人Shh基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Shh基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞,建立稳定转染人Shh基因的293T的细胞系。方法设计引物引入AgeI酶切位点,使用PCR方法从质粒中扩增Shh基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。将AgeI内切酶消化后目的片段交换连接人pGC-FU载体,构建Shh慢病毒表达载体pGC-FU-Shh。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-Fu-Shh与携带GFP的慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,荧光显微镜检测慢病毒载体转染细胞的结果,重组质粒pGC-Fu-Shh的测序,Westernblotting验证Shh在转染293T细胞中表达。结果转染293T细胞后荧光显微镜,24h后观察到绿色荧光蛋白的表达,基本判断Shh表达,说明转染成功。重组质粒pGC-FU-Shh的测序Shh基因片段大小1386bp。通过Westernblotting检测转染293T的样品,可以观察到72～95KDa处条特征带与Sbh融合蛋白相吻合,判断Shh表达。通过PCR扩增获得了Shh基因,将Shh克隆到慢病毒转移质粒pC-C-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论成功构建了pGC-FU-Shh-GFP慢病毒过表达载体,获得了稳定转染的细胞株。     

携带小鼠RORγt基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

本研究构建携带小鼠ROFγt和glp基因的重组慢病毒载体,检测RORγt蛋白在293FT细胞中的表达。用RT-PCR扩增小鼠RORγt基因,将其克隆至PCR2.1T载体,酶切制备RORγtDNA片段,插入MigR1质粒后将RORγt-IRES-GFP定向连入慢病毒转移质粒pTK208,生成pXZ9-RORγt。用脂质体介导三质粒共转染法转染293FT细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,以Western blot鉴定RORγt的表达。结果表明,RT-PCR扩增出RORγt基因并克隆入PCR2.1T载体;经亚克隆构建了慢病毒转移质粒XZ9-RORγt。质粒经脂质体转染293FT细胞获慢病毒颗粒,慢病毒颗粒体外高效感染293FT细胞,感染后Western blot检测到RORγt蛋白表达。结论：成功构建慢病毒载体pXZ9-RORγt,并在293细胞内获得表达。     

人EZH2基因编码区及3’非翻译区融合蛋白重组慢病毒表达载体构建及其在293T细胞中的表达

目的构建携带人EZH2基因编码区(coding region,CDS)及3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)融合红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)重组慢病毒表达载体,使mCherry-EZH2融合蛋白在293T细胞中稳定表达。方法运用In-Fusion定向克隆技术构建人EZH2基因CDS区及3’UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体,测序无误后抽提质粒,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。Western blot检测mCherry-EZH2的表达。结果测序证实重组慢病毒表达载体基因序列完全正确;病毒颗粒包装成功,滴度为1.59×109IU/ml;Western blot检测293T细胞中可以表达mCherry-EZH2融合蛋白。结论成功构建人EZH2基因CDS区及3’UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体及病毒,其mCherry-EZH2可以在293T细胞中稳定表达。为进一步分析可能调控EZH2基因CDS区及3’UTR表达的miRNA奠定前期实验基础。     

携带人Gfi1基因重组慢病毒载体稳定转染32D细胞株的建立

本研究建立真核细胞表达的Gfi1基因重组慢病毒载体包装系统,并实现Gfi1在32D细胞中长期、稳定的表达,为进一步研究Gfi1基因在恶性血液病中的发生发展建立一个有效的平台。制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（pLOX—Gfi1／pLOX）、包装质粒（pCMVAR8．2）及包膜蛋白质粒（pMD．G）。用脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,48小时后收集病毒上清,并转染靶细胞32D;用Western—blot法检测293T及32D细胞中Gfi1的整合及表达。结果表明：慢病毒的3种质粒可以高效转染293T细胞,并成功包装出慢病毒。目的基因Gfi1能被重组慢病毒高效导入靶细胞32D,并稳定表达,在荧光显微镜下可直接观察到GFP。Western—blot能检测到Gfi1蛋白在包装细胞293T及32D细胞中的表达。结论：慢病毒介导的Gfi1基因可以高效稳定转染32D细胞并持续表达,证明本研究建立了一种有效的基因转移系统。     

