反义TIMP1基因转染Ito细胞后对其ECM代谢的影响

目的　探讨反义TIMP1基因对Ito细胞 (贮脂细胞 )金属蛋白酶的表达和细胞外基质 (ECM )降解的影响。方法　将大鼠全长TIMP1cDNA反向插入哺乳表达载体pCI neo中 ,构建反义TIMP1基因真核表达载体 ,用脂质体介导的方法 ,将反义TIMP1基因导入Ito细胞株CFSC 2G中 ,选择稳定转染的Ito细胞株培养 ,采用RT PCR、原位杂交、免疫组化及RIA等方法 ,观察TIMP1mRNA和蛋白、MMP1mRNA和蛋白、α1(Ⅲ )mRNA、FN蛋白表达及细胞培养上清中PCI、PCⅢ、HA、LN水平的变化。结果　反义TIMP1基因能明显地抑制Ito细胞中TIMP1mRNA和蛋白的高表达 (P <0 0 1)。转基因细胞中α1(Ⅲ )mRNA、MMP1mRNA、FN蛋白的表达与未转基因细胞比较无明显变化 (P >0 0 5 )。转基因后Ito细胞培养上清中PCI、PCⅢ、HA、LN水平明显低于未转基因细胞 (P <0 0 1)。结论　反义TIMP1基因可以抑制贮脂细胞内源性TIMP1产生 ,但未影响MMP1的表达 ,从而促进了细胞外基质的降解     

贮脂细胞反义TIMP1基因转移及对细胞外基质降解的促进作用

目的：探讨反义TIMP1基因对贮脂细胞及细胞外基质降解的作用及其意义。方法：将大鼠全长TIMP1 cDNA反向插入哺乳表达载体pCI-neo中，构建反义TIMP1基因真核表达载体，用脂质体介导的方法，将反义TIMP1基因导入贮脂细胞株CFSC－2G中，选择稳定转染的贮脂细胞培养，采用RT－PCR、原位杂交、免疫组化及RIA等方法，观察TIMP1 mRNA和蛋白、α1（Ⅲ）mRNA、FN蛋白表达及细胞培养上清中PCI、PCⅢ、HA、LN水平的变化。结果：反义TIMP1基因能明显地抑制贮脂细胞中TIMP1 mRNA和蛋白的高表达（P＜0．01）。转基因细胞中α1（Ⅲ）mRNA、FN蛋白的表达与未转基因细胞比较无明显变化（P＞0．05）。转基因后贮脂细胞培养上清中PCI、PCⅢ、HA、LN水平明显低于未转基因细胞（P＜0．01）。结论：反义TIMP1基因可抑制贮脂细胞内源性TIMP1产生，促进细胞外基质的降解，为肝纤维化的逆转治疗提供了理论基础。     

间质胶原酶及其抑制因子—1不平衡表达与肝纤维化的关系＊

目的 观察实验性肝纤维化过程中间质胶原酶（ＭＭＰ－１３）及其组织金属蛋白酶抑制因子－ｌ（ＴＩＭＰ－ｌ）基因表达的不平衡性。方法 建立ＣＣｌ４中毒性大鼠肝纤维化模型,采用ＳＡＢＣ免疫组化方法和逆转录定量ＰＣＲ方法测定ＭＭＰ－１３和ＴＩＭＰ－ｌ的表达情况。结果 ＭＭＰ－１３和ＴＩＭＰ－ｌ在正常大鼠肝组织中有表达,在肝纤维化发展过程中ＭＭＰ－１３表达无显著性变化,而ＴＩＭＰ－ｌ的表达则逐渐增强,在肝硬化     

活血化瘀中药对大鼠纤维化肝间质胶原的抑制作用

目的：研究中药活血化瘀中药益肝康对CCl4和猪血清（PS）所致之两种肝纤维化模型的防治作用。方法：采用CCl4和PS10周法制作SD大鼠肝纤维化模型，含10％活血化瘀中药饲料14周结合方法。预防组在制模前4周即开始预防用药，于制模结束时停止用药；治疗组在制模结束前4周开始治疗用药，于制模结束后10周停止用药。设正常对照和模型自然恢复对照。Masson染色肝组织肝组织胶原，计算机图像分析系统分析纤维间隔数量，宽度和假小叶形成情况。结果：两种制模方法预防组和治疗组均较对照组假小叶和纤维间隔数目明显减少（P＜0．05／P＜0．01）并可使PS模型纤维间隔变薄（P＜0．05）。结论：益肝康对上述两种造模方法所致之肝纤维化均具有明显的防治作用。造模前4周即开始预防用药比造模结束前4周开始治疗用药更能有效地防止CCl4致大鼠肝纤维化的形成。     

