血清剥夺与β-巯基乙醇联合诱导孕足月羊水干细胞向神经元样细胞分化

背景:羊水干细胞是一种新的干细胞来源,具有不同于成体间充质干细胞的生物特性.目前有关羊水干细胞的研究多数以孕中期羊水为基础,对孕足月羊水所知甚少.目的:探讨孕足月羊水干细胞向神经元分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-10/2008-08在解放军总医院妇产科及解放军军事医学科学院干细胞及再生医学研究室完成.材料:孕足月羊水来自在解放军总医院行剖宫产、排除胎儿畸形的孕38～40周健康孕妇.方法:贴壁法从羊水中体外分离培养羊水干细胞,胰酶-EDTA消化传代.取第四五代细胞,用含1 mmol/L β-巯基乙醇、体积分数为20%胎牛血清、10 μg/L碱性成纤维生长因子的低糖培养基预诱导24 h,去除培养液,洗涤后加入含5 mmol/Lβ-巯基乙醇的无血清低糖培养基向神经元方向诱导4.0～5.0 h:对照组不加任何诱导剂.主要观察指标:孕足月羊水干细胞的形态及免疫表型,诱导后向神经元样细胞的分化.结果:培养的羊水干细胞呈梭形,漩涡状排列,间质干细胞来源标志CD105,CD29及1类组织相容性抗原HLA-ABC均呈阳性表达,胚胎干细胞标志性基因SSEA-4亦呈阳性表达,不表达造血干细胞标志.诱导后,细胞形态发生明显改变,胞浆回缩,出现类似轴突的细长的两极或多极突起,免疫荧光染色神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达.结论:在血清剥夺与β-巯基乙醇联合诱导条件下,孕足月羊水干细胞具有向神经元样细胞分化的潜力.     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

人脐血干细胞定向分化为神经细胞的诱导方法

目的:分析人脐血干细胞在体外和体内向神经细胞分化的不同诱导条件。资料来源:应用计算机检索Medline数据库1990-01/2005-10相关脐带血干细胞向神经细胞分化文章,检索词为“umbilicalcordblood,mesenchymalstemcells,neuraldifferentiation”,分别组合进行检索,限定文章语言种类为English,同时计算机检索中文期刊数据库2000-01/2005-10相关脐带血间充质干细胞向神经分化文章,检索词为:“脐带血,间充质干细胞,神经分化”,分别组合进行检索,限定文章语言种类为中文。资料选择:初审资料,选取包括人脐血干细胞分化为神经细胞的文章。纳入标准:①脐带血间充质干细胞。②间充质干细胞向神经细胞分化。排除标准:①脐带血造血干细胞。②文献综述,重复研究,Meta分析类文章。资料提炼:共收集到68篇符合要求的文章,查找全文,选取其中近期相关文章19篇。将所有文章按照脐血干细胞诱导分化体外实验和体内实验进行分类综合。资料综合:脐带血干细胞来源丰富、采集方便、安全,且体外扩增迅速,在体外和体内一定条件下可以分化为神经细胞,然而不同的诱导条件对其分化的影响有不同,人们运用各种手段希望能找到诱导效率较高的诱导方法,包括几种化学诱导剂联合,生长因子之间配伍,化学诱导剂与生长因子联合,或应用接近生理状态的条件培养基等。在改进诱导条件的同时人们开始关注单一表型的细胞群作为实验对象是否能有效地提高诱导效率。研究者以期找到一种高效率而具有应用价值的诱导方法,为将脐带血干细胞应用于神经科学领域提供有力的证据。结论:人脐血干细胞在体外和体内一定条件下可以分化为神经细胞,应用于中枢神经系统疾病的细胞治疗具有广阔前景,然而寻找高效实用的诱导方法仍需要进一步研究。     