构建及鉴定人生存素基因的慢病毒表达载体

背景：抑制椎间盘细胞的凋亡可以延缓椎间盘的退变,而生存素具有调节细胞增殖和抗凋亡功能。目的：构建人生存素基因的慢病毒载体。方法：应用全基因合成技术合成人生存素基因（BIRC5）,通过 PCR扩增目的基因并对 PCR 结果进行电泳分析。将目的基因克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒 Lenti-BIRC5。将重组的慢病毒质粒转化细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性的克隆进行基因测序。将含有目的基因的慢病毒质粒转染293T细胞,应用Western blot技术对重组慢病毒载体 Flag-Survivin 融合蛋白的表达进行检测。结果与结论：PCR鉴定及基因测序结果显示成功构建了含有人Survivin基因的慢病毒表达载体,Western blot检测结果显示目的基因在体外培养细胞中转染成功并且过表达。说明慢病毒表达载体Lenti-BIRC5构建成功,这为下一步研究Survivin在人髓核细胞中的抗凋亡作用提供了载体。     

人神经生长因子重组慢病毒载体构建及检测

目的:构建含神经生长因子(NGF)基因的重组慢病毒载体,并在293T细胞中验证NGF是否可以过表达。方法:将NGF基因克隆至慢病毒穿梭质粒Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP,然后利用酶切鉴定、PCR鉴定及测序验证后,同两个辅助质粒共转染到293T细胞中,构建重组慢病毒载体。重组慢病毒感染293T细胞,通过荧光检测慢病毒的转染效果,用Western Blot检测NGF基因的表达。结果:酶切鉴定、PCR扩增鉴定和对重组慢病毒进行测序,提示重组慢病毒构建正确。荧光显微镜观察重组慢病毒感染的293T细胞,可见强荧光。Western Blot结果提示目的基因可正常表达。RT-PCR测得病毒滴度达到可利用标准。结论:人NGF重组慢病毒载体构建成功。     

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。     

小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达

本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4（CXCR4）基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）以C57BL／6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移载体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒;同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒;通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术（FCM）检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度可达到10^8TU／ml。以重组慢病毒颗粒感染293Fr细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293Fr细胞表达CXCR4蛋白。结论：成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达。     

小鼠Stra8基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的探讨GV341质粒构建小鼠Stra8基因的慢病毒表达载体的方法。方法应用PCR技术扩增目的基因,将扩增产物插入慢病毒质粒GV341,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将慢病毒表达载体转染至293T细胞后,提取转染细胞的总蛋白,用Western Blot法检测细胞中Stra8蛋白的表达情况。结果成功构建了GV341-Stra8慢病毒表达载体。结论 Stra8慢病毒表达载体的构建为体外研究Stra8基因的功能奠定了基础。     

IGFBP7基因慢病毒载体的构建及在K562细胞中的表达

本研究构建胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)基因的慢病毒载体,为研究该基因在白血病中的作用提供基础。采用限制性内切酶酶切获得目的基因,基因重组构建慢病毒载体质粒venus-IGFBP7,用293T细胞包装慢病毒颗粒,感染K562细胞,并采用多种方法鉴定。结果表明,所获IGFBP7基因经测序与GenBank比对序列一致,慢病毒载体质粒venus-IGFBP7经BamHⅠ酶切鉴定片段大小正确,荧光显微镜及流式细胞术检测到绿色荧光蛋白在293T及K562细胞中表达,RT-PCR和Western blot检测到IGFBP7 mRNA和蛋白在K562细胞表达。结论:成功构建带有IGFBP7基因的慢病毒载体,为研究IGFBP7基因在K562细胞中的作用奠定了基础。     

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.     

Rac1基NRNAi慢病毒载体的构建与鉴定

背景：Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达。目的：构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率。方法：应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达。针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-Time PCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞。荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果与结论：成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%。成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌（Tca8113）提供了有效的siRNA靶序列。     

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

背景：神经元限制性沉默因子（REST/NRSF）能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。目的：构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。方法：针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用Real-timePCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。结果与结论：PCR和测序证实,构建出了REST/NRSFshRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

人GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体的构建及鉴定

目的 构建人GLIPR-2基因慢病毒RNA干扰（RNAi）载体,并鉴定其感染人肝癌细胞系HepG2后缺氧条件下的GLIPR-2基因表达变化.方法 根据GLIPR-2基因序列合成siRNA片段,克隆至慢病毒载体pMAGic7.1上,转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒.感染HepG2细胞,流式细胞术检测GFP的表达率,并用Western blot检测目的 蛋白在缺氧条件下的表达变化.结果 重组RNAi质粒pMAGic7.1-shRNA-GLIPR-2经菌落PCR鉴定及测序证实构建正确;稳定感染HepG2 细胞后,GFP的表达率为分别为84.48%、69.97% 和39.82%;Western blot结果显示慢病毒转染组GLIPR-2蛋白的表达水平较对照组明显降低.结论成功构建了GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体,该载体在缺氧条件下可明显抑制目的 蛋白在HepG2细胞中表达,为进一步研究GLIPR-2的生物学功能奠定了基础.     