CTGF反义寡核苷酸对大鼠肾间质纤维化的影响

[摘要] 目的 研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠肾间质纤维化的影响,探讨CTGF ASODN应用于临床的可能。方法 32只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组(sham-operation group,SOR)、单侧输尿管梗阻组(unilateral ureteral obstruction group,UUO)、CTGF错义寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotide,MSODN)对照组和CTGF ASODN治疗组。第15 d收获大鼠。碱水解法测定肾组织胶原含量;Masson染色观测肾皮质胶原染色情况;免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、纤连蛋白（fibronectin,FN）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）在肾皮质中的蛋白表达。RT-PCR检测肾皮质中α-SMA的mRNA表达水平。结果 肾皮质胶原检测CTGF ASODN组与UUO组、CTGF MSODN组比较,减少胶原含量,p均﹤0.01; Masson染色：CTGF ASODN组较UUO组、CTGF MSODN组胶原染色面积减少; 免疫组化：CTGF ASODN与UUO组、CTGF MSODN组比较,肾皮质α-SMA, FN ,TGF-β1的阳性表达面积、阳性染色强度均下降,p均﹤0.05; RT-PCR：CTGF ASODN组抑制α-SMA的mRNA表达水平,与UUO组、CTGF MSODN组比较,p均﹤0.05。结论 CTGF ASODN有效缓解UUO大鼠肾间质纤维化。     

地塞米松对肾间质成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的 探讨糖皮质激素在肾脏病治疗中可能的作用机理。方法 采用ＭＴＴ比色法和Ｌ－＾３Ｈ－脯氨酸掺入法,观察地塞米松对体外培养的肾间质成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。结果 一定浓度范围内地地塞米松抑制成纤维细胞的胶原合成,但未见其对细胞增殖有影响。结论 糖皮质激素可作用于肾间质成纤维细胞,抑制胶原的合成,从而可延缓肾间质纤维化的进程。     

反义TIMP-1对实验性肝纤维化中TIMP-1及MMP-13表达的影响

目的探讨反义TIMP-1对实验性肝纤维化中TIMP-1及MMP-13表达的影响。方法抽提TIMP-1/PCDNA3.1( )重组质粒、PCDNA3.1( )表达质粒,以脂质体Lipofectmine2000包埋;以复合因素复制肝纤维化大鼠模型,分为正常对照组(12只N)、肝纤维化组(19只C)、空质粒对照组(19只P)、反义TIMP-1组(11只AT),P组、AT组定期给予腹腔注射脂质体包埋好的PCDNA3.1( )、TIMP-1/PCDNA3.1( )质粒50μg,实验周期满时,取剩余N组(12只)、AT组(11只)、C(11只)、P(10只)肝组织;应用HE染色、VG染色观察肝组织病理形态学变化,进行肝纤维化分级,应用SABC法行切片染色,并采用图像分析系统对阳性部位行灰度值测定;采用SPSS软件做方差分析(多个样本均数的两两比较),P<0.05表示差异有显著性,病理学形态分级采用Ridit检验。结果反义TIMP-1质粒组与肝纤维化组、空质粒组相比TIMP-1、MMP-13表达明显减少(P<0.05),空质粒组与肝纤维化组无显著性差异(P>0.05);正常对照组与各实验组之间的病理学分级有显著性差异(P<0.05);反义TIMP-1质粒组病理学分级较空质粒组及有明显改善(P<0.05);空质粒组与肝纤维化组无显著性差异(P>0.05)。结论反义TIMP-1/PCDNA3.1( )真核细胞表达质粒使TIMP-1、MMP-13的表达受到抑制。     

间质胶原的免疫金标记技术的改进

为早期诊断肝纤维化，动态观察肝纤维化过程的临床指标，我们利用免疫电镜技术对大鼠肝脏的间质胶原进行了胶金标记。间质胶原抗原性较弱，标记时应保存抗原的活性，同时兼顾细胞形态的保存。因此，免疫电镜制作有一定难度。本室通过反复实验，对标本固定作了改进，摸索出...     

反义核酸抑制TGF—β1表达及对肝纤维化调节的研究

反义核酸抑制ＴＧＦ┐β１表达及对肝纤维化调节的研究博士生论文摘要ＳｔｕｄｙｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＴＧＦ┐β１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏ┐ｇｅｎｅｓｉｓｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ梁志清何振平...     

