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相似文献
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1.
目的 鉴定并分析先天性白内障患者和正常人晶状体之间蛋白质表达的差异.方法 取10例(20眼)先天性白内障晶状体及8例(8眼)正常透明晶状体,提取晶状体核中的水溶性蛋白行二维电泳及考马斯亮蓝凝胶染色后,用Image Master 2D Platinum 5.0软件对获得的蛋白图谱进行分析,再利用MALDI-TOF-MS分析及数据库搜索对差异表达的蛋白质点进行鉴定.ELISA法检测差异蛋白的含量.结果 二维电泳结果显示,先天性白内障和正常晶状体蛋白均分布在相对分子质量为14 400 ~97 400、pI5~9区域内;高丰度蛋白质斑点分布在相对分子质量20000 ~ 31000、pI 6 ~8区域内.正常透明晶状体核水溶性蛋白二维电泳图识别出34个蛋白质斑点,先天性白内障蛋白二维电泳图识别出31个点有4个.对选取的蛋白质差异斑点进行MALDI-TOF-MS分析,经数据库检索后鉴定出4种蛋白质,分别为βA3晶状体蛋白、βB1晶状体蛋白、截断的βB1晶状体蛋白和αB晶状体蛋白.ELISA结果显示,正常晶状体βA3、αB和βB1晶状体蛋白质量浓度分别为(2.20±0.15)g·L-1、(0.85±0.08)g·L-1、(0.72±0.05)g·L-1,而先天性白内障βA3、αB和βB1晶状体蛋白质量浓度为(1.60±0.09)g·L-1、(1.02±0.09)g·L-1、(0.59±0.07)g·L-1.先天性白内障αB晶状体蛋白较正常对照含量上调,βA3和βB1晶状体蛋白含量下调.结论 αB晶状体蛋白上调、βA3和βB1晶状体蛋白含量下调可能与先天性白内障的发病相关.  相似文献   

2.
二维电泳联合质谱技术鉴定水溶性晶状体蛋白   总被引:3,自引:0,他引:3  
目的 应用二维电泳结合质谱分析分离鉴定水溶性晶状体蛋白及观察乙酰化修饰后的γ晶状体蛋白的变化。方法 分别从小鼠及小牛晶状体获得水溶性晶状体蛋白质,并经凝胶过滤层析分离出牛γ晶状体蛋白,进行体外乙酰化;将各晶状体蛋白样品进行二维电泳(2DE),经染色,照相和图像分析,进一步用胰蛋白酶消化,基质辅助激光解吸电离质谱分析鉴定各晶状体蛋白。结果 在2DE电泳图谱上,小鼠水溶性晶状体蛋白有20余个斑点,各晶状体蛋白的相对分子质量多位于18000-30000D范围,主要已鉴定的α,β和γ晶状体蛋白,分别占19%,43%和36%,来自小牛的γ晶状体蛋白主要有5个斑点,其中3个大的点(γB,γD和γs)占总量的90%,体外乙酰化后,带负电荷的斑点数明显增多。结论 2DE结合生物质谱技术是分离鉴定晶状体蛋白的有效手段。并能对其修饰进行分析研究。  相似文献   

3.
目的应用二维电泳和质谱鉴定技术对糖尿病性白内障进行蛋白质组学研究,探讨蛋白质组学在糖尿病性白内障发病机制中的价值。方法取8例(8眼)1型糖尿病并发白内障晶状体组织,提取晶状体组织中蛋白质进行二维电泳,凝胶染色后,通过Gel Doc2000凝胶成像仪采集图像,利用PDQuest8.0凝胶分析软件对图像进行分析。使用基质辅助激光分析离子飞行时间质谱仪(MALAI-TOF-MS)对蛋白斑点进行鉴定。结果二维电泳图谱能检测到35~40个左右的蛋白斑点,大部分高丰度蛋白斑点相对分子质量处于(20~31)×103范围内,小部分低丰度蛋白斑点相对分子质量处于(35~45)×103范围内,等电点在5~9之间。利用MASCOT软件查询NCBInr数据库对2个蛋白斑点的肽质量指纹图谱进行了鉴定,分别为α-B晶状体蛋白和β-B1晶状体蛋白。结论二维电泳和质谱鉴定能够较好地分离和鉴定糖尿病性白内障晶状体蛋白质,为研究糖尿病性白内障形成机制提供了新的方法和途径。  相似文献   

