肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价

目的:肺炎链球菌溶菌酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase,LytA)作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价.方法:PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增LytA基因序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-LytA,免疫印迹(western-blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达.与前期构建的肺炎链球菌表画蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)N端序列基因构建的质粒pcDNA3.1-PspA'核酸疫苗联合或单独肌肉注射免疫BABL/c小鼠,检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,并观察免疫小鼠肺炎链球菌D39腹腔攻击21d生存情况.结果:ELISA检测发现3组(pcDNA3.1-LytA组,pcDNA3.1-PspA'组,pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组)实验组小鼠特异性IgG水平较空质粒对照组显著升高(P＜0.001),pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组小鼠抗LytA特异性抗体IgG水平较pcDNA3.1-LytA组明显升高(P＜0.01),但是与pcDNA3.1-PspA'组比较抗PspA特异性抗体IgG水平无显著差异(P＞0.05).小鼠攻击试验提示pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组小鼠中位生存时间较pcDNA3.1-LytA组及空质粒对照组显著延长(P＜0.01),但与pcDNA3.1-PspA'组比较中位生存时间无显著差异(P＞0.05),生存曲线相似.结论:LytA联合PspA'的肺炎链球菌多价核酸疫苗免疫效能并不优于单一抗原PspA'的肺炎链球菌核酸疫苗,LytA作为肺炎链球菌多价核酸疫苗的优势候选抗原组分之一有待进一步研究.     

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。     

肺炎链球菌毒力蛋白DNA疫苗优势抗原组合筛选及鉴定

目的 探讨肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原联合免疫的优势抗原组合方式.方法 分子克隆肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)N端及肺炎链球菌溶血素(Ply)基因序列,构建重组质粒pcDNA3.1-PspA'和pcDNA3.1-PBD(PBD为Ply 点突变减毒体),免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达(包括前期工作中构建的重组质粒pcDNA3.1-PsaA).将3种重组基因疫苗以不同方式组合肌肉注射免疫150只BALB/c小鼠(B组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA',C组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PBD,D组:pcDNA3.1-PspA'+pcDNA3.1-PBD,E组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA'+pcDNA3.1-PBD),检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39携带改变和D39腹腔攻击小鼠21 d生存情况.结果 成功构建3种重组真核表达载体,ELISA检测结果显示B组小鼠血清特异性IgG抗体水平与E组相似(P>0.05),均明显高于A、C、D组[A组:对照空质粒组pcDNA3.1(+)]小鼠(P<0.01);免疫小鼠鼻咽部D39携带菌落计数提示B组小鼠相似于E组小鼠(P>0.05),并明显少于C、D组和阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01),并且D39腹腔攻击小鼠21 d生存时间分析亦提示其中位生存时间明显长于C组及阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01).结论 PspA'联合PsaA的抗原组合方式具有高效的协同保护效能,可作为肺炎链球菌DNA疫苗的优势候选抗原组合.     

PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究

目的:获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值. 方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET-32(a)内,酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定,镍柱纯化并透析除盐. 用重组蛋白免疫动物,观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用. 结果:DNA序列与GenBank中的数据相符,所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA,其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用. 结论:重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染,该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.     

肺炎链球菌黏附素A基因疫苗的构建及对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用

目的 探讨肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)基因疫苗的免疫原性及其对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用.方法 PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增PsaA基因,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-PsaA,脂质体法转染BHK-21细胞,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在BHK-21细胞中的转录和表达.应用PsaA基因疫苗肌肉注射免疫BABL/c小鼠,ELISA检测脾细胞上清IFN-γ分泌,特异性抗体IgG水平及其亚型分布(IgG1/IgG2a).利用BABL/c小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带模型,鼻咽部灌洗液菌落计数观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带改变.结果 RT-PCR及Western blot显示重组PsaA蛋白在BHK-21细胞瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清高水平的IFN-γ及特异性IgG抗体(IsG1/IgG2a＜1),小鼠攻击实验证明PsaA基因疫苗免疫组小鼠D39携带菌落计数明显少于对照组(P＜0.01).结论 肺炎链球菌表面毒力蛋白PsaA基因疫苗免疫小鼠激发了抗原特异性的细胞及体液免疫反应,显著减少了小鼠鼻咽部肺炎链球菌的携带,为肺炎链球菌DNA疫苗理想侯选抗原之一.     

