白表达;采用细胞凋亡基因芯片技术检测并分析对照组与氟达拉滨处理组间的基因表达差异.结果 氟达拉滨显著抑制RPMI8226和KM3细胞生长,呈时间和剂量依赖性.24 h半数生长抑制值(IC50)分别为2.13μg/ml和0.36 μg/ml.流式细胞术分析显示,氟达拉滨作用24 h后MM细胞凋亡呈剂量依赖性,同时伴有caspase-3和PRAP激活,具有典型的细胞凋亡生物学特征.在97个凋亡相关基因中,筛选出25个差异表达基因.氟达拉滨处理组与对照组比较,表达上调的基因有13个,主要涉及Bcl-2家族促凋亡基因、肿瘤坏死因子及其受体超家族基因,以及胱天蛋白酶募集结构域家族.表达下调的基因有12个,主要涉及Bcl-2家族抗凋亡基因、肿瘤坏死因子超家族及其受体相关因子基因,以及凋亡抑制蛋白家族.结论 氟达拉滨显著抑制MM细胞生长,诱导细胞凋亡;其作用机制涉及多个凋亡相关基因表达改变.     

异硫氰酸苯己酯诱导骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

为了评价异硫氰酸苯己酯（phenylhexly isothiocyanate,PHI）体外对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖和分化的影响,用不同浓度的PHI与RPMI8226细胞共同孵育,用原位末端标记法（TUNEL）检测PHI处理后细胞凋亡,流式细胞术分析PHI处理后的细胞周期变化;以JC-1为探针,检测PHI处理后瘤细胞线粒体膜电位的变化,用定量夹心ELISA方法检测PHI处理后瘤细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）的变化。研究结果显示,PHI在低浓度（0.5μmol/L）时显著抑制瘤细胞增殖,诱导瘤细胞发生凋亡,抑制效应与PHI浓度有关,PHI处理后细胞生长停滞在G0/G1期。用10μmol/LPHI处理瘤细胞48小时后,线粒体去极化和膜电位丢失较对照组增加3-4倍,瘤细胞分泌VEGF显著减少,仅为对照组的35%。结论：PHI在体外能够抑制骨髓瘤细增殖,诱导细胞凋亡;细胞凋亡的发生与线粒体去极化和膜电位丢失有关,PHI抑制瘤细胞VEGF的分泌可能是引起细胞凋亡原因之一,PHI是一种潜在的骨髓瘤的治疗药物。     

三氧化二砷诱导人骨髓瘤细胞RPMI8226发生Caspase非依赖性细胞凋亡的实验研究

本研究探讨三氧化二砷(As2O3)作用于骨髓瘤细胞RPMI8226引起非Caspase依赖性细胞凋亡。用MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测RPMI8226细胞的凋亡率,Western blot方法检测细胞BCL-2及Caspase-3蛋白表达水平。结果表明,As2O3(0.1-20μmol/L)作用于人骨髓瘤细胞RPMI8226 24,48,72 h显示出明显的增殖抑制作用(P<0.05),呈浓度和时间依赖性。与As2O3(10μmol/L)单独处理组相比,zVAD-fmk(20μmol/L)与As2O3联合处理组的凋亡率未见明显变化。与As2O3(10μmol/L)单独处理组比较,zVAD-fmk与As2O3联合处理组Caspase-3、BCL-2蛋白表达明显升高。结论:As2O3对RPMI8226细胞的增殖有明显的抑制作用。As2O3可诱导RPMI8226细胞发生凋亡,其凋亡过程中可能存在Caspase非依赖性细胞凋亡程序。