重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721，培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达，并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原EI在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后、RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA，细胞培养上清中可检出HCV正链RNA，CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验研究

目的 建立接近体内自然感染状态并能长期复制的丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型．方法 用HCV阳性血清感染人肝癌细胞株HepG2、SMMC 7721及胎肝细胞株L02，继续培养60d，用巢式逆转录-聚合酶链反应(nested RT-PCR)检测培养细胞及上清中正、负链HCV RNA。结果 HepG2、SMMC 772l在感染后第2-30d，L02在感染后第3-30d细胞中可以间断检出HCV正链RNA；3株细胞的细胞内HCV负链RNA均在感染后第3-30d可以间断检出，检出率与正链RNA接近。3株细胞以HepG2细胞中HCV RNA正、负链检出率较高，并在第3l—60d仍可间断检出，但复制程度逐渐减弱。3株细胞的培养上清中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性，检出率与细胞内正链RNA基本一致。培养上清中均末检出HCV负链RNA。结论 HePG2、SMMC772l及L02细胞均对HCV易感，并能支持HCV长期复制。而HePG2细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感染树鼩肝细胞的初步研究

目的：探讨多抗原肽（MAP）免疫血清在体外能否阻断丙型肝炎病毒（HCV）感染树Gu感染树Gu肝细胞，为研制HCV分子疫苗提供实验基础。方法：用兔抗MAP血清分别与两分感染血清按一定比例混合后接种于原代培养的树Gu肝细胞中，用逆转录聚合酶链反应（RR－PCR），免疫组化，原位杂交分别检测细胞内或上清中正负链RNA，细胞内HCV NS3抗原的表达情况，以及原位检测细胞内HCV负链RNA，结果：1份HCV RNA阳性血清与兔抗MAP血清按1：1混合后接种于培养的树Gu肝细胞中，细胞内可检出HCV正负链RNA，并有HCV NS3抗原的表达，而另外1份HCV RNA阳性血清与兔抗MAP血清按1：1，5：1，10：1混合后接种于培养的树Gu肝细胞中，细胞内未检测出HCV正负链RNA，也未见特异性抗原表达，结论：兔抗MAP血清在体外能部分阻断HCV感染。     

肠道病毒71型微复制子的构建

目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况。方法 聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白(EGFP),利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至pMD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系。荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况。结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12~72 h取样所测RNA含量几乎不变。结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义。     

人乳头瘤病毒早期癌蛋白E6/E7稳定表达细胞系的构建及其对Rab12表达的影响

目的 探究人乳头瘤病毒(HPV)编码的早期癌蛋白E6/E7对小GTP酶蛋白Rab12表达的影响。 方法 利用逆转录病毒包装系统获得含pBabe-Vector质粒和pBabe-16E7质粒的高滴度病毒颗粒,感染细胞,并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达HPV16E7的UMSCC 10A-16E7细胞系,Western blotting检测E7相关蛋白p53和E2F1的表达变化,比较UMSCC 10A-Vector细胞系和UMSCC 10A-16E7细胞系的Rab12蛋白表达水平。用同样方法在HaCaT、RPE1细胞系中进一步验证。用siRNA干扰SiHa、Caski细胞(HPV-16阳性的宫颈癌细胞)中16E6/E7及HeLa细胞(HPV-18阳性的宫颈癌细胞)中18E6/E7的表达,通过Western blotting比较siRNA干扰前后E6和E7相关蛋白(E2F1、p53和Rab12)的表达差异。 结果 利用逆转录病毒包装系统成功构建稳定表达的细胞系,过表达E6/E7的细胞系中Rab12表达升高,干扰E6/E7的细胞系中Rab12的表达降低。 结论 HPV编码的早期癌蛋白E6/E7可调控Rab12的表达。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响