肺炎链球菌疫苗候选抗原PspA异家族亚类间交叉反应评价

目的：观察肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原肺炎链球菌表面蛋白A（PspA）在临床肺炎链球菌自然感染情况下家族分布及异家族亚类间抗原抗体交叉反应情况,探索肺炎链球菌PspA核酸疫苗的抗原组成形式。方法：采集我院42例临床侵入性肺炎链球菌感染菌株,及患者恢复期（第21±3天）的血清样本,同期确诊为非感染性疾病患者36例血清样本为对照组,细菌基因组特异性PCR及测序比对鉴定PspA家族分布,酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应情况。结果：42株肺炎链球菌中以PspA家族Faml-Clade2（31.0％）和Fam2-Clade3（47.6％）的菌株为优势分布,所有侵入性肺炎链球菌感染患者血清中针对PspA-Faml特异性抗体水平高于针对PspA-Fam2的特异性抗体水平,血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应发现异家族各亚类间交叉反应弱,但同家族亚类间显著交叉反应以Faml-Cladel和Fam2-Clade3为优势。结论：肺炎链球菌PspA核酸疫苗靶抗原的组成时应同时包括产生高保护性抗体效价和强交叉反应的Faml及Fam2的优势Clade亚类成分才能有效针对广泛的临床致病肺炎链球菌菌株感染的保护。     

肺炎链球菌表面粘附素A蛋白抗原表位的预测筛选及确定

[目的]确定肺炎链球菌表面粘附素A(PsaA)蛋白抗原的B细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞表位.[方法]通过生物信息学方法预测肺炎链球菌PsaA蛋白分子小鼠B细胞线性表位、MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)及MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)并人工合成相应肽段;克隆重组质粒BL21/pET/PsaA并得到纯化的rPsaA蛋白用以免疫小鼠;分离每只免疫组和对照组小鼠的血清分别与人工合成的候选B细胞表位肽段进行间接ELISA检测,筛选B细胞表位;分离小鼠脾及淋巴结细胞并分别与人工合成的T细胞候选表位肽段体外共培养,取上清进行双夹心ELISA检测IFN-γ的量进行初步筛选.用初筛到的表位多肽刺激小鼠的脾及淋巴结细胞并进行细胞内染色及细胞流式检测,确定PsaA蛋白分子T细胞表位.[结果]分析PsaA蛋白分子的B细胞表位及MHC-Ⅰ结合肽、MHC-Ⅱ结合肽;得到候选B细胞表位肽10条,MHC-Ⅰ结合肽21条,MHC-Ⅱ结合肽7条,并进行了人工合成.利用分子生物学技术获得了rPsaA蛋白并成功免疫了小鼠.间接ELISA结果显示:肽段PB2、PB6,PB7与rPsaA免疫小鼠的血清发生反应,其OD450nm读数比相应的阴性对照小鼠显著升高;双夹心ELISA结果初步提示:肽段PⅠ 10、PⅠ 14、PⅠ 17、PⅠ 18、PⅠ21以及肽段PⅡ2、PⅡ5、PⅡ6刺激免疫小鼠细胞产生的IFN-γ量比相应的对照小鼠显著升高.细胞流式结果进一步确定:经肽段PⅡ2、PⅡ5刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性细胞百分比较对照小鼠细胞显著升高;经肽段PⅠ 14、PⅠ 17、PⅠ21刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性细胞的百分比较对照小鼠细胞显著升高.[结论]确定了肺炎链球菌PsaA蛋白分子的3个B细胞线性表位;2个CD4 T细胞表位;3个CD8 T细胞表位.     

幼儿及儿童使用的肺炎链球菌疫苗研究进展

肺炎链球菌是导致肺炎的主要致病菌,而儿童又常常是最大的受害者。接种肺炎链球菌联合疫苗（PCV）是有效的防治方法。接种PCV对儿童抗侵入性疾病的能力、肺炎链球菌载菌量、急性中耳炎和抗微生物抗药性有一定的影响,接种疫苗可在一定程度上防止疾病的传播。但非疫苗血清型病菌更易在接种疫苗者中发现,以及疫苗价格高的问题,是影响PCV广泛使用的原因。     

评价肺炎链球菌疫苗免疫效果的功能性抗体检测方法的建立

目的建立肺炎球菌疫苗免疫效果评价的功能性抗体滴度检测方法。方法参考美国阿拉巴马大学的多重调理吞噬实验（MOPA）方法,构建并鉴定HL-60效应细胞库、肺炎球菌工作菌种库和补体;在此基础上对5份血清样本进行调理吞噬活性检测。结果 HL-60细胞分化后表面标志表达量CD35为71.78%,CD71为10.97%,活细胞比例为72.96%。13个血清型的肺炎链球菌工作菌种的冻存复活率均高于90%;抗生素抗性与敏感性与预期结果一致;工作稀释度均≥1000。补体的非特异性杀菌率均≤70%。血清样本的杀菌曲线均为标准的S型,平行孔间的差异不超过3倍。结论效应细胞、工作菌种、补体及血清样本的检测结果均符合阿拉巴马大学参考方法的标准要求,成功建立了基于MOPA的功能性抗体检测方法。     

