人新型干扰素K的基因克隆、表达、纯化及其抗病毒活性的初步研究

目的制备人干扰素κ(hIFN-κ)并初步研究其生物学活性.方法克隆hIFN-κ的cDNA并根据大肠埃希菌的密码子偏好性人工合成了hIFN-κ基因,在大肠埃希菌DH5α中高效表达、纯化后测定了rhIFN-κ的多种生物学活性,包括抗病毒活性、抗细胞增殖活性、种属特异性以及NK细胞调节活性.结果成功地获得了高纯度的rhIFN-κ,纯度在90%以上.利用WISH-VSV系统检测rhIFN-κ的抗病毒活力为2.0×106 IU/mg.与rhIFN-α2b的比较发现,rhIFN-κ无论在抗病毒活性、细胞生长抑制,还是在促NK细胞活性方面均弱于前者.结论rhIFN-κ在不同种属来源细胞上的抗病毒活性因种属来源而异,不同的病毒对rhIFN-κ的敏感性是不同的.     

新型重组人IFN-λ2的高效表达、纯化与抗病毒活性研究

目的在大肠埃希菌中高效表达重组人干扰素λ2(rhIFNλ2),并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌的偏爱密码子人工设计合成人干扰素λ2(hIFNλ2)的高表达基因,将其克隆到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌中进行表达,表达产物经变性、复性、阳离子交换层析及分子筛层析纯化,测定其抗病毒活性、种属特异性及抗HBV活性。结果在大肠埃希菌表达的目的蛋白占细胞总蛋白量的15%左右,纯化后的纯度达到90%以上,在WISH细胞上抗VSV活性约为1.5×106IU/mg。与rhIFNα2b比较,表达产物在非灵长类细胞上的抗病毒活性较在灵长类细胞上弱,目的蛋白在HepG2.2.15细胞上表现有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性。结论hIFNλ2可以在大肠埃希菌内实现高效表达,表达产物具有抗病毒活性,有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性,本型IFN有较严格的种属特异性。     

丙型肝炎病毒血清型对慢性丙型肝炎干扰素抗病毒疗效影响的研究

目的研究丙型肝炎病毒血清型对慢性丙型肝炎于扰素抗病毒疗效的影响。方法对慢性丙型肝炎患者的血清进行ALT检测，采用Cobas amplicor monitor test，version 2．0（v2．0）试剂进行HCVRNA定量和Abbott公司的Murex HCV Serotyping 1-6 Assay试剂进行HCV血清学分型检测。对慢性丙型肝炎患者进行聚乙二醇于扰素a-2a（派罗欣）与罗荛愫（Roferon—A）治疗24周和24周随访结束的生化指标和病毒学应答进行观察，分析不同HCV血清型患者在抗病毒治疗后生化和病毒学应答的差异。结果98例患者共检出血清6型2例、5型1例、4型1例、3型10例、2型23例和1型44例，仍有17例未能分出血清型。派罗欣治疗组24周治疗结束时各血清型和未分型组之间的ALT复常率和病毒应答率无差异，而48周随访结束血清非1型的ALT复常率（76．2％）和持续病毒应答率（66．7％）高于血清1型，血清1型ALT复常率和持续病毒应答率分别为27.3％和27．3％，差异有统计学意义（P=0．035）。罗荛愫组末分型组、血清1型和非1型之间24周治疗结束时和随访结束时的ALT复常率和病毒学应答率均无差异。结论在6个月的IFN抗病毒疗程时，HCV血清型仅在派罗欣治疗组影响慢性丙型肝炎抗病毒治疗的持续病毒应答率。     

新型人干扰素α1c的纯化和活性测定

目的在大肠杆菌中表达和纯化一种新型的人ＩＦＮα１ｃ。方法首先建立了表达和纯化ＩＦＮα１ｃ的实验室生产流程。根据干扰素的抗病毒、抗细胞增殖以及免疫调节特性,体外测定这种ＩＦＮ的生物学活性。结果ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹均证实,表达产物具有干扰素的免疫反应性。ＶＳＶ－ＷＩＳＨ系统的抗病毒测活表明,表达的 ＩＦＮα１ｃ（３． ２ × １０７）的抗病毒活性较 ＩＦＮα１ｂ（１． ０ × １０７－ １． ８ × １０７）略高;而抗 Ａ５４９细胞的增殖能力则与后者相当。此外ＩＦＮα１ｃ还能增强ＮＫ细胞的杀伤活性。结论本系统成功地在大肠杆菌中表达了人ＩＦＮα１ｃ。这种高比活性的干扰素可能成为临床治疗的侯选者。     

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的 在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定.方法 提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段.将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化.表达产物经West...     

