液相色谱-串联质谱法研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构

利用液质联用研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的相对分子质量；采用液质联用分别分析HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物。MALDI-TOF-MS测得HV12p-rPA的相对分子质量为41 472 Da，与理论值相符；HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)酶解产物进行液质联用分析结果表明该融合蛋白中含有瑞替普酶序列；HV12p-rPA的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物进行液质联用分析，结果表明融合蛋白中含有水蛭素12肽，并检测出融合蛋白中的链接肽(DEGGGSY)，融合蛋白的N末端MASDF和C末端LDWIRDNMRP；采用液质联用进行肽图分析，识别出的多肽匹配度Xcorr均超过1.5，部分多肽的Xcorr超过3.0，表明本实验测定过程中多肽识别结果准确可靠；目标蛋白的氨基酸序列覆盖率超过85%。结果确定了HV12p-rPA融合蛋白的序列与理论值相符。     

瑞替普酶溶栓治疗急性心肌梗死的效果

目的:探讨瑞替普酶溶栓治疗急性心肌梗死的效果。方法:将我院收治的150例急性心肌梗死患者随机分为观察组(75例)和对照组(75例),观察组给予瑞替普酶治疗,对照组给予尿激酶治疗,比较两组治疗效果。结果:观察组患者的溶栓效果显著优于对照组,两组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:瑞替普酶溶栓治疗急性心肌梗死的效果优于尿激酶,值得临床推广。     

急性心肌梗死应用瑞替普酶和阿替普酶溶栓效果的对比研究

目的比较国产瑞替普酶和进口阿替普酶对急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)的溶栓效果。方法回顾性分析80例ST段抬高型心肌梗死患者,根据溶栓药物不同分为国产瑞替普酶治疗组40例,进口阿替普酶治疗组40例,比较两组患者在临床症状、梗死相关血管的再通率、射血分数(EF)值、心力衰竭发生率、心肌梗死后心绞痛发生率、出血率及出院前病死率的差别。结果瑞替普酶治疗组在患者临床症状的缓解、梗死相关血管的再通率、降低病死率方面均略高于阿替普酶组,但差异无统计学意义(P>0.05),在EF值、心力衰竭发生率、心肌梗死后心绞痛发生率、出血率方面比较亦无明显差别。结论临床上应用国产瑞替普酶及进口阿替普酶溶栓治疗急性心肌梗死疗效相当,但国产瑞替普酶使用快速、简便、经济、易操作,更适合在临床使用。     

新型溶栓药物瑞替普酶

瑞替普酶是人类组织型纤溶酶原激活物的一部分，在大肠杆菌中合成。与其它溶栓药物相比，瑞替普酶具有疗效显著，使用方便，不良反应小等优点。     

瑞替普酶溶栓治疗脑梗死的疗效研究

目的观察瑞替普酶(rPA)对大鼠脑梗死模型的溶栓作用,为临床应用rPA溶栓治疗脑梗死提供实验依据。方法通过大鼠颈内动脉注入自体血栓栓塞大脑中动脉起始部,1.5h后36只大鼠采用rPA溶栓治疗,24h后观察溶栓效果。结果治疗组与对照组相比Longa评分降低(P<0.01),梗死体积减少(P<0.01),细胞形态结构完整。结论rPA早期溶栓治疗大鼠急性脑梗死可显著减小梗死体积、改善神经功能缺失症状、降低死亡率,且应用方便;rPA在临床脑梗死的溶栓应用可能同样有效。     

瑞替普酶溶栓治疗急性心肌梗死的疗效观察

目的观察国产重组组织型纤溶酶原激活剂(瑞替普酶)治疗急性心肌梗死(AMI)的临床疗效和副作用。方法将106例AMI患者随机分两组,瑞替普酶组57例,先给普通肝素4000U静脉推注,之后给予瑞替普酶10U溶于10ml0.9%氯化钠溶液,5min静脉推注;尿激酶组49例,予尿激酶150万U溶于100ml0.9%氯化钠溶液,30min静脉滴注。两组均用皮下肝素,其余治疗也相同。溶栓后2h行冠脉造影,了解TIMI血流情况。结果瑞替普酶组与尿激酶组的血管总开通率、TIMI3级血流、开通时间分别为68.9%与56.3%;49.6%与38.7%;(0.83±0.54)h与(1.31±0.52)h(P<0.05)。副作用:轻度出血率在瑞替普酶与尿激酶组分别为8.8%与8.2%。结论瑞替普酶治疗AMI血管开通率高,开通时间短,副作用小。     