4.
曾艳枫  苏胜  刘平 《眼科新进展》2013,33(7):610-613
目的 鉴定年龄相关性核性白内障(age-related nuclear cataract,ARNC)和正常晶状体核蛋白质组学差异.方法 用强解聚试剂分别溶解7只不同程度ARNC晶状体核和7只正常晶状体核,提取总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度.通过双向荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference in-gel electrophoresis,2-D DIGE)、Decyder 6.5软件分析电泳图谱,寻找差异蛋白质点.差异蛋白质点随后用激光辅助解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight,MALDI-TOF)质谱仪鉴定.结果 2-D DIGE结果显示,和正常晶状体核样品相比,39个点的蛋白含量在ARNC样品中显著减少(P<0.05).MALDI-TOF质谱成功鉴定其中36个蛋白质点,它们分属于9个不同的蛋白质,其中6个蛋白(αA-、βA3-、βA4-、βB1-、γD-晶状体蛋白和一个来自CRYGS家族的未知蛋白DKFZp434A0627)的含量随着ARNC程度的增加而逐渐减少;其他3种蛋白(αB-晶状体蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和视黄醛脱氢酶1)未呈现这种递减趋势.结论 3-磷酸甘油醛脱氢酶、视黄醛脱氢酶1以及某些晶状体蛋白的减少可能参与ARNC的形成.  相似文献   

5.
背景 目前糖尿病已成为影响人类健康的主要疾病之一,糖尿病性白内障为糖尿病患者的常见并发症之一,进行糖尿病性白内障晶状体中的蛋白质组学研究对该病的防治具有重要意义. 目的 研究糖尿病性白内障和年龄相关性白内障患者晶状体蛋白质组学的差异,探讨糖尿病性白内障的发病机制.方法 手术采集诊断明确的糖尿病性白内障患者8例8眼及年龄相关性白内障患者12例12眼的晶状体,裂解离心提取蛋白,采用固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳法对糖尿病性白内障和年龄相关性白内障患者的晶状体蛋白质进行分离,分析电泳图像的差异,使用基质辅助激光解析离子飞行时间质谱仪( MALDI-TOF-MS)测定蛋白质斑点的肽质量指纹谱,结合蛋白质数据库检索,确定蛋白质种类. 结果 IPG双向凝胶电泳显示,糖尿病性白内障和年龄相关性白内障的晶状体蛋白质相似处在于大部分都分布在等电点( PI) pH值5~9、相对分子质量14000 ~97000的区域内;而高丰度晶状体蛋白质的相对分子质量为20000 ~ 31000.分析软件检测出3个差异的蛋白质点,经质谱鉴定得到其中2个高丰度晶状体蛋白质的种类为αB晶状体蛋白和βB1晶状体蛋白.结论 双向电泳联合质谱鉴定可有效分离晶状体蛋白质,糖尿病性白内障与年龄相关性白内障晶状体蛋白质组学之间的差异表明,αB晶状体蛋白和βB1晶状体蛋白加速了糖尿病性白内障的发展.  相似文献   

6.
目的:比较不同蛋白质提取方法在白内障晶状体蛋白提取中的效果,寻找适合白内障晶状体蛋白质组学研究的蛋白质提取方法。方法:采用裂解液溶解白内障晶状体组织样本,超声裂解离心后分别采用三氯乙酸/丙酮法和ReadyPrep 2D Cleanup Kit对晶状体蛋白样本进行提取、二维电泳,并对电泳后凝胶进行染色、图像采集和图像分析。结果:在2-DE图谱上蛋白斑点的相对分子量在14~97.4kDa之间,等电点在5~9之间,其中高丰度蛋白相对分子量处于20~31kDa范围内,低丰度蛋白斑点相对分子量处于31~43kDa范围内。经TCA/丙酮沉淀法处理的含有透明质酸钠白内障晶状体蛋白样本,二维电泳凝胶图谱背景较清晰,蛋白斑点较清楚,共检测到35~40个左右的蛋白斑点。结论:在人白内障晶状体蛋白质组学研究中,TCA/丙酮法具有较好的纯化效果,为人晶状体组织蛋白质组学的质谱分析研究提供了可靠的二维电泳凝胶图谱。  相似文献   

