乙肝肝纤维化血清标记物筛选的初步研究

目的:比较乙型肝炎肝纤维化患者和正常对照的血清蛋白标记物并建立相关筛选模型。方法:通过SELDI-TOF-MS技术对38例乙肝肝纤维化患者和18例健康者的血清进行蛋白质谱检测分析,并建立诊断模型以鉴别乙肝肝纤维化。结果:共检测出91个峰值,12个为差异蛋白峰,其中6个在纤维化组高表达,6个在纤维化组低表达。用质荷比为M8596的差异蛋白建立的诊断模型最优,其特异度为84%(32/38),灵敏度为67%(12/18),阳性预测值为0.060,阴性预测值为0.994。结论:健康组和乙肝肝纤维化组的血清蛋白表达存在着差异,SELDI技术在乙肝肝纤维化血清标记物筛选方面具有较好的临床应用前景。     

狗肝菜多糖对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1表达的影响

目的研究中药狗肝菜多糖对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠肝组织中基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1,MMP-1)及基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissueinhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)蛋白表达的影响。方法用二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型,不同浓度狗肝菜多糖干预后,取肝脏常规制片并HE染色,观察各组大鼠肝组织病理学改变,免疫组织化学方法检测各组大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1蛋白表达的情况。结果狗肝菜多糖高、中剂量组中大鼠肝组织MMP-1蛋白表达较模型组明显升高(P<0.05),狗肝菜高、中剂量组中大鼠肝组织TIMP-1蛋白表达较模型组明显降低(P<0.05)。结论狗肝菜多糖具有显著的抗肝纤维化作用,其机制可能与提高MMP-1表达,降低TIMP-1蛋白的表达而调控细胞外基质的代谢有关。     

赖氨大黄酸对胆汁淤积性肝纤维化大鼠Smad2、Smad3表达的影响

目的探讨赖氨大黄酸(RHL)对胆汁淤积性肝纤维化模型大鼠Smad2、Smad3表达的影响。方法采用胆总管结扎(BDL)的手术方法建立大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型,将大鼠随机分为5组:对照组、模型组、赖氨酸组、低剂量RHL组[35mg/(kg·d)]、高剂量RHL组[70mg/(kg·d)]。应用实时荧光定量PCR的方法检测大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3mRNA的相对表达量。Western blot的方法检测Smad2、Smad3蛋白时相对表达量的变化。结果与模型组大鼠比较,经RHL治疗后胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组大鼠相比,经RHL治疗后胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3蛋白的相对表达量降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论 RHL能够抑制肝纤维化的发展,可能是通过抑制Smad2、Smad3mRNA和蛋白的表达,阻断TGF-β1/Smads信号传导通路实现的。     

SELDI蛋白质芯片技术在肝癌中的应用

目的应用SELDI蛋白质芯片技术筛选甲胎蛋白(AFP)低浓度阳性的肝癌患者和肝病患者的血清差异蛋白表达谱,并构建相应的诊断模型。方法应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术和CM10芯片分别检测AFP低浓度阳性肝癌患者28例与34例肝病患者的血清蛋白表达谱,获得差异蛋白峰并建立疾病诊断模型。结果在质荷比2 000～50 000范围内共检测到39个蛋白峰,29个蛋白峰差异有统计学意义(P<0.05),其中在AFP低浓度阳性肝癌组血清中有5个蛋白峰上调,24个蛋白峰下调。以质荷比为6 452构建的诊断模型中区分AFP低浓度阳性肝癌患者与肝病患者的准确率为85.5%(53/62),灵敏度为82.1%(23/28),特异度为88.2%(30/34),阳性预测值为85.2%(23/27),阴性预测值为85.7%(30/35),阳性似然比为6.982,阴性似然比为0.202。结论应用SELDI蛋白芯片技术建立的疾病诊断模型能在整体上提高血清AFP低浓度阳性结果的肝癌诊断效率。     

食管鳞癌血清WCX2蛋白芯片诊断模型的研究

目的　分析食管鳞癌血清蛋白表达谱的改变 ,筛选并建立食管鳞癌血清标志物诊断模型。方法　采用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱 (SELDI TOF MS)技术分析 199例食管鳞癌患者和 10 6名性别、年龄匹配的健康人血清 ,获得WCX2蛋白芯片表达图谱。用BiomarkerPattern软件分析食管癌差异蛋白并初步建立诊断模型。扩大样本量 ,通过盲法分析进一步验证诊断模型。结果　在分子量 0～ 5 0 0 0 0范围内 ,共检测到 92个差异蛋白峰 ,其中 34个差异有显著意义 (P <0 0 5 )。建立了由 12个差异蛋白组成的食管鳞癌诊断模型 ,其敏感性为 91 5 % (5 4 / 5 9) ,特异性为86 9% (5 3/ 6 1)。扩大样本盲法验证结果其敏感性为 85 % (119/ 14 0 )、特异性为 84 4 % (38/ 4 5 )。结论　由 12个差异表达蛋白及其特定组合构成的诊断模型可以区分食管鳞癌与健康人     

