大暑骨髓间质干细胞的分离培养与中药诱导分化的研究

目的：研究掌握骨髓基质干细胞（MSCs）的分离培养和诱导：．口＼化的方法；方法：是将大鼠骨髓基质干细胞自股骨中分离，利用骨髓基质干细胞具有贴壁生长的培养特点，应用贴壁筛选法…进行分离培养和传代，并应用中药进行诱导分化；结论：该方法是简便安全有效的骨髓基质干细胞的分离、培养和诱导方法     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索体外分离培养及纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)的方法.方法:采用贴壁分离和消化控制相结合的方法,分离纯化3～4周龄大鼠MSCs,免疫细胞化学法鉴定其活性和表型.结果:原代培养的MSCs呈圆形、梭形、多角形等,24 h内即可见少量细胞体贴壁伸展,7～8 d左右可达90%融合,纯化后的MSCs呈均匀一致的长梭形,24h内细胞贴壁率99%,传代周期为7d左右.免疫细胞化学检测显示CD34表达阴性,CD44表达阳性.结论:贴壁分离和消化控制相结合能有效分离纯化成年大鼠MSCs,细胞纯度较高,细胞活力强,生物学性状稳定,是目前一种比较理想的分离纯化方法.     

骨髓间质干细胞与股骨头缺血性坏死

干细胞研究是世纪之交最引人注目的科技成果之一,对生命科学的发展具有深远的影响,在细胞治疗和基因治疗方面有重要价值,如骨髓造血干细胞移植已成为治疗骨髓造血功能障碍、白血病和某些恶性肿瘤的公认有效方法。随着对骨髓干细胞(骨髓造血干细胞和骨髓基质干细胞)特别是对骨髓     

黄芪多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化的特性

目的观察黄芪多糖对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化特性的影响,为开发有效而又低毒的分化诱导剂提供依据。方法采用全骨髓贴壁筛选法分离、纯化无特定病原体级Wistar大鼠BMSCs。用噻唑蓝(MTT)法筛选出黄芪多糖的合适浓度,取F3代细胞,采用随机数字表法分为对照组和诱导组(神经诱导、成脂诱导、成骨诱导、软骨诱导),采用甲苯胺蓝染色、油红O染色、茜素红染色检测神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞表面特异性标记物。用Western Blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、脂蛋白酯酶(LPL)、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ。分析黄芪多糖对F3代BMSCs向神经、脂肪、软骨和骨的诱导分化作用。结果 MTT显示,在1 g/L黄芪多糖诱导48 h下细胞增殖明显,甲苯胺蓝染色阳性,而油红O、茜素红染色阴性。Western Blot法检测显示NSE为阳性表达,LPL、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ均为阴性表达。结论黄芪多糖可诱导大鼠BMSCs定向分化为神经细胞,而未向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化。     

叶酸诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的浓度探索

目的探讨叶酸对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的最佳浓度。方法MSCs由正常成年人骨髓经密度梯度离心加贴壁离心获得．取第5代MSCs以1mmol／L二巯基乙醇（BME）预诱导24h后,用羟基茴香醚（BHA）、2％二甲基亚砜（DMSO）和3种不同浓度的叶酸诱导分化,采用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白GFAP的表达,MTT（四唑盐比色）法检测不同时间段对BMSCs增殖的影响。结果不同剂量叶酸组分化为NSE阳性神经元样细胞的百分率都较对照组高（P〈0．01）,但以40mg／L中等浓度的叶酸神经细胞最多,且神经元比例高于其他组。结论叶酸诱导BMSCs向神经元分化以40mg／L浓度为最佳。     

丹参诱导成年小鼠骨髓基质干细胞分化为神经细胞研究

应用复方丹参注射液诱导体外培养的成年小鼠骨髓基质干细胞,观察诱导过程中的形态学变化,并于诱导后5h、24h、72h分别应用抗Nestin、抗βⅢ-tubulin、抗MBP及抗GFAP抗体进行免疫细胞化学染色．RT-PCR检测mRNA表达,Western Blot检测蛋白表达,应用2-巯基乙醇作为诱导对照组。研究发现,复方丹参注射液和2－巯基乙醇均可诱导骨髓基质干细胞分化为神经样细胞,但复方丹参注射液诱导怍用更为缓和,细胞死亡率远低于2-巯基乙醇诱导组。免疫细胞化学示Nestin和βⅢ-tubulin阳性表达,MBP及GFAP为阴性表达。RT-PCR可见Nestin和βⅢ-tubulin mRNA阳性表达,Western Blot检测证实Nestin和βⅢ-tubulin蛋白呈阳性表达。提示,复方丹参注射液可在体外诱导成年小鼠骨髓基质干细胞向神经细胞发育,是较为理想的诱导剂。     

人骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨一种优化的骨髓问充质干细胞（Bonemarrow stromal stem cells,BMSCs）获取、分离、培养、鉴定的方法,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法：抽取健康自愿者骨髓,采用密度梯度离心法分离贴壁培养BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,结合流式细胞技术来间接鉴定BMSCs。结果：首次换液时间为5—6d,20d左右细胞逐渐汇集可以进行传代,获得纯化的人的BMSCs。结论：采用密度梯度离心法分离贴壁培养的方法能够分离纯化的人BMSCs,9代以前生长迅速,形态稳定,可传至11代,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化