携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体的构建及其在Sup-B15白血病细胞株的表达

本研究旨在构建携带人血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)基因的重组慢病毒载体及探讨VE-cadherin蛋白在Sup-B15细胞中的表达。采用RT-PCR扩增人VE-cadherin基因并克隆至pCR-Blunt载体。将VE-cadherinDNA片段连入慢病毒转移质粒pLB,生成重组慢病毒质粒pLB-VEC。用三质粒共转染法包装慢病毒,重组慢病毒感染Sup-B15细胞,在光学显微镜下观察细胞状态,用流式细胞术及Western blot法鉴定VE-cadherin蛋白表达。结果表明,成功扩增出人VE-cadherinDNA片段并克隆至pCR-Blunt载体;亚克隆构建慢病毒载体pLB-VEC。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒,体外可有效感染Sup-B15细胞。感染后细胞发生明显的形态改变,流式细胞术及Western blot检测到VE-cadherin蛋白表达。结论 :成功构建携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体pLB-VEC,并可在Sup-B15白血病细胞株获得有效的表达。     

重组hβc基因的慢病毒颗粒的包装及其在NB4细胞过表达研究

本研究旨在通过慢病毒介导的基因转移方法,使NB4细胞稳定过表达hβc基因,观察过表达hβc基因的NB4细胞在IL-3或GM-CSF作用下分化行为的改变,探讨hβc基因与NB4细胞分化之间的关系。以本实验室前期构建的携带hβc基因ORF的克隆质粒为模板,用带PmeI和BstBI酶切位点的引物PCR获得目的基因,酶切PCR产物,定向克隆至慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK/IRES/GFP.WPRE,构建含hβc基因的慢病毒载体,经酶切及测序鉴定其正确性,将构建好的重组质粒与包装质粒一起共转染293T细胞,收集培养液上清,感染NB4细胞,用Western blot鉴定目的基因在NB4细胞中的表达情况。以转染空载体慢病毒的NB4细胞(简称NB4-blank细胞)为对照,观察过表达hβc基因的NB4细胞(简称NB4-hβc细胞)在IL-3、GM-CSF、全反式维甲酸(ATRA)作用下分化行为的改变。结果表明:含有hβc基因的重组慢病毒载体能高效转染NB4细胞,并使NB4细胞稳定过表达hβc基因。NB4-hβc细胞,在IL-3或GM-CSF作用下CD11b表达水平上调,但上调的幅度均低于ATRA作用下的上调幅度,且未观察到形态学改变。NB4-Blank细胞在IL-3或GM-CSF作用下CD11b表达水平无明显变化。结论 :通过慢病毒介导的基因转移方法,成功地使NB4细胞稳定过表达hβc基因,IL-3或GM-CSF在一定程度上能诱导过表达hβc基因的NB4细胞向中性粒细胞分化,但不能使其完全分化成熟。     

核干细胞因子RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建核干细胞因子基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒表达载体并对其在白血病细胞株中的干扰效果进行鉴定,为后期研究奠定基础.方法 针对核干细胞因子基因的序列设计RNAi有效靶点,合成含RNA干扰序列、Loop环、Age I和EcoR I酶切位点,以及终止信号的单链DNA oligo,经退火形成双链DNA,与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV248慢病毒空载体进行连接产生重组慢病毒载体,转化感受态细菌,挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应,并对PCR阳性克隆进行测序.将重组慢病毒载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞进行病毒的包装,收集、浓缩病毒液后测定其滴度,并转染HL-60、NB4以及K562等三种人白血病细胞株,倒置荧光显微镜下观察其转染效率,real-time PCR检测核干细胞因子基因的敲减效率.结果 经测序证实正确构建出了核干细胞因子基因的RNAi重组慢病毒载体,包装、浓缩后其滴度为4×108 TU/ml,荧光显微镜下显示其能有效转染进入HL-60、NB4及K562等白血病细胞株中,转染效率均在80％以上;real-time PCR显示转染后核干细胞因子基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降（P＜0.05）,在HL-60、NB4和K562细胞中核干细胞因子基因的抑制效率分别为52.3％、80.5％、62.3％.结论 成功构建出了核干细胞因子基因的RNAi慢病毒载体,其能有效干扰人白血病细胞株HL-60、NB4及K562中的核干细胞因子基因表达.     

Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kff2ds4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体，应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4，包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒颗粒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明，PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×10^8TU／ml。结论：成功地构建了人kff2ds4基因RNAi慢病喜载体．