淋巴细胞转移干扰素抗病毒活性的机理研究

本文研究了人淋巴细胞与羊膜FL细胞之间干扰素介导的抗病毒活性转移的机理。受者FL细胞表达的抗病毒转移活性具有下述特征:1.用放线菌素D抑制FL细胞的RNA合成,能抑制抗病毒活性的表达;2.共同培养中存在的抗2-5_P_3A_3抗体不干扰细胞间抗病毒活性的转移;3.FL细胞膜上干扰素受体用植物血凝素封闭后,不影响抗病毒活性转移的表达。因此,我们认为,淋巴细胞膜上干扰素活化的第二信使分子可能是在细胞之间传递干扰素信息的重要效应物质。     

新型人干扰素α1c的纯化和活性测定

目的在大肠杆菌中表达和纯化一种新型的人IFNα     

复合干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及活性分析

目的 在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因，克隆至分泌型酵母表达载体pMKX9K，线性化后转化毕赤酵母GS115，筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换，疏水层析，凝胶过滤三步层析纯化，用细胞病变抑制法测定其活性，并结合Iowry法蛋白定量计算其比活性。结果 SDS-PAGE分析显示，重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中，经纯化后纯度达到96％，其N端氨基酸序列与理论值一致，比活与干复津相当。结论 复合干扰素在毕赤酵母中获得高效分泌表达，为获得大量基因工程产品奠定了基础。     

拉米夫定、干扰素α-2b、黄芪注射液三联叠加治疗慢性乙型肝炎的初步评价

用抗病毒药拉米夫定、干扰素α-2b和免疫调节剂黄芪注射液叠加，治疗慢性乙型肝炎(chronie hepatitis B，CHB)；从临床综合疗效、肝功能、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制指标三方面进行分析，并与单用拉米夫定、干扰素α-2b、黄芪注射液及基础保肝治疗比较，初步评价联合用药方案的疗效。     

乙型肝炎病毒大蛋白检测在拉米夫定抗病毒治疗中的应用研究

目的 通过检测拉米夫定治疗患者血清中的乙型肝炎病毒大蛋白(HBV-LP),同时检测乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)载量,探讨拉米夫定治疗过程中HBV-LP与HBV-DNA的关系,观察乙型肝炎病毒大蛋白用于评估拉米夫定抗病毒治疗的应用效果.方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法对HBV-LP进行检测;采用荧光定量PCR方法对HBV-DNA进行检测.结果抗病毒治疗有效的患者HBV-DNA和HBV-LP下降趋势一致,HBV-LP出现阴转的时间要晚3个月于HBV-DNA阴转;抗病毒治疗无效的患者HBV-DNA和HBV-LP都是始终没有出现阴转;抗病毒治疗效果反复组中患者HBV-LP始终没有出现阴转,HBV-DNA则暂时阴转.结论拉米夫定抗病毒治疗过程中动态检测乙型肝炎病毒大蛋白可用于评估抗病毒治疗效果.     

