KBV200细胞多药耐药与蛋白激酶C亚型表达的关系

目的探讨蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药(multidrugresistance,MDR)的关系。方法(1)用Westernblotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布;(2)流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果(1)PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高,而PKCβ、ε无显著变化,PKCγ、ζ则未测出表达;(2)流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高,PKCβ、ε则无显著差别。结论PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中,PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

肿胀激活状态下蛋白激酶C同工酶亚型在胃癌耐药细胞系的亚细胞分布变化及其意义

目的 探讨肿胀激活状态下，传统型蛋白激酶C（cPKC)同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞系SGC7901/VCR的表达，亚细胞分布变化及其意义。方法 采用免疫荧光及免疫印迹方法，观察正常状态及持续低渗灌流不同时间cPKC同工酶亚型的亚细胞分布变化，利用免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察PKCα与-P-糖蛋白（Pgp)的共表达。结果 在正常状态下，cPKC的4种同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞SCG7901/VCR细胞质及细胞膜均有表达：PKCα在耐药细胞表达呈强阳恬药敏细胞表达呈强阳性，PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈强阳性。持续低渗灌流，在耐药系10min已发现有PKCα、PKCγ的移位及细胞体积的增大；30minPKCα几乎全部移位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积较前增大1-2倍；60min时PKCα及PKCγ基本恢复至正常位置。细胞体积也恢复正常；在药敏细胞系10-20minPKCα及PKCγ几乎全部一笔勾销 位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积也恢复正常；在药敏细胞系10-20minPKCα几乎全部移位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积较前增大1-2倍；40minPKCα及PKCγ基本恢复至正常位置，细胞体积也恢复正常，而PKCβ1及PKCβα在耐药细胞及药敏细胞的亚细胞分布无明显变化。共聚焦显微镜提示PKCα及PKCγ同工酶亚型参与了Pgp与低渗刺激下细胞共表达，以耐药细胞表达明显。结论 只有PKCα及Pgp表达量有关，而PKCβ1及PKCβⅡ可能与这一过程无关。βββ     

KBV2000细胞多药耐药蛋白激酶C亚型表达的关系

目的 探讨蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC）亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的关系。方法 （1）用Western blotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布；（2）流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果 （1）PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高，而PKCβ、ε无显著变化，PKCγ、ζ则未测出表达；（2）流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高，PKCβ、ε则无显著差别。结论 PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中，PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

肿胀激活状态下蛋白激酶C同工酶亚型在胃癌耐药细胞系的亚细胞分布变化

目的　探讨肿胀激活状态下,传统型蛋白激酶C(cPKC)同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞系SGC7901/VCR的表达、亚细胞分布变化及其意义。方法　采用免疫荧光及免疫印迹方法,观察正常状态及持续低渗灌流不同时间cPKC同工酶亚型的亚细胞分布变化。利用免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察PKCα与P-糖蛋白（Pgp）的共表达。结果　在正常状态下,cPKC的4种同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞SGC7901/VCR细胞质及细胞膜均有表达PKCα在耐药细胞表达呈强阳性,在药敏细胞表达呈阳性,PKCβ     

蛋白激酶C亚型在小鼠胚胎干细胞中的表达研究

【目的】研究5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKCα、PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)株ES-BALB／c的表达情况。【方法】ES-BALB／c细胞株用普通ES细胞培养液培养，分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿，培养2d和4d后分别进行PKC亚型免疫组织化学和Western印迹检测。【结果】免疫组化发现PKCα。在ES-BALB／c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达，以细胞浆和细胞核最甚，而PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε4种亚型无明显表达；Western印迹发现PKCα出现一条蛋白印迹条带，分子质量约为84ku，而PKCβ、PKCγ，PKCδ和PKCε 4种亚型无蛋白印迹条带。【结论】PKCα在ES细胞阶段即有表达，在将来的细胞分化阶段可能有非常重要的作用，而PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε4种亚型在ES细胞阶段没有表达。     

KBV200细胞多药耐药与蛋白激酶C表达上调的关系

目的 研究KBV200多药耐药细胞蛋白激酶C(PKC)的表达,探讨PKC的表达上调与肿瘤多药耐药的关系。方法 KBV200细胞分对照组和佛波酯(PMA)组,PMA组应用200nmol/L的PMA预孵育细胞,而对照组不用。³²P掺入法测定多药耐药KBV200细胞株的PKC活性,通过Westernblotting检测PKC各亚型表达和亚细胞分布。用MTT法检测细胞耐药性。结果 PMA预孵育可提高KBV200细胞的PKC总活性和膜组分PKC活性,降低浆组分PKC活性(P<0.01)。PMA预孵育使膜组分PKCα表达增加,浆组分PKCα表达降低,膜组分PKCβ无明显变化,浆组分PKCβ的表达稍增强。PMA可升高长春新碱、阿霉素对KBV200细胞的IC₅₀值(P<0.01)。结论 PMA使KBV200细胞耐药性增加,可能与PKC表达上调有关。     