变形链球菌表面蛋白和葡糖基转移酶基因疫苗对唾液变形链球菌和牙菌斑的影响

目的　了解变形链球菌表面蛋白和葡糖基转移酶基因疫苗单独及联合免疫对定菌鼠唾液变链菌和牙面菌斑的影响。方法　 2 8d龄 Wistar大鼠 3 6只 ,随机分为 pc DNA3 - pac组、pc DNA3 - gtf B组、pc DNA3 - pac联合pc DNA 3 - gtf B组、变形链球菌灭活全菌组、pc DNA3空载体组和 PBS液组 ,进行三次双侧颌下腺腺周注射免疫 ,建立定菌鼠模型 ,作诱龋实验 3个月。唾液变链菌计数和菌斑计分。结果　唾液变链菌菌落计数和牙面菌斑计分在 pc D-NA3与 PBS组最高 ,其次为单基因疫苗免疫组 ,联合基因疫苗和灭活全菌细胞免疫组最低 ,各组间有显著性差异 ( P<0 .0 5 )。结论　 pc DNA3 - gtf B和 pc DNA3 - pac具有明显的免疫抑菌作用 ,联合基因疫苗免疫优于单基因疫苗     

热灭活疫苗HID39免疫小鼠可抵抗肺炎链球菌感染

目的 研制一种安全、有效且易于生产的肺炎链球菌疫苗,探讨其在BALB/c小鼠中的有效性.方法 通过热灭活肺炎链球菌标准菌株D39,得到无毒的、失去感染致病的能力的HID39,用HID39作为疫苗对随机分为阴性对照组(NC)、皮下免疫组(SC)和鼻内免疫组(IN)的小鼠进行免疫,ELISA法检测各组小鼠血清和唾液中的抗体...     

Construction andin vitro expression ofStreptococcus mutans surface protein encoding DNA vaccine

Summary DNA vaccine plasmids were constructed that encoded two highly-conservative regions of a surface protein, PAc, from the human major cariogenic bacterium,Streptococcus mutans. Antigen expression was evaluatedin vitro by immunohistochemical analysis of human endothelial cells following cationic liposome-mediated transient transfection with recombinant plasmid. The results of this study provided a basis for further testing of these recombinant plasmids in primates and for efficacy testing of dental caries DNA vaccines in human volunteers in future.     

Construction and in vitro Expression of Streptococcus Mutans Surface Protein Encoding DNA Vaccine

Since carieshasbeen verified etiologically to be aninfectious disease,efforts have been directed at themicrobiological and immunological researches in orderto identify the major cariogenic microorganism andpracticable antigens.Itishoped thatwith theantigensthey could construct effective anti- caries vaccine sothatcaries disease could be stopped in the key link ofmicrobiological mechanism.Streptococcus mutans(S.mutans) has been targeted by many researchersbecause of its obvious association with…     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。     

用绿色荧光蛋白报告肺炎链球菌的体内转化

目的: 了解肺炎链球菌(S.pn)在宿主体内转化发生的情况,以便于深入研究体内细菌转化对其毒力的影响. 方法: 通过基因重组和转化构建绿色荧光报告细菌转化发生的S.pn菌株22G;通过酶切、转化实验、RT-PCR、测序等多种方法鉴定菌株构建成功;通过荧光显微镜观察荧光. 结果: 荧光蛋白可以报告细菌转化的发生;体内实验表明,细菌在宿主体内能够发生转化. 结论: 利用荧光报告细菌转化发生可以用于观察细菌体内转化发生的研究.     

133株肺炎链球菌耐药性分析

目的 了解本院肺炎链球菌分布和耐药情况.方法 对本院2005年1月-2007年7月从临床分离的133株肺炎链球菌采用K-B纸片扩散法检测其对青霉素等7种抗生素的敏感度,用E-test法检测对苯唑西林耐药的肺炎链球菌青霉素的MIC值.结果 青霉素的耐药呈上升趋势,尤其是2007年上半年.肺炎链球菌对四环素(TCY)、红霉素(ERY)、克林霉素(CLI),有较高的耐药率,分别为63.2%、59.4%、51.9%,对青霉素(PEN)、氯霉素(CHL)、左旋氧氟沙星(LEV)的耐药率较低,分别为15.0%、12.8%、3.0%,未检出对万古霉素耐药的菌株.青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSSP)的E-test检测结果以中介菌株为主,PNSSP的MIC值最高达到6μg/ml.结论 本院分离的肺炎链球菌耐药较为严重,耐青霉素的肺炎链球菌不断上升,有必要对其进行耐药性监测,指导临床合理选择抗菌药物.