大豆甾醇糖苷及两亲性聚乙二醇对阳离子脂质体细胞转染与膜各向异性的影响

目的：考察不同脂质体材料对阳离子脂质体细胞转染率和脂质体膜流动性的影响。方站：合成美国FDA认可应用于人体给药的阳离子材料3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(3β[N-(N’，N’-dimethy-laminoethane)carbamoyl]cholesterl，DC-chol)；以荧光素钠(fluorescein sodium，SF)为荧光标记物，二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmibylphosphatidylcholine，DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE)和胆固醇(cholesterol，ch)为辅佐膜材，分别制备DPPC／ch／DC-chol阳离子脂质体、DOPE/ch／DC-chol阳离子脂质体及大豆甾醇糖苷(soybean-derlved sterylglucoside，SG)或聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(polyethylene glycol-dis-tearoylphosphatidylethanolamine，PEG-DSPE)表面修饰的阳离子脂质体，并制备DPPC/ch组成的中性脂质体。以HepG2 2．2．15为细胞模型观察不同脂质体处方对细胞转染率的影响；通过荧光偏振法考察不同脂质材料对脂质体膜流动性的影响。结果：DC-chol能显著增加脂质体对SF的包封率(从0．64％到的74．84％)、细胞转染率(从1．83％到32．29％)及脂质体膜的流动性。在阳离子脂质体处方中加入SG能显著提高阳离子脂质体的包封率(从52．60％到63．37％)、细胞转染率(从20．18％到47．48％)及脂质体膜的流动性；PEG-DSPE可促进阳离子脂质体的细胞转染(从20．18％到28．17％)。结论：DC-chol和SG能显著提高脂质体的细胞转染率和脂质体膜的流动性；PEG-DSPE能促进阳离子脂质体的细胞转染。     

两种方法制备阳离子脂质体包裹蛋白转染法的比较

目的　比较不同方法制备包裹蛋白脂质体的包封率和转染率 ,评价蛋白转染的可行性。方法　采用逆相蒸发法和冻融超声法制备包裹人IgG的阳离子脂质体 ,测定包封率并分别转染小鼠脾细胞 ,用流式细胞术、免疫荧光法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法和免疫印迹法检测转染效果。结果　逆相蒸发法制备的脂质体包封率高于冻融超声法 (P <0 .0 1)。两种方法制备的脂质体转染率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　逆相蒸发法制备的阳离子脂质体更适合作为蛋白转染的载体有效地将目的蛋白导入细胞     

多聚胺阳离子脂质体转染体系的构建

目的 制备多聚胺阳离子脂质体（Polyamine Cationic liposome，PCL），转染哺乳动物细胞，评估其转染效率及细胞毒性，筛选高效低毒的阳离子脂质体转染体系。方法 多聚胺阳离子脂质TC—Chol与中性磷脂DOPE以一定比例，制备PCL，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞毒性，筛选阳离子脂质体与DNA结合的最佳比例及最佳转染时间。结果 多聚胺阳离子脂质体与DNA的质量比为3～4：1时可达到高效低毒，转染后48h转染效率最高。结论 由TC—Chol与DOPE制备的多聚胺阳离子脂质体可提高转染效率，在一定条件下可达到相对高效低毒，为基因转染和基因治疗提供可靠的实验室依据。     

RNA干扰抑制HepG2细胞AFP基因表达实验方法建立

目的：筛选较理想的阳离子脂质体META／pGenesil—AFP质粒转染HepG2的方法。方法：将针对两条靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板双链,连接于质粒表达载体,构建质粒载体pGenesil—1—AFP1（含绿色荧光蛋白GEP编码序列）及pGenesil-2-AFP2,用阳离子脂质体META／质粒载体pGenesil—1—AFP1转染HepG2细胞。荧光显微镜观察并计算不同剂量配比的脂质体／质粒载体混合液转染效果及微粒子化学发光免疫分析法检测不同剂量配比转染后对AFP基因表达的影响。结果：剂量比为8μL：2．5μg条件,能有效地转染HepG2细胞,并有效抑制AFP表达且无细胞毒性作用。结论：本研究成功建立了阳离子脂质体META／质粒载体pGenesil—1—AFP1转染HepG2细胞实验方法。     