诱导间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前很多体内外实验都已表明间充质干细胞具有向心肌样细胞或心肌细胞分化的能力,这使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能。目的:比较诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化实验方法的异同及存在的问题。方法:以"mesenchymal stem cells,cardiomyocyte,differentiation;间充质干细胞,心肌细胞,诱导;分化"为检索词,应用计算机检索2000-12/2010-12 PubMed数据库与万方数据库,与间充质干细胞诱导分化为心肌细胞相关的文章。结果与结论:间充质干细胞向心肌细胞分化的方法主要有:①心肌细胞条件培养液:间充质干细胞在体外经药物诱导或模拟体内心肌微环境能定向诱导分化为心肌样细胞。②与希望诱导成的目的细胞共同培养:间充质干细胞可经药物诱导诱导分化为心肌细胞,也可不经任何诱导在心肌微环境中分化为心肌细胞。虽然间充质干细胞在体外心脏病理条件下可分化为心肌细胞,使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能,但其研究有待进一步完善。     

杆状病毒转导的小鼠羊水干细胞保持成骨分化潜能的实验研究

目的探讨带有绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒修饰后的小鼠羊水干细胞（nlouse amniotic fluid stem cells,mAFSs）是否仍保持成骨分化潜能。方法体外原代培养小鼠羊水干细胞,并进行成脂成骨诱导分化,鉴定多向分化潜能;体外构建并扩增重组杆状病毒（Baculovirus—CMV—GFP,By—GFP）;By—GFP体外转导小鼠羊水干细胞,流式细胞仪检测其转导效率;经Bv—GFP基因修饰后的小鼠羊水干细胞进行成骨诱导分化。结果小鼠羊水干细胞体外具有良好的增殖能力,3代后的细胞呈现较均一的梭形、漩涡状生长,且小鼠羊水干细胞体外具有成脂成骨分化潜能。体外成功构建重组杆状病毒,经Sf9细胞扩增后,极度稀释法测定其滴度可达10^9v．g／ml;Bv—GFP体外可较有效转导小鼠羊水干细胞,其转导效率为52．85％,且经Bv—GFP基因修饰后的小鼠羊水干细胞仍保持成骨分化潜能。结论小鼠羊水来源干细胞是一种理想的干细胞,杆状病毒是一种新型病毒基因载体,体外能较有效转导小鼠羊水干细胞且不改变其成骨分化潜能。经重组杆状病毒基因修饰的羊水干细胞会为今后的骨组织工程提供一种新的治疗模式。     

人脐血干细胞定向分化为神经细胞的诱导方法

目的：分析人脐血干细胞在体外和体内向神经细胞分化的不同诱导条件。 资料来源：应用计算机检索Medline数据库1990-01／2005-10相关脐带血干细胞向神经细胞分化文章，检索词为“umbilical cord blood，mesenchymal stem cells，neural differentiation”，分别组合进行检索，限定文章语言种类为English，同时计算机检索中文期刊数据库2000-01／2005-10相关脐带血间充质干细胞向神经分化文章，检索词为：“脐带血，间充质干细胞，神经分化”，分别组合进行检索，限定文章语言种类为中文。 资料选择：初审资料，选取包括人脐血干细胞分化为神经细胞的文章。纳入标准：①脐带血间充质干细胞。②间充质干细胞向神经细胞分化。排除标准：①脐带血造血干细胞。②文献综述，重复研究，Meta分析类文章。资料提炼：共收集到68篇符合要求的文章，查找全文，选取其中近期相关文章19篇。将所有文章按照脐血干细胞诱导分化体外实验和体内实验进行分类综合。 资料综合：脐带血干细胞来源丰富、采集方便、安全，且体外扩增迅速，在体外和体内一定条件下可以分化为神经细胞，然而不同的诱导条件对其分化的影响有不同，人们运用各种手段希望能找到诱导效率较高的诱导方法，包括几种化学诱导剂联合，生长因子之间配伍，化学诱导剂与生长因子联合，或应用接近生理状态的条件培养基等。在改进诱导条件的同时人们开始关注单一表型的细胞群作为实验对象是否能有效地提高诱导效率。研究者以期找到一种高效率而具有应用价值的诱导方法，为将脐带血干细胞应用于神经科学领域提供有力的证据。 结论：人脐血干细胞在体外和体内一定条件下可以分化为神经细胞，应用于中枢神经系统疾病的细胞治疗具有广阔前景，然而寻找高效实甩的诱导方法仍需要进一步研究。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景:动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞.目的:观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达.方法:采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定.取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化.结果与结论:采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化.     

诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞的分化

背景：近年来胚胎肝干细胞备受关注,该类细胞是否具有向类心肌细胞方向分化的潜能及相关的诱导分化条件,目前报道极少。目的：探讨体外环境下化学试剂诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的合适条件。方法：二甲基亚砜联合5-氮杂胞苷以不同的浓度和时间,作用于13.5d胎龄的昆明小鼠胎肝干细胞,观察诱导分化效果。结果与结论：体外环境下,0.8%二甲基亚砜＋5μmol/L5-氮杂胞苷能诱导小鼠胎肝干细胞表达心肌细胞特异性标志物,而增加诱导剂浓度及延长时间不能提高诱导效率。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞的研究与进展

骨髓间充质干细胞既具有自我更新的能力,也具有在合适的微环境里向多系横向分化的潜能,在体外可以被诱导分化为肝细胞,理论上可提供丰富的肝细胞来源.随着骨髓间充质干细胞研究的兴起,利用干细胞及器官重建治疗肝脏疾病成为一种新的治疗模式,其中寻找合适的体外诱导培养体系是当前骨髓间充质干细胞研究的焦点之一.文章较全面的总结了骨髓间充质干细胞在多种微环境下向肝细胞诱导分化的特点,各种诱导条件的优势以及存在的问题.     

脂肪干细胞体外诱导分化为平滑肌细胞的研究进展

脂肪干细胞是从脂肪组织中提取得到的一种干细胞,具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等多种细胞分化的潜能。将脂肪干细胞在一定的条件下诱导分化成为有功能的平滑肌细胞,为组织工程技术提供了理想的种子细胞。现就脂肪干细胞在体外诱导分化成为平滑肌细胞的研究进展进行综述。     

兔骨髓基质干细胞成骨诱导及复合培养的生长状况

目的:研究体外培养的兔骨髓基质干细胞的成骨诱导及复合培养生长状况。方法:体外培养兔骨髓基质干细胞,向成骨细胞方向诱导分化,并接种于三维多孔羟基磷灰石材料上,观察其体外生长状况。结果:体外培养条件下,骨髓基质干细胞容易存活,可向成骨细胞转化,并能在支架材料上贴附生长。结论:骨髓基质干细胞可在体外培养条件下大量增殖,向成骨细胞转化,并能在三维多孔羟基磷灰石材料上贴附生长。     

Turner综合征羊水干细胞的分离及特征

背景：羊水干细胞的分离培养及生物学特性相关研究取得了明显进展,但未见45,X／46,XX（Turner综合征）羊水细胞建系的报道。目的：建立体外培养人羊水来源干细胞的方法,初步探讨羊水干细胞的生物学特性。方法：孕中期羊膜腔穿刺获得1例染色体核型异常（45,X／46,XX）羊水标本,采用梯度稀释后低密度种植的方法获得羊水干细胞,体外传代培养,倒置显微镜观察细胞的贴壁生长情况,细胞染色体检查确认核型,流式细胞仪检测羊水干细胞特异性表面标志和细胞周期,进行成骨诱导分化及碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定。结果与结论：羊水干细胞在体外培养体系中增殖迅速,核型为45,X／46,XX,流式细胞仪检测羊水干细胞表达CD29、CD44、CD90和CD105间充质干细胞表面标志,不表达造血干细胞标志CD45和CD34：大部分细胞处于G1期,增殖能力强。羊水干细胞经成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性。结果可见该实验成功分离获得45,X／46,XX（Turner综合征）羊水干细胞,其增殖能力强,表现间充质干细胞的特性。     