瑞替普酶溶栓治疗急性心肌梗死69例疗效分析

目的研究评价溶栓药物瑞替普酶（r-PA）治疗急性心肌梗死（AMI）的临床疗效及安全性。方法将符合溶栓条件并同意接受该疗法的69例AMI患者作为溶栓组，用（r-PA）按10Mu-20Mu剂量治疗；将同样符合溶栓条件但因各种原因不愿接受溶栓治疗的AMI患者作对照组（49例），比较两组的再灌注率、住院2周内病死率、心力衰竭、心源性休克、严重心律失常及不良反应发生率。结果溶栓治疗组再灌注率（80．9％）显著高于对照组（20．4％），（P〈0．01）溶栓组3周病死率（7．8％）、心力衰竭（12％）、心源性休克（8％）和严重心律失常（12％）发生率均明显低于对照组（分别为19％、35％、31％和31％），有统计学差异（P〈O．01）。溶栓组有一例脑出血，轻度出血发生率溶栓组（10．3％）高于对照组（8．3％）（P〈0．05）。结论溶栓剂（r-PA）溶栓效果好，不良反应少而轻，疗效确切，简便易行，价格较廉，适合我国广泛应用。     

瑞替普酶静脉溶栓治疗心肌梗死32例临床分析

目的探讨瑞替普酶静脉溶栓治疗心肌梗死的临床疗效。方法选取我院心肌梗死32例患者,予以瑞替普酶静脉溶栓治疗,观察血管再通的临床指标及不良反应。结果根据冠脉再通标准判断,32例患者血管再通构成比为78．1％,出血发生率为0．64％。结论使用瑞替普酶静脉溶栓治疗心肌梗死具有良好的临床疗效,值得应用。     

水蛭素及其衍生物研究进展及展望

天然水蛭素是含有65—66个氨基酸残基的无糖基化单链多肽,分子质量约为7 000 u,由医用水蛭的唾液中分离得到,是凝血酶的特异性抑制剂,在临床治疗血栓疾病中有着重要意义。近年来多种水蛭素的衍生物被成功的开发出来,本文就重组水蛭素的研究进展进行了综述,并对其应用前景进行了展望。     

重组水蛭素的表达纯化及活性检测方法进展

作为直接凝血酶抑制剂，重组水蛭素在临床上的应用已越来越重要。文章综述了重组水蛭素的表达、分离纯化及其理化性质和活性检测方法的进展。     

波形蛋白基因的构建、表达及鉴定

文章进行波形蛋白(VIM)基因重组质粒的构建,并进行表达与鉴定,为开辟新的肝癌诊断方法奠定基础。从人宫颈癌细胞(HELA)中提取总RNA并采用PR-PCR及PCR技术克隆VIM基因,经酶切连接等构建带有GST标签的PGEX-4T-1-VIM重组表达质粒,在大肠杆菌DH5α菌中扩增重组质粒,并在BL21菌中进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blotting等进行鉴定。重组及表达蛋白Vimentin的融合蛋白,为建立一种新的肝癌早期诊断方法奠定基础。     

Antimicrobial Peptides Derived from Fusion Peptides of Influenza A Viruses,a Promising Approach to Designing Potent Antimicrobial Agents

The emergence and dissemination of antibiotic‐resistant bacterial pathogens have spurred the urgent need to develop novel antimicrobial agents with different mode of action. In this respect, we turned several fusogenic peptides (FPs) derived from the hemagglutinin glycoproteins (HAs) of IAV into potent antibacterials by replacing the negatively or neutrally charged residues of FPs with positively charged lysines. Their antibacterial activities were evaluated by testing the MICs against a panel of bacterial strains including S. aureus, S. mutans, P. aeruginosa, and E. coli. The results showed that peptides HA‐FP‐1, HA‐FP‐2‐1, and HA‐FP‐3‐1 were effective against both Gram‐positive and Gram‐negative bacteria with MICs ranging from 1.9 to 16.0 μm , while the toxicities toward mammalian cells were low. In addition, the mode of action and the secondary structure of these peptides were also discussed. These data not only provide several potent peptides displaying promising potential in development as broad antimicrobial agents, but also present a useful strategy in designing new antimicrobial agents.     

TAT-BDNF载体构建及融合蛋白表达

目的构建重组表达载体TAT-BDNF,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白,为研究TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。方法经RT-PCR获得编码人BDNF的全基因序列,连接到原核表达载体pTAT上,得到重组表达载体pTAT-BDNF,转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-BDNF融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了TAT-BDNF融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白。结论为进一步研究TAT蛋白转导作用奠定了基础。     

抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白.从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp).重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽.插入表达载体pPIC9K中a交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF.电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子.甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性.结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础.     

rhCG融合蛋白在CHO细胞中的表达、纯化与鉴定

为实现rhCG融合蛋白在CHO细胞中的高效表达,构建两个不同的 His－tag rhCG 融合蛋白真核表达载体,通过瞬时转染比较两个载体在CHO－dhfr－细胞中的表达量,选择表达量较高的载体稳定转染CHO－dhfr －,并采用氨甲喋呤（ MTX）进行加压筛选高表达单克隆细胞株。加压后,表达量由1日1300mIU? mL －1提高至18000mIU? mL －1（以106个细胞计）。该克隆株经传代50代以后,rhCG表达量未发生明显变化,表明该克隆为稳定克隆株。用Ni＋螯合亲和层析及凝胶过滤层析分离纯化表达产物,获得纯度大于99％的rhCG融合蛋白,SDS－PAGE电泳及 Western Blot结果表明rhCG得到正确及完整的表达,生物学活性测定结果表明样品比活为11000IU? mg －1。