目的:分离培养兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导分化。方法:从兔骨髓中分离培养原代MSCs并进行传代培养,绘制生长曲线。取第3代细胞进行成骨诱导分化,进行Vonkossa染色,碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶(ALP)活性测定,总蛋白检测,提取细胞总RNA及RT-PCR法检测Collagen I,osteocalcin及osteopontin基因表达情况。结果:MSCs贴壁生长,呈放射样、爆花样或漩涡样,可传20代以上。未经成骨诱导的MSCs不发生矿化沉积,而经成骨诱导分化后,细胞可发生显著的矿质沉积。未经成骨诱导的MSCs可微量表达CollagenI,但不表达osteocalcin和osteopontin,而经成骨诱导分化后,细胞表达CollagenI增强,并出现osteocalcin和osteopontin等成骨标志物的表达。结论:本实验成功分离培养MSCs并成骨诱导分化。     

黄芪注射液预处理对大鼠骨髓间充质干细胞定向分化的诱导作用研究

目的:研究黄芪注射液预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的定向诱导作用.方法:在无菌条件下从成年大鼠胫骨骨髓分离出MSCs,以1:3的比例传代,取第3代的细胞,接种后随机将MSCs分为5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组及对照组,用相差显微镜观察各组细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定MSCs表面标志物及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.结果:培养后的细胞表面CD44表达阳性;黄芪注射液诱导组、5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组诱导后的细胞形态发生改变,细胞之间形成连接,排列方向趋于一致,免疫组化检测结果显示肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)表达均阳性,黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组表达相对更强,与其他组相比有显著差异.结论:黄芪注射液可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,采用黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化的方式相对其他的方法更具优势.     

大鼠内皮祖细胞的分离、培养与定向诱导分化

目的探讨建立一种从大鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞(EPCs)的稳定、高效方法。方法密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离单个核细胞,经差速贴壁结合特殊培养基扩增并向内皮细胞定向诱导分化EPCs。应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133。并通过检测其对FITC标记的UEA-1的吸附和内吞DiI-ac-LDL来进行细胞功能学的鉴定。对分化细胞行vWF、CD31免疫组化染色鉴定,并与血管内皮细胞合成前列腺素能力进行比较。结果梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133。分离所得细胞经EBM-2专用培养基培养后,第5天可见集落形成,培养第9天CD133阳染细胞减少,CD31阳染细胞增加,细胞可特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-ac-LDL,约3周左右形成铺路石样内皮细胞特有形态。诱导后的内皮祖细胞的前列腺素合成能力与血管内皮细胞之间无统计学差异(P>0.05)。结论该方法可以同时培养扩增和定向诱导分化内皮祖细胞,效率高,稳定性和重复性好。     

大鼠脂肪干细胞的分离培养鉴定及多向诱导分化研究

目的:通过体外分离培养脂肪干细胞,并进行传代、表型鉴定及多向诱导分化,进一步了解其生物学特性,为临床运用奠定实验基础。方法:取SD大鼠附睾近心端,肾周及腹股沟韧带皮下脂肪组织,采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法,对脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增、表型鉴定及成骨成脂诱导分化,在倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并采用MTT法检测第3、5、7、9代细胞增殖能力,用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记,取第3代细胞进行成骨成脂诱导分化,并采用茜素红染色、油红O染色方法进行鉴定。结果:采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法得到的脂肪干细胞,其细胞形态较为均一,基本呈长梭形,旋涡状生长,并形成集落样生长。MTT法检测第3、5、7、9代ADSCs呈典型的"S"形增殖曲线,符合干细胞的特性,脂肪干细胞表型鉴定结果显示CD29阳性高表达,CD34阴性表达,CD45低表达,CD105弱阳性表达,脂肪干细胞能向成骨细胞及脂肪细胞分化。结论:脂肪干细胞取材较方便,含量丰富、并能够在体外分离培养,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向成骨及成脂多向分化,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源。     

香丹注射液定向诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:研究香丹注射液对成年SD大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)的诱导分化作用.方法:rMSCs取自大鼠的下肢骨,贴壁筛选法和营养缺陷培养基(α-MEM完全培养液)分离纯化.加碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导第5代的rMSCs 24 h,换无血清培养液(D/F12 N2 bFGF)和香丹注射液(1%～5%)诱导6～8 h,观察细胞形态变化;细胞免疫化学和反转录-PCR法鉴定神经元标记物(神经元特异性烯醇化酶NSE、神经丝蛋白NF-200、微管相关蛋白MAP-2及胶质纤维酸性蛋白GFAP)的表达及相对表达量,并得到相应的诱导率.结果:诱导3 h,rMSCs出现神经元样的形态学变化,诱导6～8h,神经元的诱导率达83.5%±3.8%;诱导组中,神经元样细胞NSE、NF和GFAP的阳性率分别为82.9%±2.98%、84.1%±4.45%、3.49%±1.67%;对照组细胞和诱导组未变化细胞上述染色均呈阴性;RT-PCR法示:只有诱导组有NSE、MAP-2(HWM)、GFAP的表达且前两者的表达量均分别高于后者(P＜0.01).结论:1%～5%香丹注射液在体外能定向诱导rMSCs分化为神经元样细胞.     

