TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白的TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒表达载体,转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)。方法:设计含有GM-CSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物,PCR扩增TNFα-Tumstatin,将扩增产物亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组。筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒,酶切鉴定并测序。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,经过包装、扩增后感染hUCMSCs并检测细胞内融合基因的表达。结果:重组腺病毒质粒经PCR和PacⅠ酶切鉴定,证实含有TNFα-Tumstatin融合基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒感染的hUCMSCs表达绿色荧光蛋白和融合基因。结论:成功构建了TNFα-Tumstatin融合基因的腺病毒表达载体,能高效率感染hUCMSCs,为进一步研究融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤效应奠定了基础。     

人survivin基因重组腺病毒载体的构建及其在DCs中的表达

目的构建含有人survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞构建DC疫苗和基因治疗奠定基础.方法自行设计一对分别含有Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ酶切位点的survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全部序列.片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-survivin.通过Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack-survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒.同时将病毒上清转染树突状细胞,通过观察绿色荧光蛋白的表达以及Western blot分析观察survivin蛋白表达.结果成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.65×108PFU/ml.在19×103频段附近可见survivin蛋白表达为16.5×103.结论该重组腺病毒载体的构建及成功转染到树突状细胞内表达,为下一步研究人survivin作为靶抗原及基因治疗奠定了基础.     

应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.     

人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

人p27kip1可调控性重组腺病毒载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的:体外构建人p27kip1可调控性重组腺病毒载体,并观察其在前列腺癌细胞系PC-3细胞中的表达及其对细胞生长的影响.方法:采用Ad-X Tet-Off表达系统,将人全长p27kip1 cDNA经过穿梭载体,与可调控性腺病毒载体骨架连接,得到重组人p27kip1基因腺病毒(Ad-p27kip1),在HEK293细胞包装、扩增,获得高滴度病毒,采用空斑试验测定病毒滴度,体外转染PC-3细胞,RT-PCR、Western 杂交分别检测目的基因不同水平的表达,并通过MTT法观察转染前后细胞增殖力的变化.Ad-X-TRE-β gal病毒作为对照.结果:构建的Ad-p27kip1病毒滴度为1.2×109 pfu/ml,RT-PCR、Western 杂交检测有特异的高表达,转染后对细胞的生长有抑制作用.结论:体外连接法成功地构建携带人p27kip1基因的可调控性重组腺病毒载体,在人前列腺癌细胞系PC-3中有高表达并对细胞生长有抑制作用.     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet／GFP-RV中切获约1．7kb的小鼠T-betcDNA片段，与穿梭质粒pShuttle连接，再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接，构建重组载体pAdeno-T-bet，测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变，并转染HEK293细胞，出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实：T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中，带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。     

小鼠角质化细胞生长因子及其受体的重组腺病毒表达载体的构建

【论文特点介绍】既往研究表明角质化细胞生长因子（KGD对急性起病的ALI／ARDS，以及慢性进展的PF均有预防作用。因此，构建KGF、KGFR的重组腺病毒载体对于探索肺部疾病的治疗，探讨KGF，乃至其他生长因子在肺损伤免疫进程中的作用都是一个有力的工具。     

重组腺病毒Adeasy-HA117载体的构建及其在K562细胞的表达

目的:构建携带耐药相关基因HA117的高滴度重组腺病毒,转染K562细胞,检测其在K562细胞中的表达情况.方法:用基因工程技术将ATRA相关耐药新基因HA117的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdeasy同源重组,后将重组腺病毒Adeasy-HA117经脂质体转染包装细胞HEK293,并收获原代的重组腺病毒Adeasy-HA117,经乒乓交互感染的方法扩增原代腺病毒,应用RT-PCR、荧光显微镜及流式细胞仪鉴定和检测重组腺病毒感染K562细胞后HA117的表达情况.结果:酶切罄定及PCR结果证明ATRA相关耐药新基因HA117重组腺病毒载体构建成功.携带新基因HA117重组腺病毒载体的效价达8.3×1011pfu/mL.RT-PCR检测到转染后K562细胞内HA117的表达.结论:成功获得携带新基因HA117的重组腺病毒,并能使其在K562细胞巾高表达.     