在CCl4诱导的大鼠肝脏纤维化模型中肝功、肝脏纤维化程度的监测

目的对肝纤维化实验动物模型的肝功能和肝纤维化程度等指标进行评估。方法肝纤维化大鼠模型的制备,肝纤维化指标。血清透明质酸(HA),层粘连蛋白(LN),Ⅲ型前胶原(PCⅢ),Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)。肝功能指标:①反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标:总蛋白TPROT(g/L),白蛋白ALB(g/L),球蛋白GLB(g/L);②肝细胞受损的指标:谷草转氨酶AST(U/L),谷丙转氨酶ALT(U/L),胆碱脂酶CHE(U/L);③反映肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的指标:总胆红素TBILI(μmol/L),直接胆红素DBILI(μmol/L),间接胆红素IBILI(μmol/L),总胆汁酸TBA(μmol/L);④胆汁淤积指示酶:谷氨酰转肽酶GGT(U/L),碱性磷酸酶ALP(U/L)。结果纤维化肝脏的形态学和病理学结果显示的大鼠的肝纤维化处于终末期状态;对于肝纤4项,除层粘连蛋白(LN)外,正常组和肝纤维化组的大鼠有显著性差异;对于肝功15项,除了总蛋白(TPROT)和胆碱酯酶(CHE)外,正常组和肝纤维化组的大鼠有显著性差异。结论肝纤维化大鼠的肝纤维化和肝功指标对对照组相比有显著性差异,与肝纤维化的病理和形态学检测相一致。     

水飞蓟宾卵磷脂复合物对肝纤维化大鼠肝脏中TIMP-1表达的影响

目的：应用二甲基亚硝胺（DMN）建立肝纤维化大鼠模型，研究水飞蓟宾卵磷脂复合物（SPC）对纤维化肝组织中TIMP-1表达的影响。方法：70只大鼠随机分为正常对照组、模型组、SPC干预组、模型对照组及SPC治疗组。采用DMN腹腔内注射的方法建立肝纤维化大鼠模型。按6期分类法评价各组肝纤维化程度。应用RT—PCR检测各组肝组织中TIMP-1 mRNA水平；应用免疫组织化学技术检测各组动物肝组织TIMP-1的表达。结果：SPC干预组与治疗组的大鼠肝纤维化程度、肝组织中TIMP-1 mRNA水平及肝组织中TIMP-1的阳性表达均分别较模型组与模型对照组显著减轻与下降。结论：SPC能明显改善纤维化肝组织病理改变和减轻肝纤维化程度，抑制TIMP-1的表达是其抗肝纤维化的机制之一。     

检测子宫内膜异位症患者血清中差异表达蛋白的研究

目的：检测子宫内膜异位症（内异症）患者血清中差异表达的蛋白。方法：采用表面增强激光解吸／离子化飞行时间质谱（SELDI—TOF—MS）技术，选用WCX2蛋白质芯片对50例内异症及48例对照组血清标本进行检测以筛选内异症血清中差异表达的蛋白。结果：在Mr 0～50000范围内，检测出106个蛋白峰。内异症患者血清中差异表达的蛋白峰有4个。将发现的差异蛋白峰在Swiss蛋白数据库中搜索，发现Mr 9280蛋白峰与玻璃粘连蛋白Vitronectin相符。Vitronectin属于整合素家族，在内异症的粘附、侵袭、血管形成过程中起重要作用。其他的蛋白峰没有发现与之相匹配的蛋白，提示可能为新的蛋白质。结论：内异症患者血清中存在差异表达的蛋白，其对内异症的早期诊断具有一定的临床意义。SELDI蛋白芯片技术是一种快速、简单易行、样本用量少、高通量、重复性好的分析方法，具有广阔的临床应用前景。     