目的 研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分别为CaSKi-R和CaSKi-P。观察细胞的生长状态,测定CaSKi,CaSKi-R和CaSKi-P3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率、细胞侵袭力实验、裸鼠体内致瘤性,以及RT-PCR检测细胞中COX-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达,同时,免疫组化检测3种细胞COX-2、VEGF抗原表达,分析特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响。结果 CaSKi、CaSKi-P细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力相近,而CaSKi-R细胞的细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力与以上两种细胞相比却明显降低。RT-PCR检测CaSKi-R细胞的COX-2、VEGF表达水平也低于CaSKi、CaSKi-P细胞的表达。细胞免疫组化测定CaSKi、CaSKi-P和CaSKi-R细胞都有COX-2、VEGF抗原表达,而CaSKi-R细胞的抗原染色程度较弱。结论 特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型,可能与宫颈癌CaSKi细胞内COX-2、VEGF的表达水平降低有关。     

ALT与HCV核心抗原及HCV—RNA相关性研究

目的研究ALT与HCV核心抗原、HCV—RNA间关系。方法对81例HCV—RNA阳性标本检测HCV核心抗原和ALT水平。结果81例HCV—RNA阳性标本检出HCV核心抗原阳性32例,灰区26例,ALT水平超过临床参考值56例,ALT检测水平与HCV核心抗原阳性程度呈正相关性。结论HCV—cAg仅与HCV—RNA复制密切相关,与复制水平无关。HCV核心抗原可联合HCV抗体检测提高血液标本HCV感染检出率,结合ALT可以评测感染状态。     

siRNA抑制感染细胞模型中HCV复制的研究

目的:探讨siRNA能否有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞中HCV的复制.方法:用HCV JC1质粒体外制备HCV RNA转录体,转染Huh-7.5.1细胞,收集细胞上清,再次孵育Huh-7.5.1细胞以建立HCV感染细胞模型,并用间接免疫荧光检测细胞内HCV核心蛋白的表达.将针对HCV NS5B基因的siRNA转染HCV感染细胞(浓度为4、40和200 nmol/L,时间为24 h、48 h和72 h),将4、40和200 nmol/L siRNA转染正常Huh-7.5.1细胞,并设空白对照、脂质体对照、无关siRNA对照以及IFNα-2b(1 000 IU/ml)组,用荧光定量PCR检测细胞内HCV RNA和PKRmRNA水平.结果:HCV感染的Huh-7.5.1细胞中检测出HCV核心蛋白表达.40 nmol和200nmol/L siRNA 24 h组及4、40、200 nmol/L siRNA 48 h和72 h组,HCV RNA水平分别降至58％、54％、29％、17％、17％、33％、22％、19％,明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).1 000 IU/mlIFN的各时间组HCV RNA水平均明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).各浓度siRNA组的PKR mRNA的表达与对照组无明显差异(P＞0.05).结论:针对HCV NS5B区的siRNA能够明显抑制HCV感染细胞中HCV的复制,而不引起双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)基因表达的激活.     

Characteristics of HCV replication and expression in a cultured human liver carcinoma cell line in vitro

ProgressonhepatitisCresearchhasadvancedquickly.However,theabsenceofcellculturesystemofHCVinfectionhashamperednotonlytheunder-standingofitslifecycle,butalsotheanalysisofthemoleculardeterminantsofitspersistence.Toidentifycriticalepitopesthatelicitaneutralizingantibodyre-sponseandtounderstandthepathogenesisofpersis-tentHCVinfection,efficientcellmodelsofHCVin-fectionisneeded[1].HumanT-lymphocytecelllines[2-5],humanfibroblastcells[6](VH3),peripheralbloodmono-nuclearcells[7](PBMCs)andhepatocy…     

体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性

建立支持ＨＣＶ体外长期复制的细胞培养体系,研究其体外复制和表达特性。方法：将ＨＣＶ感染血清接种人肝癌细胞系７７２１后,以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内ＨＣＶ的感染和复制情况。结果细胞内和培养上清中在孵育后的３月余均可间断地检测出ＨＣＶ正链和／或负链ＲＮＡ,多种ＨＣＶ抗原在细胞内能稳定有达;ＨＣＶ ＲＮＡ和抗原多位于胞浆中,结论ＨＣＶ在７７２１细胞系中的复制和表达与体内感染状态接     