大鼠神经生长因子腺病毒表达载体的构建及其在星形胶质细胞中的表达

目的构建含有大鼠β-NGF基因的重组腺病毒载体并观察其在星形胶质细胞的表达,为下一步在动物体内进行中枢损伤的基因治疗提供基础.方法设计一对含有HindⅢ及Sal Ⅰ酶切位点的β-NGF基因上下游引物,PCR法扩增含有大鼠β-NGF cDNA的质粒pUC19-β-NGF,产物经HindⅢ及Sal Ⅰ双酶切,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-β-NGF,经Pme Ⅰ酶线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转入BJ5183中进行同源重组,重组子经卡那霉素抗性筛选及酶切分析,阳性克隆经293细胞包装,扩增,空斑法测定病毒滴度,转化体外培养的星形胶质细胞.通过RT-PCR、ELISA、Western blot法检测其在星形胶质细胞中的表达. 结果 PCR及酶切鉴定确认获得重组腺病毒载体pAd-β-NGF,重组腺病毒在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011 PFU/ml.病毒上清液经ELISA 检测,β-NGF表达的量为(94.50±4.58) ng/L.结论该重组腺病毒载体的构建为下一步在动物体内的表达及中枢神经系统损伤的转基因治疗提供了一定的基础.     

人截断型LBP基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的 构建人N端截断型脂多糖结合蛋白（tLBP)基因的杆状病毒表达载体,为后续的蛋白表达及其抗内毒素保护作用研究奠定基础。方法 采用PCR技术从人全长LBP基因cDNA中扩增长度为695bp的基因片段,经pGEM-T载体亚克隆筛选和序列分析后,应用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统,基因重组和外源基因转座分别构建转移质粒pFASTBACtLBP和穿梭质粒pBac-midtLBP。结果 经PCR、琼脂糖凝胶电泳、酶切分析及序列测定,所克隆的基因片段为700bp左右的tLBP,并证实其目的基因重组载体发生了特异转座和病毒重组。结论 本实验成功克隆了tLBP目的基因片段并构建其杆状病毒表达载体。     

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的：从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2（ CDC2）,并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法：从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2 cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和 XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果：RT-PCR扩增出约894 bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论：从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。     

颌下腺套细胞淋巴瘤病理特点分析

目的探讨颌下腺套细胞淋巴瘤(MCL)的病理临床表现、免疫表型特征、在诊断及鉴别诊断中的意义。方法对1例颌下腺MCL行组织形态和免疫组化结果观察分析并结合文献归纳颌下腺MCL的病理特点。结果本例颌下腺经典型MCL由形态单一的小到中等大的肿瘤性淋巴细胞组成,弥漫排列,核形不规则,有的可见核裂,很像滤泡中心细胞,核分裂像易见,肿瘤细胞间散在无吞噬活性的组织细胞。间质见透明变性小血管。免疫组化:肿瘤细胞CD20(+),CD5(+),CD43(+),CyclinD1(+),bcl-2(+),CD3(-),CD10(-),bcl-6(-),CD23(-),CD21显示扩大不规则的滤泡树突细胞网(FDC网)。结论颌下腺套细胞淋巴瘤有其自身组织学特征,CyclinD1(+)有助于临床诊断。     

人ICOS胞外区腺病毒载体的构建与鉴定

目的利用细菌内同源重组法构建含ICOS胞外区基因的重组腺病毒。方法用基因工程的方法将ICOS胞外区的cDNA片段插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdtrack-cmv-ICOS,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,同源重组质粒PacⅠ酶切鉴定后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒颗粒Ad-ICOS。采用PCR方法对重组腺病毒颗粒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。通过Western Blot检测重组腺病毒感染后的293细胞上清中的ICOS胞外区蛋白。结果获得了重组人ICOS胞外区腺病毒载体颗粒。PCR检测表明重组腺病毒颗粒含有目的基因,滴度为2.1×1010pfu/ml。Western Blot检测到阳性目的条带。结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的重组体腺病毒Ad-ICOS在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对ICOS胞外区的深入研究奠定了基础。     