聚酰胺-胺型树枝状高聚合物介导survivin反义寡核苷酸抑制结直肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的 探讨聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(PAMAM)介导survivin反义寡核苷酸(survivin-ASODN)对结直肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 以人结直肠癌细胞SW620裸鼠皮下注射建立结直肠癌裸鼠皮下移植瘤模型.将PAMAM和阳离子脂质体分别与survivin-ASODN混合得到载反义基因转染复合物.透射电镜观察复合物的形态.激光散射粒径分析仪测定粒径,zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位,离心法和紫外分光分度仪测定复合物的包封率和体外DNA释放速度.将两种反义基因复合物注射裸鼠移植瘤体内,观察两组移植瘤体积,Western bloting方法检测移植瘤组织中survivin基因的表达.结果 PAMAM-survivin-ASODN复合物的粒径小于脂质体-survivinASODN复合物的粒径(P〈0.01),而zeta电位高于PAMAM-survivin-ASODN复合物zeta电位(P<0.05),基因包封率两组无显著差异.PAMAM对DNA持续释放达14d.但脂质体复合物只持续5 d.PAMAM-survivin-ASODN复合物治疗组裸鼠移植瘤survivin蛋白表达低于脂质体-survivin-ASODN复合物组(P<0.05).PAMAM-survivin-ASODN复合物治疗组移植瘤体积低于脂质体-survivin-ASODN复合物组(P<0.05).结论 PAMAM能将survivin-ASODN高效递送到结直肠癌移植瘤细胞.降低survivin蛋白的表达,抑制移植瘤生长.     

不同阳离子脂质体介导基因转染效率的比较研究

目的评估不同脂质体介导基因转染条件及效率。方法以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，比较三种阳离子脂质体（lipen、lipotecfamine和Dosper）在不同的脂质体：DNA比例、不同细胞汇合度、不同转染时间及血清存在条件下转染情况。通过x-gal染色法观察不同脂质体的转染效率。结果三种阳离子脂质作的最优条件不同。Dosper转染效率最高，蓝染细胞达18％。结论通过条件优化可使脂质体转染效率提高。有望成为一种有效的非病毒基因转移方法应用于基因治疗。     

三种方法转染绿色荧光蛋白质粒的效果评价

目的比较常见的真核细胞转染技术,评价采用绿色荧光蛋白为报告基因来观察细胞转染效率高低的方法。方法 分别采用磷酸钙法、电穿孔法和脂质体法将pEGFP-C1质粒转染COS-7细胞,对每种方法的转染效率及对细胞的毒性进行评价。结果脂质体法的转染率为67%,电穿孔的转染率为43%,磷酸钙法的转染率为28%。脂质体法转染对细胞的毒性最小。结论采用绿色荧光蛋白为报告基因的真核细胞转染技术中,脂质体法是效率高、安全性大的方法。     

自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

目的: 评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性. 方法: 多聚胺阳离子脂质TC-Chol与中性磷脂DOPE以3: 1摩尔比,制备多聚胺阳离子脂质体,通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入HeLa细胞, Hep2细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达,通过MTT法,检测细胞存活分数,并以Lipofectamine2000为对照,评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性. 结果: 多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine 2000,但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体. 结论: 多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体,在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.     

聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递

 【目的】研究非病毒基因载体聚乙二醇（PEG）-聚乙烯亚胺（PEI）共聚物的组成对体外介导基因传递的影响。【方法】将含PEG不同分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物,与DNA形成复合物。考察带正电荷的PEI与带负电荷的DNA的相互作用,测定了PEG-PEI/DNA复合物的粒径和Zeta电位,及对Hela细胞的毒性和转染率。【结果】PEG侧链并未明显影响PEI与DNA形成复合物的能力;连接PEG5000能够明显降低复合物的粒径;复合物的Zeta电位随着PEG接枝量的增加而降低;细胞毒性不依赖于PEG的分子量的变化,而是取决于PEG的接枝量;共聚物PEG-PEI（2-25-1）被证实为较有效的介导体外基因传递的复合物。【结论】共聚物的结构组成对DNA复合物的理化性质、毒性和转染率都产生较大的影响。     

构建络合四氯化铂的PEG-PEI基因载体

目的:构建一种能有效抑制肿瘤,且具有一定转染效率的基因载体.方法:在二氯甲烷溶液中将PEG与PEI 600偶联,加入四氯化铂的乙醇溶液进行配位反应,生成PEG-PEI-Pt复合物.通过XRD、UV-VIS 和FT-IR对配位化合物进行结构表征.凝胶电泳阻滞实验测定PEG-PEI-Pt复合物对DNA的浓缩能力,MTT法测定其在Hela、B16、A293和COS-7细胞上的毒性,体外细胞转染实验测定其在A293和B16细胞上的转染率.结果:XRD、UV-VIS和FT-IR测定结果表明PEI 600与PEG的偶联和四氯化铂的配位成功.凝胶电泳组织实验表明PEG-PEI-Pt复合物在与DNA的质量比为0.4∶1时完全阻滞DNA的迁移;MTT结果表明四氯化铂的配位增加了复合物的毒性;体外转染结果表明该复合物的转染率比PEI 600高.结论:实验成功构建了络合四氯化铂的PEG-PEI基因新载体.     