隐丹参酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：观察隐丹参酮体外定向诱导成人骨髓间质干细胞（MSC）分化为神经元样细胞。方法：采用Ficoll-Paque液分离成人MSC，体外扩增，FACScan流式细胞仪检测表面抗原表达，采用含隐丹参酮的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF－M，NF－H）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、巢蛋白（Nestin)的表达。结果：成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10^6个细胞，15代可获得（2－3）×10^12个细胞，流式细胞仪检测显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。加入隐丹参酮诱导后，MSC胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF－M，NF－H、Nestin表达阳性，GFAP阴性。结论：隐丹参酮在体外可诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

人参皂甙与肝细胞生长因子诱导骨髓间质干细胞分化为肝细胞的实验研究

目的探讨人参皂甙(CS)与肝细胞生长因子(HGF)体外诱导骨髓间质干细胞(MSC)分化为肝细胞的协同效应及分子机制。方法采用 Ficoll-Paque 液离心分离鼠 MSC,体外扩增,在 LDMEM 培养液中加入 HGF 和 GS 进行诱导分化。通过细胞形态学观察、免疫组化检测白蛋白、CK8/18的表达以及 RT-PCR 检测白蛋白、CK18等肝细胞特征性蛋白的 mRNA 转录水平、糖原染色等来分析诱导分化的效果。结果鼠MSC 体外扩增3代,细胞数可达(1～2)×10~7左右。加入 HGF 和 GS 诱导后,MSC 形态逐渐分化为肝细胞样,免疫组化染色见胞浆内出现棕黄色颗粒,表达肝细胞特有的白蛋白以及 CK8/18等蛋白。RT-PCR 显示有白蛋白、CK18等的 mRNA 转录。糖原染色亦呈阳性反应。结论人参皂甙与肝细胞生长因子在体外可以诱导骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特性及多潜能分化研究

目的:研究兔骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特性,建立一种稳定的细胞分化体系。方法:取3月龄大耳白兔骨髓3ml~4ml,采用贴壁法获取骨髓间质干细胞,取2代细胞按1×104个/孔接种于24孔培养板内,绘制生长曲线。将传代2代细胞按3×103个.cm-2,接种于6孔板内,并加入条件培养液(地塞米松10-7mol.L-1,β-甘油磷酸钠10 ml.L-1,50 mg.L-1抗环血酸),ALP-钙化染色鉴定,将传代2代细胞按3×105个.cm-2接种于6孔板内,并加入条件培养液(TGF-β15 ng.ml-1,地塞米松10-7mol.L-1或多聚赖氨酸10μg.ml-1),阿新兰染色鉴定。结果:原代生长的细胞呈梭形,7d后形成多个集落,并逐渐溶合或片铺满瓶底,随着传代次数的增加,细胞增殖能力增强。骨髓间质干细胞在不同条件培养液下可向成骨细胞或软骨细胞分化,ALP-钙染色及阿新兰染色阳性。结论:在本培养体系下,骨髓间质干细胞生长良好,可分化为成骨细胞及软骨细胞,具有多向分化潜能。     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：探讨天麻对体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的影响：方法：通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养。中药天麻定向诱导分化为类神经元样细胞光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志物神经原烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)。结果：大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。天麻诱导2h后大部分可分化为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论：大鼠MSC可诱导分化为神经元样细胞。     

骨髓基质干细胞研究进展

骨髓基质干细胞(BMSCs)又称为骨髓间充质干细胞(MSCs),已广泛应用于脑和脊髓损伤、骨损伤、软骨缺损与损伤、心肌细胞损伤等的修复、基因治疗和临床治疗的研究。文中从BMSCs的发现及应用研究现状、BMSCs的制备、培养及生物学特征、BMSCs向神经细胞分化的研究进展等方面对BMSCs的国内外研究进展进行综述。     

缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化过程中碱性磷酸酶活性的影响

目的观察缺氧刺激对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)骨向诱导分化过程中碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法 rBMSCs骨向诱导后按不同氧浓度及不同作用时间分组,检测不同作用时间的缺氧对rBMSCs骨向诱导分化过程中ALP活性的影响。结果缺氧培养对rBMSCs骨向诱导分化中ALP活性的影响除12 h略有降低但无显著性差异外,其余各时间段均有明显抑制作用且有显著性差异(P均<0.05)。结论缺氧培养对rBMSCs骨向诱导分化过程中ALP活性有明显抑制作用,提示2%缺氧对rBMSCs骨向分化的成骨效应有抑制作用,进而促使骨改建平衡向破骨方向倾斜。     

骨髓间充质干细胞的成骨性诱导

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的效果。方法:采用全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,把生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为两组,对照组用DMEM-LG培养基培养;实验组用含有成骨诱导剂的DMEM-LG培养基培养。结果:全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁且呈梭形;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组(P<0.01),茜素红染色出现阳性的钙化结节。结论:全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。