7.
目的鉴定早期糖基化晶状体蛋白质。方法新鲜牛晶状体匀浆与[^14C]-果糖孵育24h,凝胶过滤层析(Sephacryl S-300HR)分离水溶性蛋白质,并进一步分离脱氢酶;采用亲合层析(Affi-gel601)ff离糖基化蛋白质;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定富含放射活性组份的性质。结果α、β-晶状体蛋白和某些脱氢酶为早期糖基化蛋白质。再次分离表明αA2和βA3-晶状体蛋白为首攻糖基化蛋白质;亲合层析结果显示分子质量约为20kin的可能为α和γ-晶状体蛋白,36kin的多肽可能为苹果酸盐脱氢酶或乳酸脱氢酶,这些均为早期糖基化蛋白质。结论αA2、βA3、γ-晶状体蛋白和某些脱氢酶是最容易被糖基化的晶状体蛋白质。糖基化导致晶状体蛋白质的结构发生改变和蛋白质凝聚。早期糖基化诱导酶(如脱氢酶)的失活,可能参与白内障的形成。[眼科新进展21105;25(5):404—407]  相似文献   

8.
陈辉  朱思泉  谷峰 《眼科研究》2007,25(3):182-185
目的 应用双向电泳(2-DE)技术分析先天性全白内障晶状体和正常透明晶状体蛋白质组成的差异.方法 采用固相pH梯度(IPG)等电聚焦2-DE技术分离全白内障组和正常对照组的晶状体蛋白后,比较两组蛋白质的组成差异.结果 人眼晶状体蛋白的主要分布在等电点(pI)5~9,相对分子质量14 000~90 000的范围内,高丰度的蛋白主要集中在pI 6~8,相对分子质量14 000~30 000之间.在pI 5.0~7.25,相对分子质量50 000~80 000的高分子量区间全白内障组具有较多的蛋白表达,在pI 6.7~7.7,相对分子质量19 000~29 000间的区域,全白内障组的部分正常蛋白点消失,在pI 7.1~7.6,相对分子质量15 000~17 000区间存在一些新的小分子量的蛋白点.结论 应用2-DE技术能够较好地分离人眼晶状体蛋白,全白内障组高分子量的蛋白质成分明显多于正常对照组,全白内障组的部分正常晶状体蛋白发生缺失,出现新的小分子量的蛋白成分.  相似文献   

9.
目的 鉴定分析在年龄相关性核性白内障(age-related nuclear cataract,ARNC)晶状体核中发现的不可逆聚集体的蛋白质组成.方法 用强解聚试剂和促溶剂溶解ARNC晶状体核(8例)和年龄匹配的正常晶状体核(8例),提取总蛋白,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,在ARNC晶状体样品中发现的相对分子质量高的聚集体进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定分析,确定聚集体的组成成分,并根据Mascot搜索数据估算各成分的相对含量.结果 SDS-PAGE结果显示,与正常晶状体核相比,ARNC样品在相对分子质量≤20 000处蛋白含量显著减少(均为P<0.05),但在相对分子质量高(>200 000)处蛋白质含量显著增加(均为P<0.01).在ARNC晶状体内存在不可逆的相对分子质量高的聚集体.LC-MS/MS分析显示,这些聚集体主要来源于各种晶状体蛋白,同时还包括Filensin、Phakinin和碳酰还原酶1.在所有组分中αA-晶状体蛋白含量最高(19.1%).αA-、αB-、γD-晶状体蛋白和DKFZp434A0627比其他晶状体蛋白更容易聚集.结论 晶状体蛋白,尤其是αA-晶状体蛋白在白内障产生和发展过程中发生不可逆的聚集,细胞骨架蛋白Filensin和Phakinin以及碳酰还原酶1可能参与和加速这一过程.  相似文献   

