骨髓基质细胞上清对脐血造血细胞体外增殖的作用

目的:探讨骨髓基质细胞培养上清(SN)对人脐血造血细胞体外扩增的作用.方法:使用rIL-3,rIL-1β.rIL-6和SCF等细胞因子或SN或者两者联用长期培养人脐血造血细胞,进行细胞增殖和造血祖细胞集落测定.结果:脐血造血细胞培养至2周时,细胞总数在细胞因子组增加了134.5倍和SN组增加8.15倍,两者联用增加了171.3倍.培养至第6周时,细胞增加减少,以SN组最明显,为培养前的26.65倍,细胞因子组为54.15倍,两者联用仍有92.25倍.对脐血造血祖细胞增殖的影响,在扩增2周后,CFU产率细胞因子组和SN组比扩增前增殖了250%和217%,两者联用为279%.扩增至第3周,CFU产率下降,以前两组最明显,比扩增前分别增殖151%和145%,两者联用仍增殖了240%.结论:骨髓基质细胞培养上清可促进脐血造血细胞的增殖,但比细胞因子作用弱,两者联用时作用明显强于两者分别使用,提示骨髓基质细胞还可产生其它物质刺激造血细胞增殖并延长培养时间.     

硫酸乙酰肝素协同细胞因子对脐血造血细胞体外扩增及细胞免疫表型的影响

目的:探讨硫酸Z酰肝素(HS)协同细胞因子对人脐血造血细胞体外生长的影响.方法:分成四组.A组用细胞因子(rIL3.rIL-lβ.rIL-6,和SCF等)、B组用骨髓基质细胞培养上清(SN) 细胞因子、C组用SN、D组用HS 细胞因子体外培养扩增脐血造血细胞.并应用间接免疫荧光法检测细胞表面标志.结果:①培养7 d.细胞已开始增殖,14 d达高峰,细胞总数A、B、C、D四组依次增加了134.5、171.3、81.5、167.2倍.2l d细胞数量开始下降,D组下降最明显.35 d时细胞总数依次仅为培养前的54.15、92.25、26.65和100.2倍.②CD34 细胞第7 d已升高,14 d达高峰,依次比培养前增加了68.43%、82.47%、69.77%和79.3%,21 d开始减少,但仍依次比培养前增加56.16%、71.72%、12.33%和73.7%.CD33 细胞7 d时均显著增加,14 d达高峰,依次比培养前增加了80.22%、68.64%、81.58%和70.30%,21 d时维持在14 d水平.CD38 细胞7 d时均有显著增加.比培养前增加了66.65%、73.8%、70.42%和71.9%,14～21 d均在该水平上维持.结论:①骨髓基质细胞培养上清与细胞因子联用对脐血造血细胞增殖的促进作用明显强于两者单用.②硫酸乙酰肝素可替代骨髓基质细胞培养上清与细胞因子联用.     

干细胞生长因子协同血小板生成素体外扩增脐血巨核前体细胞的研究

目的探讨在干细胞生长因子(SCF)和血小板生成素(TPO)组合作用下,人脐血CD34~ 细胞体外扩增为巨核前体细胞的效果。方法采用经免疫磁珠纯化系统收集的人脐血CD34~ 细胞与SCF TPO组合体外培养,研究该组合对巨核前体细胞的扩增效果。结果在SCF和TPO组合的作用下,脐血CD34~ 细胞(6例)显著地向巨核前体细胞(CD61 CD41~ 细胞)扩增。CD61~ CD41~ 细胞构成比在培养第7天达到峰值(15．57±4．95)％,第14天为(9．06±2．72)％；存第14天,CD61~-CD41~ 细胞总数和巨核系细胞集落形成单位(CFU- MK)达到高峰,为较理想的培养时间。经过体外扩增,总细胞数、CD34~ 细胞数、CD61~ CD41~ 细胞和CFU-MK均显著增加。结论在SCF和TPO组合的作用下,脐血CD34~ 细胞可有效地扩增为巨核前体细胞。     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。     