大肠癌耐药LoVo/Adr细胞PKC亚型与MDR的关系

目的 探讨大肠癌LoVo/Adr细胞蛋白激酶(PKC)亚型分布与多药耐药(MDR)关系. 方法 采用Western blot法,检测PKCα, PKCβ和PKCγ和PKCε在LoVo/Adr细胞胞膜和胞质中的表达;采用流式细胞术,检测了PKC对LoVo/Adr细胞阿霉素摄入的影响. 结果 在LoVo/Adr细胞中,PKCα主要分布在胞膜中,且含量显著高于LoVo细胞;PMA作用30 min时,可以使胞质中的PKCα几乎全部转移到胞膜中,PMA作用24 h时,胞质和胞膜中PKCα几乎测不到;PMA作用30 min时,阿霉素摄入量(荧光强度)由原来的2.04±0.70减少到1.74±0.56,显著减少(P＜0.01);PMA作用24 h时,阿霉素摄入量增加到2.21±1.28,显著增加(P＜0.01). 结论 PKCα与MDR的形成可能有关.     

蛋白激酶Cα亚型在中国仓鼠卵巢上皮细胞中的表达

目的 研究中国仓鼠卵巢上皮(CHO)细胞是否表达蛋白激酶C(PKC)α亚型.方法 参照GenBank数据库PKCα亚型的cDNA序列,通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKCα亚型的特异引物,RT-PCR扩增CHO细胞PKCα亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKCα连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKC α亚型.结果 RT-PCR和Western blotting方法均表明CHO细胞表达PKCα亚型,并经测序证实.结论 CHO细胞中发现PKCα亚型的存在,为深入研究PKC α亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础.     

NF-κB参与哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞中PKCα诱导的Cyclin D1上调及细胞增殖

摘要目的探究蛋白激酶Cα-核因子κB（PKCα-NF-κB）级联对哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的调节作用及细胞增殖的影响。方法用10％的哮喘患者血清被动致敏人气道平滑肌细胞（HASMCs）,予以蛋白激酶C（PKC）激活剂12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯（PMA）刺激。分别以PKCα反义寡核苷酸（PKCα as ODN）和吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）抑制PKCα表达和NF-κB活化。用凝胶电泳迁移率改变试验（EMSA）检测HASMCs中NF-κB的活性,用RT-PCR法及Westernblot法检测干预前后CyclinD1的mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测HASMCs增殖。结果PMA刺激后磷酸化PKCα（P-PKCα）水平增高,NF-κB-DNA结合活性增强,CyclinD1表达明显增强,HASMCs的增殖增强;而反义PKCα寡核苷酸转入细胞特异性地抑制PKCα表达后,p-PKCα水平下降,NF-κB-DNA结合活性明显减弱,CyclinD1表达也明显下降,HASMCs的增殖减弱（P〈0．05,n=4）;用PDTC抑制NF-κB活性后,PMA刺激下p-PKCα水平仍然明显增高,但CyclinD1的表达明显下降,HASMCs的增殖减弱（P〈0．05,n=4）。结论NF-κB是PKCα的下游信号分子,PKCα—NFκB级联参与了PMA所诱导的哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞Cyclin D1的表达上调及细胞增殖。     

TGF-β1及PKCα在胰腺癌中的表达及其相关性

目的:研究TGF-β1及蛋白激酶Cα(PKCα)在胰腺癌中的表达及其相互关系.方法:选取42例胰腺癌及癌旁组织,构建组织芯片,应用免疫组织化学SP三步法检测TGF-β1和PKCα在胰腺癌及癌旁组织中的表达.结果:TGF-β1在胰腺癌及癌旁组织的表达分别为80.9%(34/42)、19.1%(8/42);PKCα在胰腺癌细胞胞膜和胞质表达分别为59.5%(25/42)、52.3%(22/42),而在癌旁组织细胞胞膜和胞质表达分别为4.76%(2/42)、83.3%(35/42);相对于癌旁组织,癌组织中的TGF-β1的表达明显增强(P＜0.01),PKCα的膜表达明显增强(P＜0.01),PKCα的膜表达与TGF-β1的表达正相关(P＜0.01).结论:胰腺癌中TGF-β1的过表达可能与PKCα的膜转运有关,而PKCα的膜表达在多药性耐药中发挥重要作用,检测胰腺癌组织中TGF-β1及PKCα的表达可能有助于对胰腺癌的化疗效果作出评价.