大鼠肝脏白细胞介素-1α和白细胞介素-6的表达与肝纤维化的相关性分析

目的:观察白细胞介素-1α(IL-1α)和白细胞介素-6(IL-6)在肝纤维化大鼠肝组织中的表达并分别分析它们与肝纤维化的相关性.方法:用二甲基亚硝胺建立大鼠肝纤维化模型,并以秋水仙碱进行抗纤维化处理.大鼠肝脏组织的石蜡切片分别进行HE染色和免疫组织化学染色,观察肝脏病理学变化和IL-1α、IL-6表达,并检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸 (HA)、层粘连蛋白(LN)水平.结果:(1)肝纤维化模型组大鼠IL-1α、IL-6的表达水平均显著高于正常对照组和秋水仙碱治疗组(P ＜0.01).(2)IL-1α、IL-6的表达分别与肝纤维化病理学分级、HA、LN明显相关(P＜0.01).结论:(1)细胞因子IL-1α、IL -6在肝纤维化形成中发挥重要作用;(2)肝脏IL-1α、IL-6的表达水平可反映肝纤维化程度,可作为药物疗效评价的客观指标之一.     

Wnt信号通路对酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的影响以及整合素连接激酶的调节作用

目的:研究Wnt信号通路对酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的影响以及整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的调节作用。方法:60只Wistar雄性大鼠,随机分为正常对照组和模型组,采用白酒辅以玉米油、吡唑混合食料灌胃的方法制备大鼠酒精性肝纤维化模型,于造模12周后,采用免疫组化法检测大鼠肝组织α-SMA、β-catenin蛋白的表达,并进一步通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠肝组织ILK mRNA的表达。结果:正常肝组织中有少量β-catenin、α-SMA蛋白和ILK mRNA的表达,模型组大鼠肝组织中β-catenin、α-SMA蛋白和ILKmRNA的表达明显升高(P<0.01)。β-catenin的表达量与α-SMA的表达呈正相关(r=0.913,P<0.01),ILK的表达量与β-catenin的表达亦呈正相关(r=0.880,P<0.01)。结论:酒精性肝纤维化发生发展过程中,Wnt信号通路在肝星状细胞活化的过程中可能发挥了重要的作用,ILK可能通过调节Wnt信号通路间接发挥了促进肝星状细胞活化的作用。     

羟基红花黄色素A对实验性大鼠肝纤维化TGF-β1-CTGF的影响

目的探讨羟基红花黄色素A(HYSA)抗四氯化碳所致肝纤维化的作用及对TGF-β1/CTGF表达的影响,为探索HYSA抗肝纤维化治疗的应用提供实验依据。方法将SD大鼠36只随机分为对照组、模型组和HYSA组(每组12只),以四氯化碳制备大鼠肝纤维化模型,HYSA组给予10 mg/kg HYSA治疗,8周后通过HE染色和Masson染色对肝纤维化程度进行评分;免疫组织化学观察TGF-β1、CTGF表达。结果 HYSA组与模型组相比,在纤维沉积面积[(2.168±0.160)%vs.(3.984±0.398)%]、纤维化评分(9.250±4.126 vs.19.333±3.448)、TGF-β1表达(0.184±0.018vs.0.287±0.019)及CTGF表达(0.082±0.011 vs.0.129±0.015)差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 HYSA可明显减轻四氯化碳所致的肝纤维化的程度,HYSA可能通过抑制TGF-β1和CTGF的表达发挥抗肝纤维化的作用。     

雷帕霉素与大鼠肝纤维化演变的相关研究

的肝纤维化动物模型大鼠应用雷帕霉素后,检测大鼠肝组织切片中转移生长因子（TGF-β1）表达,探讨雷帕霉素与肝纤维化病理演变的相关性。方法作者将实验大鼠随机分为3组：①正常对照组大鼠（A组）;②肝纤维模型组大鼠（B组）;③肝纤维模型灌注雷帕霉素组（C组）。C组大鼠按2mg/kg体重胃内灌注雷帕霉素,每天1次,持续2周。3组大鼠同期处死,取肝组织进行形态学及组织学研究分析。结果 3组大鼠肝组织切片经HE及免疫组织化等染色后,图片经Image-pro plus 6.0图像分析软件整理。A、B、C 3组大鼠肝组织切片中TGF-β1表达呈显著性差异,具有统计学意义（P〈0.01）。结论转化生长因子表达在肝纤维化的发生发展中具有重要的正相关性作用,实验中B组大鼠肝组织内TGF-β1高表达,加重大鼠肝组织的纤维进程,本实验显示雷帕霉素具有调控降低肝组织内TGF-β1的表达,缓解模型大鼠肝脏纤维变性的进程。     