造血细胞生长因子对脐血CD34+细胞短期体外扩增的作用

目的 探讨造血细胞生长因子(HGF)的不同组合对脐血CD34 细胞短期体外扩增的作用．方法 用免疫磁珠法分高纯化脐血CD34 细胞，培养于无血清培养液中。加入不同的细胞因子，于第4，7，10，14天检测CD34 细胞百分率和有核细胞(NC)总数。结果 和对照组相比，各组的NC扩增倍数随着培养时间的延长虽不同程度的增加，干细胞在FL、TPO，GM-CSF、SCF、IL-6、G-CSF、EPO和IL-3等因子作用下，NC扩增倍数在培养第14天达高峰，为328．96倍；而CD34 细胞扩增倍数在培养第7天达最高峰，但在FL、TPO、GM-CSF、SCF，IL-6、G-CSF等因子作用下，CD34 细胞扩增倍数最大，7d后达25．23倍，而后随着培养时间的延长而逐渐下降。结论 脐血CD34 细胞在HGF作用下，扩增时间以7-10d为最佳。     

脐血造血细胞体外扩增巨核细胞的研究

目的探讨在体外用不同的细胞因子组合在不同的培养时间对脐血CD 34+细胞向巨核系分化以及扩增的作用.方法细胞因子分为TPO(T)、TPO+SCF+IL-6+IL-3(TS36)、TPO+SCF+IL-6+IL-3+FL(TSF 36)等3组.将脐血CD 34+细胞在体外经14 d的诱导分化和扩增,在扩增后通过流式细胞仪、集落培养和免疫组化等方法检测培养物中CD41+细胞百分率、扩增倍数和巨核祖细胞集落形成单位(CFU-MK)产率和扩增倍数以发现较好的细胞因子组.并比较了TSF 36组细胞因子在第7 d和第14d时的CD 41+细胞百分率及CFU-MK产率及它们的扩增倍数.结果CD 41+细胞占培养细胞的比率3组细胞因子在14 d分别为77.5±3.5%、14.4±3.2%、21.3±1.7%;CD 41+细胞扩增倍数3组细胞因子分别为75.2±13.2倍、212.4±70.8倍、378.6±74.7倍;每104个细胞可形成CFU-MK分别为56.7±7.0个、22.0±3.0个、24±4.0个;扩增倍数分别为5.9±2.3倍、14.6±0.6倍、19.5±2.4倍.TSF 36组细胞因子在扩增CFU-MK和CD 41+细胞方面均有最强的作用,其第14 d的CD 41+细胞百分率及CFU-MK产率均低于第7 d,但扩增倍数均高于第7 d.结论TSF 36细胞因子组合能使脐血CD34+细胞向巨核系进行分化和大量扩增,其巨核细胞扩增倍数第14 d高于第7 d,但巨核细胞纯度降低.这一结果进一步为临床应用巨核细胞体外扩增回输提供了实验基础.     

脐带血来源基质细胞培养及造血微环境的建立

目的：研究脐带血来源的基质细胞对脐血CD34⁺ 细胞体外扩增的促进作用。 方法：应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34⁺细胞，通过细胞因子对脐血前体基质细胞体外诱导，使其产生基质细胞和形成造血微环境。观察基质细胞的生长状态和细胞表面分子的表达，并建立以该基质细胞为滋养层的脐血造血干细胞体外扩增体系。结果：细胞因子联合培养对CFU-GM增长没有明显影响，但对于CFU-E的形成和细胞增长的影响细胞因子组和细胞因子+基质细胞组所培养的CPU-E与对照组比较差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01 ）。脐带血来源的基质细胞分泌细胞因子的时间-效应曲线显示，脐血基质细胞培养3、7、10、14和20 d后，TPO、SCF浓度在培养第7天时达到最高，而GM-CSF在第7天以后则逐渐降至最低。在脐血基质细胞作为滋养层的扩增体系中，加入相应的细胞因子可以使脐血造血细胞明显扩增，其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合基质细胞培养体系的扩增作用最强。结论： 应用细胞因子可以体外培养脐血前体基质细胞产生脐血基质细胞,并可在该基础上形成造血微环境支持体外造血。     