10.
张春巍  刘平 《眼科新进展》2007,27(4):254-257
目的 运用双向电泳和基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)的方法,鉴定年龄相关性白内障和正常晶状体之间差异表达的蛋白质.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离16例年龄相关性白内障和正常晶状体之间的总蛋白质,建立二维电泳图谱,再利用MALDI-TOF-MS分析及数据库搜索相结合对差异表达的蛋白质点进行鉴定.结果 双向电泳胶图显示年龄相关性白内障和正常晶状体共有84个差异点,其中52个上调表达,32个下调表达.有和无的差异表达点10个,相差3倍以上差异表达点10个.利用MALDI-TOF-MS对差异表达的15个蛋白质点进行肽指纹图谱分析,经数据库检索后鉴定出5个蛋白质.结论 年龄相关性白内障和正常晶状体之间蛋白表达存在差异,蛋白质组的分析结果为年龄相关性白内障的基础研究提供依据和新实验方法.  相似文献   

11.
兔晶状体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究   总被引:10,自引:2,他引:8  
Liu YZ  Zhang M  Liu XL  Huang Q  Liu XH  Xia ZX  Wu MX 《中华眼科杂志》2004,40(2):113-117
目的探讨双向电泳和质谱鉴定在晶状体蛋白质组特性研究中的价值,为白内障的防治提供新的有效途径。方法采用固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳方法对兔龄为3个月的新西兰兔透明晶状体蛋白质进行分离,使用ImageMaster 2D Elite3.01图像分析软件分析电泳图像,使用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪对主要的高丰度晶状体蛋白质进行鉴定。结果双向电泳图谱显示,在250μg兔晶状体中蛋白质分布在等电点(PI)为pH值5~9、相对分子质量为14000~94000的区域内;而高丰度晶状体蛋白质的相对分子质量为14000~40000。图像分析软件定量检出180个蛋白质斑点的近似PI、相对分子质量及蛋白质相对含量,质谱鉴定得到其中16个高丰度晶状体蛋白质的种类。结论双向电泳和质谱鉴定可有效分离和分析晶状体蛋白质组的特性,为分析白内障形成过程中蛋白质的表达改变提供了新的方法和途径,为白内障的防治带来了新的前景。  相似文献   

12.
Plasma membrane with its associated extrinsic proteins was isolated from normal and cataractous rat lenses by centrifugation of the total water insoluble fraction from homogenized lenses on a discontinuous sucrose gradient. Membrane, which we call "native" membrane, was recovered mainly from the 25/45% sucrose interface. Development of the experimental U18666A cataract resulted in plasma membrane shifting to higher density (the 50/55% sucrose fraction) and great increases in the urea soluble protein content of the lens. At early stages of cataract development, most of the increased urea soluble protein was membrane associated, presumably as extrinsic protein. With advancing cataract, most of the urea soluble protein appeared in an essentially membrane-free pellet fraction. The urea soluble protein associated with the cataract membrane was shown by combined IEF, SDS-PAGE, Western blotting, amino acid compositional analysis and protein sequence determinations to be mainly composed of modified alpha- and beta-crystallins. Alpha A-crystallin truncated by not more than 27 residues from the carboxyl terminus plus beta b1 crystallin truncated by 49 residues from the amino terminus were conclusively identified. In addition to beta b1, a population of six alpha-crystallin derived polypeptides were specifically enriched in the cataract membrane fraction. Four of these six alpha-crystallins appear to be truncated from their carboxyl terminus, a modification which should have increased their hydrophobicity. The pellet fraction, which accumulated in the lens nucleus as the cataract advanced, was enriched in urea soluble gamma-crystallin derived polypeptides. We suggest that protein insolubilization in this experimental cataract involves the selective and tight association of principally modified alpha-crystallins to the fiber cell plasma membrane.  相似文献   