阳离子脂质体包裹的IL-12基因对小鼠黑色素瘤的治疗作用

目的:观察体内注射阳离子脂质体包裹的小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因对小鼠黑色素细胞瘤的治疗作用.方法:C57BL/6小鼠在接种B16黑色素细胞后3、5、7、9 d分别给予lipofectin包裹的pCmIL-12质粒治疗,观察小鼠的肿瘤生长速度、生存期以及NK细胞活性的变化.结果:阳离子脂质体明显增强pCmIL-12质粒在体内的抗肿瘤生长活性,并延长荷瘤小鼠的存活期.此外,pCmIL-12/阳离子脂质体还能显著增强荷瘤小鼠的NK细胞活性.结论:阳离子脂质体介导的IL-12基因对小鼠黑色素瘤有明显的治疗效果.     

Efficient Gene Delivery to Myocardium with Ultrasound Targeted Microbubble Destruction and Polyethylenimine

The aim of present study was to evaluate the feasibility and efficiency of enhanced green fluorescent protein （EGFP） gene delivery to myocardium in vivo by ultrasound targeted microbubble destruction （UTMD） and polyethylenimine （PEI）. SonoVue/DNA and PEI/DNA/SonoVue complexes were prepared. Gel electrophoresis analysis was performed to determine the structural integrity of plasmid DNA or PEI/DNA after UTMD. Solutions of plasmid DNA, SonoVue/DNA, PEI/DNA complexes or PEI/DNA/SonoVue complexes were respectively transduced into BALB/c mice hearts by means of transthoracic ultrasound irradiation. Mice undergoing PBS injection, plasmid injection or PEI/DNA complexes injection without ultrasound irradiation served as controls. Gene expression in myocardium was detected 4 days after treatment. Cryosections and histological examinations were conducted. Electrophoresis gel assay showed no damage to DNA or PEI/DNA complexes after UTMD. When the heart was not exposed to ultrasound, the expression of EGFP was observed in the subendocardial myocardium obviously. The strongest expression was detected in the anterior wall of the left ventricle when the heart was exposed to ultrasound alone. Injection of PEI/DNA complexes and UTMD resulted in the highest transfection efficiency and the distributional difference of EGFP was not obvious. No tissue damage was seen histologically. In conclusion, a combination of UTMD and PEI was highly effective in transfecting mice hearts without causing any apparently adverse effect. It provides an alternative to current clinical gene therapy and opens a new concept of non-viral gene delivery for the treatment of cardiac disease.     

原代树突细胞基因递送系统的构建与应用

目前，安全有效的基因递送系统应用于原代树突细胞（dendritic cell，DC）转染尚未见报道，本研究针对原代DC构建基于脂质体的基因递送系统，优化了制备方法以提高原代DC的转染效率。通过共孵育法、乙醇注入法、鱼精蛋白复合法分别制备含不同阳离子脂质的脂质体/siRNA复合物，并以粒径、电位、对基因药物siRNA的包载能力、安全性、稳定性、DC的摄取效率和基因沉默效率为考察指标，评价并筛选出具有高转染效率的基因递送系统。与市售制剂Lipo2000相比，利用共孵育法制备的赖氨酸谷氨酸双油醇酯（OA2）递送系统的DC摄取效率提高约35%，基因沉默效率提高约10倍，且细胞存活率比Lipo2000提高20%，具有良好的DC基因转染效率和体外安全性。本研究为原代DC提供了一种安全有效、制备简单的基因递送载体平台，具有良好的应用前景。     

人成纤维细胞稳定转染的方法比较

目的采用3种不同的方法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞,从中寻找最佳的稳定转染的方法。方法分别采用阳离子聚合物转染、阳离子脂质体转染和电转染方法,将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达,流式细胞术测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果电转染有最高的瞬时转染效率(56.8%),稳定转染得到的阳性克隆最多,且从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间也最少(约20d);用阳离子聚合物瞬时转染率低(1.7%),稳定筛选同样可以得到阳性大克隆,但是数量很少且从细胞筛选到扩增至阳性大克隆所用的时间也最多(约30d);阳离子脂质体转染效果居中,瞬时转染率为39.9%,从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间约25d。结论用电转染法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞是最佳的转染方法。     

人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性.方法 全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性.脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达.结果 正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达.结论 采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达.     