重组人干扰素Epsilon的表达纯化及生物学性质研究

目的表达纯化一种新型重组人干扰素Epsilon(rhIFNε155ser),并对它的生物学特性进行初步研究。方法人工合成rhIFNε155ser的全基因序列,并按照大肠埃希菌密码子嗜性作适当改造,然后构建到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌DH5α中表达。将表达的包涵体蛋白纯化复性后,对最终产物的抗病毒活性、细胞生长抑制活性和NK细胞刺激活性进行鉴定。同时,利用芯片技术,从基因的水平对rhIFNε155ser的生物机制进行初步的了解。结果rhIFNε155ser以包涵体的形式表达,经纯化蛋白纯度可达95%。复性后rhIFNε155ser在WISH抗VSV系统中的抗病毒活性可达6×105IU/mg。在100～1000pg/ml下rhIFNε155ser具有剂量依赖性的抗增殖活性,而NK细胞刺激活性无剂量依赖性。基因芯片扫描发现,22278个位点中,有283个基因显著上调,另外1894个显著下降。结论成功地表达了rhIFNε155ser,发现此IFN具有一定的抗病毒、抗增殖和NK细胞刺激活性。芯片技术可进一步拓展对IFN的功能研究。     

重组酵母鸡α干扰素的研制及其抗病毒活性测定

目的通过酵母真核表达系统获得鸡α干扰素,并鉴定其抗病毒生物活性.方法以Con A刺激4～10小时后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆出鸡α干扰素成熟蛋白基因,通过EcoR I 和Xba I两个酶切位点使该基因插入酵母表达载体(pPICZa-A),并把线性化该重组酵母鸡α干扰素载体,通过电转化使鸡α干扰素基因整和到酵母(X33)基因组上,利用微量病变抑制法测定表达的鸡α干扰素的抗病毒活性.结果实验结果表明重组酵母鸡α干扰素活性单位为10×48U/ml,具有较好的抗病毒效果.结论实验研究结果表明重组酵母鸡α干扰素具有较好的抗病毒能力.     

新型重组α型干扰素原核表达载体的构建、表达及活性检测

目的合成一种新型重组α型干扰素(IFN-α)基因序列,使其在大肠杆菌中表达,并检测其生物活性。方法人工合成新型重组IFN-α基因全长,将PCR扩增产物与pUC18进行双酶切后构建克隆载体,并转化至大肠杆菌,经蓝白斑筛选,提取质粒,以EcoRI和BamHI双酶切,插入表达载体pBV220,转化至大肠杆菌,42℃热诱导表达目的蛋白。超声破菌,抽提复性后以Sephacryl S-200HR分离获得目标蛋白。在转染有乙型肝炎病毒基因的人肝癌细胞系2.2.15细胞中,研究其对HBsAg和HBeAg的分泌的影响。结果重组质粒读码框经测序与预期一致,表达产物经SDS-PAGE分析获得证实,与2.2.15细胞培养8d,对HBeAg和HBsAg的分泌具有一定的抑制作用。结论成功地构建原核表达载体pBV220-IFN-α,并使其在大肠杆菌中获得融合表达,重组表达的新型重组IFN-α具有抗病毒作用。     

抗重组人γ干扰素单克隆抗体的纯化研究

取本实验室制备的抗重组人γ干扰素单克隆抗体(rHu IFN-γ/McAb)A_3和B_3E_7粗制品(BALB/c小鼠腹腔分泌液),分别用饱和硫酸铵盐析法和葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析法进行纯化。结果发现,虽两者都能部分纯化A_3和B_3E_7-McAb,但后者(SPA亲和层析法)的纯化效果比前者(硫酸铵盐析法)好。纯化后的产品经冷冻干燥后置低温贮存,其活性(抗体滴度)不受影响.     

干扰素影响肿瘤相关抗原表达的研究

简要地概述了干扰素对肿瘤相关抗原表达影响的体外研究、动物实验及临床初期观察结果，对其可能的作用机制进行了探讨，并提出作者自己的若干看法。     

人Bcl-2蛋白的基因克隆、表达及初步活性分析

目的：以特定形式对高度疏水性的人Bcl-2(hBcl-2)蛋白进行可溶性表达，获得非疏水性hBcl-2蛋白并具备生物学结合活性，为进一步研究hBcl-2三维结构并在此基础上研发特异性小分子药物提供充足的蛋白样品。方法：用PCR方法对hBcl-2基因进行克隆重组，插入原核表达载体pET28a( )中。用Western Blot和MALDI-TOF生物质谱鉴定，采用荧光极化方法进行活性测定。结果：重组hBcl-2在E．Coli中实现了高效、可溶性的融合表达，重组蛋白经纯化至电泳纯，具备了与Bcl-2家族Bak蛋白BH3功能域特异结合的能力，表明原核表达的重组hBcl-2具有较好的结合活性。结论：成功地对重组hBcl-2蛋白进行了可溶性表达和活性测定。     