重组人促红细胞生成素干预人源羊水干细胞向心肌前体细胞的分化

背景：研究发现人源羊水干细胞可向心肌前体细胞分化。目的：观察不同浓度重组人促红细胞生成素对人源羊水干细胞向心肌前体细胞分化的影响。方法：用含0,1.0,5.0,10.0,20.0U/mL重组人促红细胞生成素的诱导培养基诱导鉴定后的人源羊水干细胞向心肌前体细胞分化,诱导24h后换为完全培养基继续培养。结果与结论：诱导分化14d,倒置显微镜下可见细胞由长梭形逐渐变短增宽,相邻的细胞间有融合现象,似类肌管样结构,以5.0U/mL重组人促红细胞生成素的诱导分化率最高;RT-PCR检测显示重组人促红细胞生成素可促进细胞Nkx-2.5和GATA-4mRNA的表达,以5.0U/mL重组人促红细胞生成素的作用最强。说明外源性重组人促红细胞生成素能剂量依赖性促进人源羊水干细胞向心肌前体细胞分化。     

兔骨髓基质干细胞成骨诱导及复合培养的生长状况

目的：研究体外培养的兔骨髓基质干细胞的成骨诱导及复合培养生长状况。方法：体外培养兔骨髓基质干细胞，向成骨细胞方向诱导分化，并接种于三维多孔羟基磷灰石材料上，观察其体外生长状况。结果：体外培养条件下，骨髓基质干细胞容易存活，可向成骨细胞转化，并能在支架材料上贴附生长。结论：骨髓基质干细胞可在体外培养条件下大量增殖，向成骨细胞转化，并能在三维多孔羟基磷灰石材料上贴附生长。     

人胚胎干细胞在无血清mTeSR1培养基中维持培养和向内皮细胞的诱导分化

背景：传统的人胚胎干细胞培养扩增方法中应用含动物血清培养基,并依赖饲养层细胞培养,这种培养方法显著制约了干细胞的体外培养规模;另外异源动物血清成分介入,使病原污染及免疫排斥的概率显著增加。目的：明确应用无血清培养基mTeSR1对人胚胎干细胞进行长期体外培养的可行性,并建立诱导人胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的相关技术平台。方法：采用无血清培养基mTeSR1以非饲养层细胞依赖的方式体外培养、扩增人胚胎干细胞株H9。经过40余次体外传代后,于倒置显微镜下观察其生长形态,并利用免疫荧光染色方法评估其细胞表型。此外,应用条件培养基诱导H9细胞株向内皮细胞方向分化。利用免疫荧光染色技术,定量RT-PCR以及低密度脂蛋白摄取实验对该胚胎干细胞源内皮细胞的表型及功能进行评价、分析。结果与结论：mTeSR1培养基能够支持H9细胞株在体外以非饲养层依赖的方式进行长期扩增,同时维持其未分化的干细胞潜能。添加血管内皮细胞的条件培养基能够定向诱导H9细胞向内皮细胞方向分化。该胚胎干细胞源内皮细胞不但表达内皮细胞的标志基因（kdr,pecam）和标记蛋白CD31,而且还能够摄取低密度脂蛋白,形成类似微血管结构。提示实验中所提供的培养及诱导分化体系能够支持胚胎干细胞的增殖与分化行为。     

人胚胎干细胞在无血清mTeSR(r)1培养基中维持培养和向内皮细胞的诱导分化

背景:传统的人胚胎干细胞培养扩增方法中应用含动物血清培养基,并依赖饲养层细胞培养,这种培养方法显著制约了干细胞的体外培养规模;另外异源动物血清成分介入,使病原污染及免疫排斥的概率显著增加.目的:明确应用无血清培养基mTeSR(r)1对人胚胎干细胞进行长期体外培养的可行性,并建立诱导人胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的相关技术平台.方法:采用无血清培养基mTeSR(r)1以非饲养层细胞依赖的方式体外培养、扩增人胚胎干细胞株H9.经过40余次体外传代后,于倒置显微镜下观察其生长形态,并利用免疫荧光染色方法评估其细胞表型.此外,应用条件培养基诱导H9细胞株向内皮细胞方向分化.利用免疫荧光染色技术,定量RT-PCR以及低密度脂蛋白摄取实验对该胚胎干细胞源内皮细胞的表型及功能进行评价、分析.结果与结论:mTeSR(r)1培养基能够支持H9细胞株在体外以非饲养层依赖的方式进行长期扩增,同时维持其未分化的干细胞潜能.添加血管内皮细胞的条件培养基能够定向诱导H9细胞向内皮细胞方向分化.该胚胎干细胞源内皮细胞不但表达内皮细胞的标志基因(kdr,pecam)和标记蛋白CD31,而且还能够摄取低密度脂蛋白,形成类似微血管结构.提示实验中所提供的培养及诱导分化体系能够支持胚胎干细胞的增殖与分化行为.     