血管性痴呆肾虚证与蛋白指纹图谱的相关性研究

目的：通过分析血管性痴呆肾虚证与非肾虚证患者间的差异表达蛋白，为脑梗死后血管性痴呆中医辨证分型提供可行的客观依据。方法采用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术及PBSⅡc型蛋白质芯片，检测47例血管性痴呆肾虚证与非肾虚证患者以及13例健康者的血清蛋白指纹图谱。对相同质荷比的差异表达蛋白峰值做线性分类分析，经过进一步优化试验参数，初步确定血管性痴呆不同证型指纹图谱数据库。结果在相对分子质量1000～50000范围内，脑梗死后发生血管性痴呆患者与健康者中共检出25个差异表达蛋白质峰（P＜0．05），血管性痴呆肾虚证与非肾虚证患者中共检出15个差异表达蛋白质峰，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论SELDI-TOF-MS结合蛋白质芯片技术能够快速初步筛选出血管性痴呆肾虚证与非肾虚证患者血清中的特异表达标志物。     

特发性肺纤维化患者支气管肺泡灌洗液中特异性蛋白标记物研究

目的 分析特发性肺纤维化(IPF)患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白质谱变化,寻找特异性蛋白标记物,评价这些标记物对IPF的诊断价值及临床应用前景.方法 收集IPF患者及对照组BALF标本,应用表面增强激光解析/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术筛选差异蛋白.通过非线性支持向量机方法建立诊断模型,并留一交叉验证法评估各模型的预测效果.结果 IPF患者BALF中筛选出8个表达有显著差异的蛋白质峰,其中检测效率最高的4个低表达蛋白质峰质荷比(m/z)分别为1947.634、1975.519、2488.535及4950.230.以这4个蛋白质峰组合建立诊断模型,其特异性和敏感性均为100%.结论 应用SELDI-TOF-MS技术分析获得的低分子量蛋白质峰在诊断中具有较高的灵敏度和特异性,这些小分子可能在IPF发病中起重要作用.     

应用金芯片技术预测肾功能损害的临床应用研究

目的探讨利用金（Au）芯片检测尿蛋白质指纹图谱在预测肾功能损害中的应用价值。方法利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术及Au芯片检测186例肾病患者和188例对照者尿蛋白质指纹图,分析肾病患者与对照组尿蛋白质表达差异并筛选标志蛋白质,结合人工神经网络（ANN）技术建立智能预测模型,评价其诊断肾病的应用价值。对部分差异蛋白质通过电喷雾四级杆飞行时间质谱（ESI-Q-TOF）进行鉴定。用免疫散射比浊法检测尿微球蛋白并与蛋白质指纹图谱结果比较,评价SELDI-TOF-MS检测性能。结果肾病患者与对照者尿中共检测到214个蛋白质峰,有69个蛋白质峰差异有统计学意义（P〈0.05）,筛选其中质荷比（m/z）11 735、23 770、51 720、58 720、67 650、80 045、91 240蛋白质建立的ANN模型预测肾功能损害的灵敏度为98.8%（85/86）,特异度为96.6%（85/88）。蛋白鉴定结果表明m/z 11 735、23 770、67 650、80 045蛋白质分别为β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、白蛋白、转铁蛋白。SELDI-TOF-MS检测微球蛋白较免疫散射比浊法更灵敏。结论基于Au蛋白芯片技术的尿蛋白质指纹图谱检测,可快速、灵敏、高通量的显示尿蛋白质表达情况,对诊断肾损伤、判断蛋白尿类型及治疗评价具有重要的应用价值。     

川芎嗪和siRNA沉默转化生长因子β1干预大鼠肝星状细胞结缔组织生长因子的表达

背景：作者前期研究发现川芎嗪可以通过抑制肝星状细胞的增殖、阻抑p38MARK信号通路、下调结缔组织生长因子的表达等多途径发挥抗肝纤维化的作用。一般认为转化生长因子β1是促进纤维化发生最重要的细胞因子,结缔组织生长因子是转化生长因子β1的下游效应介质,siRNA靶向抑制转化生长因子β1可能成为治疗肝纤维化的新方法。目的：观察川芎嗪及化学合成的siRNA转化生长因子β1对大鼠肝星状细胞结缔组织生长因子表达的影响。方法：体外培养大鼠肝星状细胞,从3条siRNA转化生长因子β1中筛选一条有效的基因沉默片段,然后利用脂质体转染试剂共同转染培养24h的细胞作为转染组,并设计空白对照组、转染试剂组、川芎嗪组及联合治疗组。结果与结论：与空白对照组相比,转染组、川芎嗪组、联合治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原及结缔组织生长因子mRNA表达均下调（P〈0.05）。在转染组、川芎嗪组及联合治疗组,结缔组织生长因子蛋白表达均下调（P〈0.05）;培养上清液中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量均降低（P〈0.05）。结果表明,siRNA沉默转化生长因子β1基因能下调结缔组织生长因子的表达,减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。川芎嗪也能下调结缔组织生长因子的表达,但对Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的抑制作用更加显著,提示川芎嗪抗肝纤维化可能是多种作用靶点。     