脂质体包裹TGF-α反义脱氧寡核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖

目的 研究用转化生长因子α（TGF-α）反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对人大肠癌细胞株HR8348生长增殖的作用,探讨大肠癌治疗的新途径。方法 采用人工全盛的TGF-α反义及无关对照ODN经阳离子脂质体包裹后转染人大肠癌HR8348细胞,采用MTT法,[^3H]-TdR掺入实验。细胞周期分析,裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化。结果 经TGF-α反义ODN处理的HR8348细胞与对照组HR8348细胞相比,体外增殖速度减慢（细胞增殖抑制率达71%）,DNA合成受抑,裸鼠体内成瘤率下降（25%vs100%)。结论 TNF-α反义ODN能有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖,可用于实验性肿瘤基因治疗研究。     

阳离子脂法介导质粒转染大鼠骨髓基质干细胞用于基因修饰的细胞移植治疗

目的探讨阳离子脂转染方法在骨髓基质干细胞(BMSC)基因转染中的应用.方法通过梯度试验确定相对最佳的转染条件并测定LipofectamineTM2000(LP2000)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率;分析细胞周期对导入基因表达的影响;以流式细胞仪测定转基因BMSC的EGFP表达强度和阳性比例随时间的变化;将EGFP基因转染的大鼠BMSC注射法移植入同源大鼠心肌内,以逆转录PCR法检测心肌组织内EGFP基因的转录,荧光显微镜法检测EGFP阳性的BMSC.结果在不同转染条件下(DNA浓度、DNA:LP2000),LP2000介导EGFP基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率不同;通过阳离子脂法导入基因的表达效果受细胞周期制约;细胞移植后,能在大鼠心肌组织中检测到EGFP基因的转录以及表达EGFP基因的BMSC.结论阳离子脂可以作为基因修饰的细胞移植治疗的有效载体.为了提高基因转染的瞬时效率和基因的表达效率,降低毒性、满足转基因细胞移植的要求,尚需进一步的研究.     

两种方法介导外源基因稳定转染大鼠肝癌细胞株的有效性及其对细胞生长影响的比较

目的探讨磷酸钙共沉淀法与阳离子脂质体试剂形成复合物法两种基因转染方法构建大鼠肝癌细胞克隆株的有效性及对生长影响的比较。方法将携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1分别用脂质体形成复合物法、磷酸钙共沉淀法导入大鼠肝癌CBRH-7919细胞,G418筛选基因稳定转染阳性单细胞克隆株。RT-PCR法检测EGFP基因在细胞中的表达。结果两种方法转染CBRH-7919细胞24h后,倒置相差荧光显微镜下观察均见绿色荧光。G418加压筛选14d后均形成阳性克隆,倒置相差荧光显微镜下可见绿色荧光,脂质体法的细胞克隆荧光强度强于磷酸钙。阳性克隆株经RT-PCR法检测,750bp于450bp处均有特异性条带。结论两种细胞转染方法均可使增强型绿色荧光蛋白基因稳定转染CBRH-7919,为今后探讨外源目的基因对靶细胞生长特性的影响奠定前期实验基础。     

Inhibition of the activation and collagen production of cultured rat hepatic stellate cells by antisense oligonucleotides against transforming growth factor-beta 1 is enhanced by cationic liposome delivery]

In order to investigate the inhibition of the activation and collagen production of cultured rat hepatic stellate cells (HSC) by antisense oligonucleotides (ASON) against TGF beta 1 after cationic liposome (lipofectin) delivery, the authors synthesized a 20-mer phosphorothioate antisense oligonucleotide of TGF beta 1 mRNA, and its sense of missense oligonucleotides, and then treated the HSC with cationic liposome/oligonucleotide complexes respectively. The cellular uptake of 32P-labelled oligonucleotides was determined by liquid scintillation counting, and HSC activation was assessed by the expression of alpha-smooth muscle actin(alpha-SMA). The cellular uptake of lipofectin/32P-ASON complex was approximately five-fold higher than that of 32P-ASON alone. Cationic liposome (lipofectin) delivery significantly increased the inhibition of HSCs activation by ASON, while compared with the use of naked TGF beta 1 ASON at the same concentration (at a final concentration of 1 mumol/L, P < 0.05). However, these effects were not observed in lipofectin alone, liposome/sense or missense oligos complexes at the same concentration. The oligonucleotide or lipofectin/oligos complexes had no cytotoxicity to rat HSCs in culture. These findings suggest that cationic liposome is an effective vehicle to improve the delivery of ASON to rat HSCs in culture, and the cationic liposome/TGF beta 1 ASON complex may be useful for the treatment of hepatic fibrosis.     

阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。