13.
The composition and origin of the urea soluble polypeptides which accumulate in the U18666A rat-cataract were studied. Chromatography on Sephacryl S-200 in 7.2 M urea separated the USP into 19-20 and 22-26 kDa enriched fractions. The polypeptide composition of these fractions was probed by immunoblotting of IEF and 2-D electrophoresis gels. The cataract USP largely focused at pHs comparable to alpha- and beta-crystallins. Immunoblotting of 2-D gels showed the USP to be composed predominantly of alpha- and beta-derived crystallins; little gamma-polypeptide was detected in the gels. Some of the insoluble alpha-crystallin appeared to be degraded. Changes in the lens WSP which accompanied the increase in USP were also measured. WSP decreased more than USP increased. Decreases in soluble high molecular weight proteins (alpha- plus beta-crystallins) and medium molecular weight proteins (beta-crystallins) were calculated which together could entirely account for the increased USP. An unexpected decrease in the lens soluble low molecular weight proteins (gamma-crystallins) appeared largely due to the selective leakage of gammas from the lens. The protein content of the ocular humors from eyes with cataracts increased 4 fold and contained polypeptides that focused on IEF like gamma-light crystallin and reacted with the gamma-crystallin antiserum. The cause of the protein insolubilization in the U18666A cataract is unknown but could be partially due to increased aggregation of alpha-crystallins secondary to loss of gamma-crystallins from the lens.  相似文献   

14.
目的研究核因子κB(NF-κB)在正常人、年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜上皮细胞中表达的差异,探讨NF-κB在年龄相关性白内障发病机制中的作用。方法收集白内障术中60例60眼年龄相关性白内障的前囊膜组织(白内障组),选取正常供体5例10眼的透明晶状体前囊膜组织作为正常对照组。取白内障组30眼标本和正常对照组5眼标本用于免疫组织化学法检测NF-κBp65蛋白在晶状体前囊膜上皮细胞中的表达;另外白内障组30例标本及正常对照组的5例标本采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法检测NF-κBp65mRNA在晶状体前囊膜上皮细胞中的表达。结果正常晶状体前囊膜上皮细胞细胞质和细胞核中可见NF-κBp65蛋白的弱阳性表达,以细胞质为主;年龄相关性白内障晶状体前囊膜上皮细胞的细胞质和细胞核中NF-κBp65蛋白呈强阳性表达。白内障组NF-κBp65吸光度(A)值为0.1658±0.022,正常对照组为0.2889±0.043,差异有统计学意义(t=6.2109,P〈0.05)。白内障组NF-κBp65mRNA表达量为1.454±0.081,正常对照组为0.951±0.075,差异有统计学意义(t=12.9683,P〈0.05)。结论 NF-κB表达水平的升高与年龄相关性白内障的发病密切相关,其表达异常可能参与年龄相关性白内障的发生发展。  相似文献   

15.
郑广瑛  梁圆圆  王倩 《眼科研究》2010,28(4):351-355
目的探讨年龄相关性白内障晶状体上皮细胞(LECs)中Smac、caspase-3的表达和LECs超微结构变化及死亡方式。方法收集皮质性(30例)、核性(24例)、后囊下性(28例)年龄相关性白内障患者晶状体前囊片,以12例高度近视摘出的透明晶状体的晶状体前囊片为对照,应用免疫组织化学链酶菌抗生素蛋白-过氧化物酶法检测Smac、caspase-3蛋白在LECs中的表达,并采用透射电镜观察LECs超微结构的改变及死亡方式。结果Smac、caspase-3蛋白在年龄相关性白内障组LECs中的阳性表达率分别为81.71%、78.05%,与透明晶状体组比较染色阳性率及染色强度差异均有统计学意义(P〈0.05)。3种类型年龄相关性白内障透射电镜下均可见LECs多表现为肿胀,线粒体嵴缺失、空泡变、髓样化,粗面内质网扩张、颗粒融合和脱颗粒现象,仅1例核性白内障中可见到核膜皱缩向外呈锐角凸起,部分双层核膜融合,模糊不清,细胞核内染色质浓缩,未见凋亡小体。结论Smac、caspase-3蛋白可能参与了年龄相关性白内障的形成。年龄相关性白内障LECs存在凋亡、胀亡等多种细胞死亡方式,细胞凋亡与细胞胀亡的发生可能存在部分分子机制的重叠。LECs超微结构的改变表明线粒体形态改变和功能异常在年龄相关性白内障发生中起重要作用。  相似文献   