骨髓间质干细胞培养液上清对肝星状细胞增殖及纤维化的影响

背景：利用骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的研究取得了一定的效果,但研究其培养液上清治疗肝纤维化的并不多。目的：观察大鼠骨髓间质干细胞培养液上清抑制肝星状细胞增殖及活化的可能性。方法：实验组1,2将骨髓间质干细胞培养液上清加入6孔板内处理肝星状细胞,分别为2mL培养液上清/孔,1mL培养液上清＋1mL完全培养基/孔;对照组为肝星状细胞单独培养（2mL完全培养基/孔）。流式细胞仪分析细胞周期并观察抑制效果,RT-PCR检测肝星状细胞内转化生长因子β、金属蛋白酶抑制因子2、胶原蛋白ⅠmRNA的表达情况。结果与结论：加入骨髓间质干细胞培养液上清后,实验组1中的肝星状细胞增殖与对照组相比受到抑制,且抑制率随处理时间的延长而增多（处理72h〉处理48h〉处理24h,P〈0.05）;实验组的肝星状细胞内转化生长因子β、金属蛋白酶抑制因子2、胶原蛋白ⅠmRNA的表达较对照组均下调,且下调程度随培养液上清增多而增大（实验组1〉实验组2〉对照组）。     

大蒜素对大鼠肝星状细胞增殖的影响简

目的 观察大蒜素对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）增殖的影响,探讨大蒜素抗肝纤维化的作用及其机制.方法 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6.以四甲基偶氮唑盐（MTT）法测不同浓度大蒜素作用对大鼠肝星状细胞的影响;以碘化丙啶染色流式细胞术（PI-FCM）检测大蒜素对大鼠肝星状细胞的抑制作用.结果 HSC-T6大蒜素各浓度处理组与空白对照组及溶剂对照组比较,增殖抑制率明显增高,有显著性差异（P〈0.01）;并且大蒜素浓度增高时,HSC-T6的抑制率也逐渐增强;DATS高浓度实验组（浓度含量12 μg/ml DATS）的增殖抑制率明显高于空白对照组、试剂对照组及低浓度实验组.结论 大蒜素可以抑制HSC-T6增殖,且作用具有剂量依赖性.大蒜素抑制HSC-T6增殖的机制可能是使HSC-T6细胞周期停滞.     

Notch通路及Snail在大鼠肝纤维化发生发展中的作用

目的 探讨Notc h信号通路及锌指蛋白（Snail-1）表达在大鼠肝纤维化发生、发展中的作用。方法Wist ar大鼠60只,随机分为对照组、模型组、药物组,其中药物组及模型组皮下注射四氯化碳制备肝纤维化模型,正常组皮下注射生理盐水作为对照。从造模开始药物组以扶正化瘀方溶液4.6 g/kg灌胃,每天1次;模型组及正常组给予等量生理盐水灌胃,8周后将大鼠处死,取肝组织行苏木精-伊红染色评价肝纤维化程度,采用免疫组织化学方法检测Notch配体（Jagged-1）、Notch-1、Snail-1、E-钙黏素（E-cadherin）与A-平滑肌肌动蛋白（A-S MA）的表达。结果 模型组肝实质结构紊乱,肝细胞坏死、再生明显,胶原纤维沉积明显增加。药物组较模型组肝纤维化程度减轻,胶原沉积较少。与对照组相比,模型组肝组织Jagged-1、Notch-1、Snail-1、A-S M A表达明显升高,E-cadheri n表达下降（F=190.415～608.534,q=26.691～48.437,P〈0.01）;与模型组比较,药物组大鼠肝组织内Jagged-1、Notc h-1、Snail-1、A-S MA表达下降,E-cadherin表达升高（q=8.336～33 9.62,P〈0.01）。结论 Not ch通路及Snail蛋白可能参与肝纤维化的发生、发展过程,而抑制Notch通路及Snail蛋白可能是扶正化瘀方干预肝纤维化进展机制之一。