人λ-干扰素在BHK-21中的表达及生物学活性的研究

目的:研究HuIFN-λ1和HuIFN-λ2真核细胞重组表达及其生物学活性.方法:用水疱性口炎病毒(VSV)刺激人宫颈癌HeLa细胞, 用RT-PCR克隆HuIFN-λ1和HuIFN-λ2基因, 与PCAGG-EGFP真核表达载体连接, 构建重组体PCAGG-HuIFN-λ1和PCAGG-HuIFN-λ2并进行鉴定, 后在BHK-21细胞进行表达, 采用VSV*GFP于人肺腺癌A549上进行表达产物抗病毒活性测定;并通过已构建的MDBK-Mxp-Luc细胞系对HuIFN-λ1和HuIFN-λ2诱导MxA抗病毒蛋白产生的特性进行研究.结果:HuIFN-λ1-PMD18-T Vector和HuIFN-λ2-PMD18-T Vector的SacⅠ、XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ双酶切鉴定, 均出现610 bp大小的带, 测序示与GenBank上报道的序列完全一致.PCAGG-HuIFN-λ1活性104 IU/mL, PCAGG-HuIFN-λ2活性为102 IU/mL, 且PCAGG-HuIFN-λ1诱导Mx抗病毒蛋白的表达一定时间内随时间延长表达不断增强, 9～12 h达高峰, 24 h后消失(P＜0.05).结论:成功构建了PCAGG-HuIFN-λ1PCAGG-HuIFN-λ2 的真核表达载体并在BHK-21细胞中得到表达, 其抗病毒活性与诱导Mx抗病毒蛋白密切相关.     

人IFN-ε的表达、纯化及生物学特性研究

目的 表达并纯化人IFN-ε,并对其理化特性和生物学特性进行初步研究. 方法 利用PCR技术以人基因组DNA为模板,获得目的片段的全基因序列后,克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组表达载体pET-32a(+)/IFN-ε,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并对表达进行了优化.产物的表达形式为包涵体,经过纯化复性后,获得高纯度的活性蛋白IFN-ε.对IFN-ε的理化性质和抗病毒活性、抑制肿瘤细胞增长活性、刺激细胞产生抗病毒蛋白的活性进行了鉴定. 结果 IFN-ε以包涵体形式表达,纯化后纯度大于95%,抗病毒活性为1.2×105 IU/mg,能够抑制肿瘤细胞的生长,并能诱导细胞产生抗病毒蛋白MxA. 结论 成功表达了人IFN-ε蛋白,并证明此蛋白质具有抗病毒和抗细胞增殖的活性.     

慢性乙型肝炎外周血HBV-LHBs反式激活功能与抗病毒疗效关系的研究

目的 探究慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒外膜大蛋白分子(HBV-LHBs)反式激活功能与慢性乙型肝炎抗病毒治疗疗效关系.方法 对60例抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者采取每3个月进行HBV DNA、HBV-LHBs以及乙肝免疫标志物检测观察各指标间的变化.结果 入组时60例抗病毒组HBV DNA与HBV-LHBs检出率有较高的一致性检出结果,无统计学意义(P＞0.05),HBV-LHBs阳性率与HBeAg阳性率存在差异(X2=4.08,P＜0.05).经过24个月抗病毒治疗HBV-LHBs始终表达者29例,其中HBV DNA在24个月里出现转阴后反弹的20例、HBV DNA持续阳性未转阴者7例.60例患者24个月里未发现HBsAg血清转换,4例出现HBeAg血清转换.结论 (1)血清HBV-LHBs检测能够反映出乙肝病毒的复制情况与HBVDNA具有较好的相关性.(2)抗病毒治疗过程中动态观察HBV-LHBs的表达能够预测抗病毒治疗的有效性.