碱性成纤维细胞生长因子和Noggin诱导人羊水来源干细胞向神经细胞分化的差异比较

背景:相对于成体干细胞和胚胎干细胞自身存在的问题,羊水来源的干细胞系的建立,能为每一个个体建立一份自身的、具有高度增殖分化能力的干细胞储备,有望成为神经性退行性疾病细胞治疗的理想细胞来源.目的:观察Noggin和碱性成纤维细胞生长因子对人羊水来源干细胞向神经细胞分化的影响.方法:羊水标本来自怀孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得.利用CD117抗体,选用免疫磁珠法从人孕中期羊水标本中分离获得羊水干细胞,培养扩增后,通过流式细胞仪检测表面抗原表达进行鉴定.选取生长状态良好的第3代羊水干细胞,利用无血清的神经诱导培养液诱导其向神经细胞分化,分为空白对照组、基础诱导液组、Noggin诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组.倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态的变化,细胞免疫荧光检测巢蛋白、β-Ⅲtubulin和神经丝蛋白在诱导后细胞中的表达.结果与结论:利用免疫磁珠方法分离出的羊水干细胞呈CD44和HLA-ABC表达阳性,CD45和HLA-DR表达阴性.诱导2周后,碱性成纤维细胞生长因子诱导组光镜下细胞形态发生显著变化,免疫荧光染色巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白表达阳性率较高.Noggin诱导组细胞形态和染色结果与基础诱导液组无显著性差异.提示利用羊水来源的干细胞诱导分化为神经细胞的过程中碱性成纤维细胞生长因子的作用远优于Noggin.     

羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞向血管内皮细胞的体外诱导分化

背景:已证实将血管内皮细胞与具有良好组织相容性的生物材料复合,并移入体内后可增殖分化形成血管.但由于获取内皮细胞时创伤较大,所以细胞来源是一个急需解决的问题.目的:探讨羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/2009-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成.材料:羊水标本来自孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得60 mL羊水.方法:采用免疫磁珠细胞分选法去除人羊水细胞中CD44和SSEA-4阳性细胞,使OCT-4阳性胎儿间充质干细胞间接得到分离,并在体外进行培养扩增.取第3代羊水来源OCT-阳性胎儿间充质干细胞,诱导组换用含体积分数为15%胎牛血清的内皮细胞生长培养液,对照组持续用原培养液培养细胞.主要观察指标:倒置相差显微镜观察诱导过程中细胞形态变化,采用间接细胞免疫荧光法、内皮细胞吞噬Dil-acLDL法检测诱导效果.结果:诱导30 d后,镜下观察细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观,经诱导的羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞可在体外保持良好的增殖活力.诱导后的贴壁细胞eNOS和、vWF呈阳性表达,细胞胞浆内可见发出红色荧光的Dil阳性细胞;对照组细胞免疫荧光染色eNOS和vWF均呈阴性,且无红色荧光细胞出现.结论:羊水来源的OCT-4阳性的胎儿间充质干细胞在适当的体外微环境下,可诱导分化为血管内皮细胞.     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了 Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断 ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在 OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34＋造血祖细胞。     

本期专题：间充质干细胞向肝样细胞的诱导与分化（本刊中文部）

1 体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化：肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用 2 三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化 3 多种生长分化因子体外联合诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞的分化