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

高增殖潜能内皮祖细胞促进脐血造血祖细胞体外扩增

目的：研究脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的能力。方法：利用第3代的HPP—EPC联合细胞因子培养脐血造血干／祖细胞,分因子组、非接触培养组和接触培养组。体外培养脐血CD34＋细胞10d后,从细胞总数,CD34＋细胞数,各系造血集落形成细胞数等比较各组的扩增效率。结果：接触组细胞总数扩增倍数（44．6±8．7）倍和非接触组（39．5±7．3）倍均高于因子组（24．8±5．6）倍,P〈0．01。接触组CD34＋细胞数扩增倍数（8．8±2．1）倍高于因子组（2．9±0．6）倍和非接触培养组（3．3±0．6）倍,P〈0．01。接触组集落扩增倍数和非接触组均分别高于因子组,P〈0．05,且接触组各造血集落扩增数均分别高于非接触组,各P〈0．05。接触组扩增后CD34＋CD38＋细胞（10．8％±2．7％）明显高于因子组（4．1％±0．9％）和非接触培养组（3．8％±0．8％）,P〈0．01。结论：脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞能支持脐血CD34＋细胞体外扩增。     

人脐血基质细胞分离培养的实验研究

目的：探讨人脐血CD34^ 细胞群中分离培养造血基质细胞的可行性。方法：分离人脐血CD34^ 细胞，采用Dexter法培养，对贴壁细胞进行观察和鉴定。结果：Dexter培养9～14d(平均11．2d)开始形成基质细胞集落，15～22d(平均19．6d)集落数量最多，培养28d贴壁细胞铺满培养皿底。细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主；细胞化学染色：非特异性酯酶染色(NSE)、糖原染色(PAS)：100％阳性，过氧化物酶染色(POX)：阴性，碱性磷酸酶(ALP)：28％阳性；免疫组化染色：CD106：阳性96％，CD29：93％阳性，CD44：98％阳性，CD45：阴性，CD50：62％阳性，纤维粘连蛋白(Fn)：92％阳性，层粘连蛋白(Lm)：74％阳性，胶原Ⅳ：83％阳性。结论：人脐血中存在造血基质细胞的前体细胞。     

人骨髓干细胞分离及其向神经细胞诱导分化的实验研究

目的研究骨髓间充质细胞向神经样细胞诱导分化的能力,探讨利用其治疗神经损伤疾病的可行性。方法采用直接分离培养法从人骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术对其细胞特性进行鉴定,化学诱导法诱导其向神经样细胞分化,免疫组化技术验证诱导细胞特性。结果成功获得骨髓间充质干细胞,免疫表型鉴定结果为CD73、CD90、CD105表达阳性,CD14、CD34、CD45表达阴性;免疫组化染色显示诱导分化的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、GFAP和成熟神经元标志物NSE等。结论骨髓间充质细胞在特定诱导因子作用下能向神经细胞表型转化,并能稳定表达神经细胞因子,可以作为神经损伤疾病组织工程的种子细胞来源。     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.     

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的　了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法　抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果　成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论　人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。     

人外周血树状突细胞增强LAK抗HL-60活性的形态学观察

目的：对人外周血树状突细胞（ＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌ，ＤＣ）增强ＬＡＫ抗ＨＬ－６０活性时的形态学进行观察。方法：将ＬＡＫ细胞以不同效靶比与ＨＬ－６０细胞混合，再加入不同浓度的血ＤＣ。样本培养３６ｈ后，取少许涂片作Ｓ－１００蛋白免疫组化染色，其余作透射电镜标本制备。结果：涂片上可见血ＤＣ和ＬＡＫ、ＨＬ－６０细胞形成细胞簇样结构。透射电镜下可见血ＤＣ与ＬＡＫ、ＨＬ－６０紧密接触。结论：血ＤＣ与ＬＡＫ、ＨＬ－６０细胞紧密接触可增强ＬＡＫ的杀伤活性。     

人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

[目的]探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能,为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将人胚胎干细胞与人羊膜共培养 4 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,用胰酶消化后移植裸鼠皮下 20 d、 30 d及 50 d.对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析.[结果]人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下 20～ 30 d后,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构,它们可分别呈 CEA和 CK18阳性.种植 50 d后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构.[结论]研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能.     