16.
In a series of 50 consecutive adult patients (24 men and 26 women) we studied aging-related cataract by means of comprehensive presurgical examination of the patient, the eyes, and the cataractous lens; cataract sample collection from predetermined sites during surgery; biochemical analyses with high-performance liquid chromatography of each individual lens sample; and computer-assisted biostatistical data analysis. Compared with normal values established on clear human lenses obtained from a donor eye program, the ratios of 23,000 (23K) crystallin to total beta, gamma, and low molecular weight soluble proteins were statistically significantly lower in the anterior axial lens cortex (P less than .001) and in the lens nucleus (P less than .001). Increased grades of cortex opacification and nucleus opacification were generally associated with progressively decreased 23K crystallin ratios. In this series of patients with diverse cataract-associated systemic diseases, family histories, ophthalmic disorders, and drug-use patterns, decreased 23K crystallin ratios were a sensitive marker for aging-related cataract. Similar biochemical abnormalities in patients with multiple cataract-associated factors may have important clinical implications.  相似文献   

17.
Using the techniques of high performance liquid chromatography (HPLC), gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS), and immunoblotting, we have analyzed the age-related changes in soluble crystallins of the human lens. A 3 mm core along the optical axis of each lens was frozen-sectioned and the sections were biochemically analyzed for distribution and quantity of the various soluble protein species. Both cortical and nuclear samples show a monotonic decrease in the concentration of the 19 000 and 21 000 MW proteins with age. We find that these proteins behave anomalously on SDS-polyacrylamide gels, running near the top of the gel when the samples are not boiled before loading; this permitted us to observe the gradual, age-related loss of these bands from the gels of both nuclear and cortical samples. The high molecular weight, or TSK-3000 void volume, fraction (greater than 350,000) of the cortex contained alpha crystallin at all ages. However, in the nucleus, while this fraction is primarily composed of alpha crystallin early in life (i.e. before 15 years of age), there is a gradual incorporation of other crystallins into the void volume. This change in the composition of the high-molecular-weight, soluble protein fraction is reflected in: a change in the subunit mobility on SDS-polyacrylamide gels; reactivity of the fraction to crystallin antibodies, i.e. in the young nucleus there is reactivity to anti-alpha crystallin only, with a gradual increase in reactivity to anti-beta and anti-gamma crystallins. The void volume fraction of the nucleus persists as a major component of the soluble protein pool until 42-44 years of age, at which time the proportion of the total soluble protein represented by this void volume fraction decreases precipitously. These changes in the soluble protein profile are discussed in terms of their potential influence on the functioning of the lens.  相似文献   

18.
目的调查近4年来洛阳市白内障手术患者中硬核白内障者比率变化。方法对2006年1月至2009年6月期间接受手术治疗的2640例(2640只眼)老年性白内障患者,根据LOCSⅢ(Lens Opacities ClassificationSystem III)白内障核硬度分级标准,统计每例晶状体核硬度,对比分析4年来核硬度分布的变化趋势。结果 2006年间患者546例,年龄57~89岁,平均(70.6±7.6)岁,Ⅴ级核96例(17.6%);2007年间患者628例,年龄51~92岁,平均(70.0±7.6)岁,Ⅴ级核87例(13.9%);2008年间患者892例,年龄57~85岁,平均(69.0±6.6)岁,Ⅴ级核90例(10.1%);2009年间患者574例,年龄54~90岁,平均(68.5±6.4)岁,Ⅴ级核48例(8.4%)。各年份硬核(Ⅴ级核)白内障患者比例呈现逐渐减少趋势,结果具统计学意义(P=0.000)。结论随着我国卫生事业的发展,政府倡导的大规模白内障复明行动,白内障手术率逐渐增加,硬核白内障患者在减少,对于我们以后的白内障防治工作具有指导意义。  相似文献   

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