db/db自发性糖尿病小鼠颌下腺EGFR的表达及细胞凋亡关系的研究

目的:观察db/db自发性糖尿病小鼠颌下腺中表皮生长因子受体(EGFR)的表达及其与细胞凋亡的关系. 方法: 选取3,4,6,8,10月龄db/db糖尿病小鼠及相应月龄的db/ m正常小鼠颌下腺,应用SP免疫组织化学方法染色及TUNEL原位标记后进行图像分析,统计EGFR及凋亡细胞在颌下腺组织内表达(分布)的细胞阳性率. 结果:EGFR及凋亡细胞在对照组及糖尿病组颌下腺中均有表达(分布). db/db糖尿病小鼠颌下腺EGFR及凋亡细胞阳性率随病程延长均呈增高趋势,且显著高于对照组. 结论:EGFR表达增多,说明糖尿病时EGFR作为多效应受体,被激活后可能诱导了颌下腺的细胞凋亡. 凋亡细胞阳性率的显著增高,提示糖尿病是加剧颌下腺腺体萎缩,功能受损的原因.     

下颌下腺内NT-3的表达及意义

目的　对成人及大鼠下颌下腺内NT 3的定性、定位及生物学意义进行研究。方法　采用HE和免疫组织化学SABC染色方法。结果　成人下颌下腺导管上皮细胞呈NT 3免疫反应阳性 ,其中以纹状管最为明显。大鼠下颌下腺颗粒曲管、纹状管及小叶间导管上皮细胞呈NT 3免疫反应阳性。两者的导管上皮细胞核和腺泡细胞均为阴性。结论　成人及大鼠下颌下腺中有NT 3的表达 ,提示NT 3可能参与了下颌下腺复杂的分泌功能     

人成骨肉瘤MG-63细胞分化特性及分化过程中的基因表达

观察人成骨肉瘤MG 6 3细胞分化特性及分化过程中的基因表达。在细胞培养的不同时间 ,用α 磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶 (ALP)活性 ;放射免疫法测定骨钙素 (BGP)含量 ;半定量逆转录聚合酶链反应测I型胶原、基质金属蛋白酶 (MMP) 1和基质金属蛋白酶抑制因子 (TIMP) 1基因mRNA表达 ;VanGieSon氏苦味酸酸性复红染色法染色细胞I型胶原。结果表明MG 6 3细胞接种培养第 7d后I型胶原基因表达较高。MMP 1表达量随时间推移逐渐增加 ,至第 2 4d达到高峰。第 1～ 9dTIMP 1表达量逐渐增加 ,其后基本恒定。ALP活性第 0～ 12d逐渐增高 ,至第 12d达最高 ,其后逐渐下降。第 18d后 ,细胞有许多大小不等的结节形成 ,I型胶原结节染色较无结节处深。MG 6 3细胞具有成骨细胞表型特征。MG 6 3细胞生长分为细胞增殖、骨基质成熟、骨基质矿化阶段 ,且I型胶原 ,MMP 1,TIMP 1基因表达及ALP活性呈时间特异性。     

Effect of Antisense MBD1 Gene Eukaryotic Expression Plasmid on Expression of MBD1 Gene in Human Biliary Tract Carcinoma Cells

DNAmethylationhasavarietyofimportantfunctionsintheregulationofgeneexpression[1].ManystudiesdemonstratedthatthepathogenesisofbiliarytractcarcinomawascloselyassociatedwiththeaberrantDNAmethylationstatusoftumorrelatedgenes.TheaberrantstatusofDNAmethylationincludedthehypomethylationofonco genesandthehypermethylationoftumorsuppres sorgenes(TSG).IncreasingtheexpressionofTSGandimprovingthefunctionofTSGbyelimi natingitshypermethylationstatusmaybeanewwaytotreatbiliarytractcarcinoma.Toexplorether…     

18种人肿瘤细胞株药物敏感性与基因表达的关系

目的 探讨18种人肿瘤细胞对化疗药物的敏感性与基因表达的关系。方法 采用MTT法检测细胞株对阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、丝裂霉素（MMC）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）和卡氮芥（BCNU）的敏感性。流式细胞术检测P-糖蛋白（P-gP）、谷胱甘肽-s-转移酶-π（GSTπ）、肺耐药蛋白（LRP）、多药耐药相关蛋白（MRP）和甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）等耐药相关基因和Fas、bcl-2、p53和p16等凋亡调控基因的表达。结果 不同细胞株对同一药物敏感性有较大差异。相关分析表明，细胞株对DDP的敏感性与p53表达呈负相关（P=0．041），对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关（P〉0．05）。结论 细胞株对DDP的敏感性与p53表达有关。