人脐静脉内皮细胞的研究和应用

血管内皮细胞在人体多种生理和病理过程中发挥重要作用,一直以来都是研究的热点。其中使用最广泛的当属人脐静脉内皮细胞,然而就其各种亚系细胞有何特点和优劣,国内尚未见报道。现通过总结原代人脐静脉内皮细胞、延长寿命的脐静脉内皮细胞系、永生化的脐静脉内皮细胞系等在医学研究领域的应用和进展,对不同种类之间优势和局限性进行比较,从而更好地指导实际运用。     

人胚胎干细胞神经分化的方法探讨

【目的】 利用新建系的人胚胎干细胞株SYSU-7,运用胚体形成的方法,探讨不同的分化条件对胚胎干细胞神经分化的影响。【方法】 首先检测人胚胎干细胞株SYSU-7的Oct4、SSEA4(stage-specific embryonic antigen-4)、TRA-1-60和AKP(Alkaline phosphatase)等胚胎干细胞特异性标志物的表达及体内外三胚层分化的能力;之后,应用含20% Knockout Serum Replacement (KSR)的培养液和神经干细胞培养液(neural progenitor medium, NPM)分别诱导细胞形成悬浮的拟胚体(悬浮时间为4 d或7 d),然后将拟胚体贴壁于多聚鸟氨酸(Polyornithine, PO)和纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)包被的培养皿中继续培养4 ~ 10 d。在分化的不同时间点利用免疫荧光染色的方法检测胚胎干细胞和神经细胞相关的标志性抗原。【结果】 SYSU-7胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct4、SSEA4,TRA-1-60,AKP染色呈强阳性,在体内外具有向三胚层分化的潜能;在体外诱导其向神经分化,结果发现KSR培养液比神经干细胞培养液更有利于胚胎干细胞的神经分化,悬浮生长7 d的拟胚体贴壁后出现特征性的玫瑰花环样结构(rosette structure)的时间更早。数量更多。【结论】 SYSU-7细胞系具有自我更新及多向分化潜能等胚胎干细胞特性。本实验为研究人胚胎干细胞的神经分化提供了新的细胞模型和研究思路。     

人间充质干细胞对人前列腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭能力的影响

目的探讨间充质干细胞（MSCs）对人前列腺癌细胞上皮-间质转化（EMT）和侵袭能力的影响。方法以干扰素γ（IFNγ）预处理的间充质干细胞[MSCs（IFNγ）]的培养上清处理人前列腺癌PC-3细胞,观察PC-3细胞形态的变化,并以划痕实验、Transwell实验检测PC-3细胞的迁移、侵袭能力,使用实时定量聚合酶联反应（qRT-PCR）法检测EMT相关的基因E-cadherin、Vimentin、N-cadherin的mRNA表达情况。结果与PBS预处理的对照组相比,实验组的PC-3细胞有从上皮的类圆形细胞向间质的梭形细胞转化的趋势;与对照组相比,实验组中E-cadherin mRNA表达下调,而Vimentin及N-cadherin mRNA表达上调（P均〈0.05）;实验组PC-3细胞的迁移和侵袭能力均强于对照组（P〈0.05）。结论 IFNγ预处理的MSCs可促进前列腺癌细胞发生EMT,并使得前列腺癌细胞迁移、侵袭能力增强。     

人类胚胎干细胞研究中的伦理学问题

目的 探讨人类胚胎干细胞研究中的伦理学问题。方法 由人类胚胎干细胞研究所引发的伦理学争论及带来的伦理忧患，导出应注意的医学伦理方面的问题。结果 人类胚胎干细胞研究应遵循一定的伦理原则。结论 医学伦理学应规范和引导人类胚胎干细胞研究。