In Vitro Expression of Hepatitis C Virus Non-structure 5 Antigen in the HepG2 Cell Line

ItisofgreatsignificancetoestablishasensitivepropagationsystemofHCVinvitroforstudyingthefeaturesofHCV,pathogenesisofHepatitisC,thetreatmentofanti--virusandstudyofvaccine.Wede-tectedthepositiveandnegativelineofHCVinTlymphcellsofhumaninndroinpreviousstudyLI],andpresentedinthispaPeristhefurtherstudyoninvljroexpressionofHCV.lMATERMisANDMETHODS1'1PositiveInocuIumsofHCVRNATheserumofHCVRNAwith1evelof2X10'copy/mlwasselected,anddefinedbyfluorescentquantificationmethed(Thereagentkitwa…     

乙型丙型肝炎病毒合并感染细胞模型的建立

目的：本文拟利用慢病毒载体,在可感染丙型肝炎病毒（HCV）的Huh7.5.1细胞中过表达人肝细胞乙型肝炎病毒（HBV）受体钠离子牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP）编码基因,建立Huh7.5.1- hNTCP细胞模型,使其可以被HBV、HCV共同感染。方法：使用携带人NTCP编码基因、GFP（green fluorescent protein）基因、嘌呤霉素抗性基因的GV358重组慢病毒载体,以50的感染复数（MOI）感染Huh7.5.1细胞。经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达人NTCP基因的Huh7.5.1-hNTCP细胞株,并通过Western-blotting验证NTCP蛋白的表达。使用HepAD38细胞来源的HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞,通过ELISA及qPCR等方法检测HBV感染后不同时间点HBsAg、HBeAg的表达以及HBV DNA的复制。HBV感染后24小时予以HCV-JFH1感染,检测合并感染状态下HBV DNA以及HCV RNA的复制。结果：Western-blotting 结果表明Huh7.5.1-hNTCP细胞株可稳定表达HBV受体NTCP。HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后ELASA、qPCR结果显示：HBsAg、HBeAg、HBV DNA合成逐渐增加,并在第9天达峰。HBV/HCV合并感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后,qPCR检测结果显示不同时间点HBV DNA、HCV RNA复制逐渐增加。结论:建立了Huh7.5.1-hNTCP细胞模型,该模型可被HBV/HCV合并感染。     

In vitro expression of hepatitis C virus non-structure 5 antigen in the HepG2 cell line

Summary To establish a cell line as a model system for HCV infection and propagationin vitro, a human HepG2 cell line was incubated with a HCV RNA positive serum. The sABC immunological techniques and gold-labeled colloid electron microscopy method were employed to examine the viral proteins in those cells. The HCV non-structure 5 antigen was first detected in the HepG2 cells 72 h after incubation. The antigen was continuously observed in the cytoplasm as well on the membrane of the HepG2 cells even after 1, 2, 3 and 4 weeks after incubation. The observation of HCV non-structure 5 antigen continuously expressed in the HepG2 cells strongly indicates that the cells may have been infected by HCV virus. Therefore, the HepG2 cell line may serve as a potential host for establishment of HCV infection and propagationin vitro. This project was supported by a grant of the National Educational Committee for return scholars (No.)     

高表达CD81的Huh7细胞株对提高HCV病毒感染效率的研究

目的建立具有高感染性的丙型肝炎病毒（HCV）的体外细胞株。方法构建高表达CD81的Huh7细胞株。将HCV质粒（JFH-1,2a）体外转录成RNA,电转染到Huh7和CD81-Huh7细胞中,实时定量PCR法检测两组细胞和培养上清液中病毒载量,间接免疫荧光法检测细胞中HCV核心蛋白表达。收集电转后细胞上清液重新感染两组细胞,检测细胞中病毒RNA表达。结果 CD81-Huh7电转后,细胞和上清液中病毒RNA水平均明显高于Huh71-2log。其被感染的效率也高于Huh7。结论成功建立一株能够高表达感染性HCV病毒颗粒的细胞株CD81-Huh7。     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。