保肝复功水煎剂对大鼠肝纤维化TGFβ1、TIMP1、MMP1表达的影响

目的:为了探讨保肝复功水煎剂抗肝纤维化的作用机理。方法:通过四氯化碳致小鼠肝损伤模型,利用基因芯片技术研究TGFβ1、MMP1及TIMP1在肝组织中的表达情况。结果:保肝复功水煎剂干预性治疗使实验组大鼠肝组织MMP1表达上调,TIMP1、TGFβ表达下调。结论:保肝复功水煎剂在肝组织中具有明显使MMP1表达上调,TIMP1、TGFβ表达下调的作用,从而促进了胞外基质的降解,抑制发挥肝纤维化的作用。     

金属蛋白酶及其抑制剂在大鼠正常及纤维化肝脏中的表达

目的：了解膜型基质金属蛋白酶1（MT1－MMP）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）在大鼠正常及纤维化肝脏中的表达。方法：用60％CCl4加5％乙醇制作大鼠肝纤维化模型,利用原位杂交及免疫组化的方法检测MT－MMP,MMP2,TIMP1的表达并与正常对照组比较。结果：在纤维化肝脏中,MT1－MMP,MMP2,TIMP1主要表达在成纤维细胞、肌成纤维细胞中,以纤维间隔及汇管区最明显,血管内皮细胞有低水平表达。而正常组中仅有内皮细胞有低表达,明显弱于肝纤维化组。结论：在肝纤维化中,成纤维细胞及肌成纤维细胞是MT1－MMP、MMP2、TIMP1表达的主要细胞。     

Effects of a plasmid expressing antisense tissue inhibitor of metalloproteinase-1 on liver fibrosis in rats

Background No efficient therapy for liver fibrosis has been available. This study was aimed to provide evidence that the introduction of a plasmid expressing antisense tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) into a rat model of immunologically induced liver fibrosis can result in the increased activity of interstitial collagenase, thus enhancing the degradation of collagen.Methods Real-time nested polymerase chain reaction (RT-Nested-PCR) and gene recombination techniques were used to construct a rat antisense TIMP-1 recombinant plasmid that can be expressed in eukaryotic cells. Both the recombinant plasmid and an empty vector (pcDNA3) were encapsulated with glycosyl-poly-L-lysine and injected into rats suffering from pig serum-induced liver fibrosis. The expression of exogenous transfected plasmid was assessed by Northern blot, RT-PCR, and Western blot. Hepatic interstitial collagenase activity was detected using fluorescinisothiocyanate (FITC)-labeled type Ⅰ collagen. In addition to hepatic hydroxyproline content, hepatic collagen types Ⅰ and Ⅲ were detected by immunohistochemical staining, and the stages of liver fibrosis by Van Gieson staining.Results Exogenous antisense TIMP-1 was successfully expressed in vivo and could block the gene and protein expression of TIMP-1. Active and latent hepatic interstitial collagenase activities were elevated (P&lt;0.01), hepatic hydroxyproline content and the accumulation of collagen types Ⅰ and Ⅲ were lowered, and liver fibrosis was alleviated in the antisense TIMP-1 group (P&lt;0.01) as compared with the model group. Conclusion The results demonstrate that antisense TIMP-1 recombinant plasmids have some inhibitory effect on liver fibrosis.     

肝纤维化组织中MMP1、TIMP1的表达及其临床意义

目的 :检测肝纤维化组织中基质金属蛋白酶 1 (MMP1 )、基质金属蛋白酶组织抑制因子 1 (TIMP1 )的表达 ,为肝纤维化的诊治提供重要的分子生物学指标。 方法 :采用链霉菌抗生物蛋白 -过氧化酶联接法 (S- P法 )检测70例肝纤维化组织中 MMP1 、TIMP1 的表达。结果:(1) TIMP1 蛋白阳性表达随肝纤维化程度的加重而增强 ,并且呈正相关关系 (r=0 .92 74 ,P <0 .0 1)。 (2 ) MMP1 蛋白阳性表达随肝纤维化程度的加重无明显变化 ,无相关关系(r =0 .2 181,P >0 .0 5 )。 结论:TIMP1 与肝纤维化的发生、发展密切相关 ,随纤维化发生、发展阳性表达增强。从分子水平对肝纤维化、肝硬化病变进行评估 ,为早期诊治肝纤维化和判断预后提供依据。     

大豆异黄酮载药纳米颗粒对肝纤维化大鼠的抗过氧化作用

目的：观察大豆异黄酮载药纳米颗粒对肝纤维化大鼠的抗过氧化作用。方法采用四氯化碳灌胃法建立肝纤维化大鼠模型,随机分成对照组、肝纤维化组、空白纳米颗粒组（ SPIO组）、大豆异黄酮组（ SI组）、载药纳米颗粒组（ SI-SPIO组）,每组24只。对照组给予生理盐水尾静脉注射,其他各组除四氯化碳灌胃外,分别给予生理盐水尾静脉注射、SPIO、大豆异黄酮和SI-SPIO载药纳米颗粒尾静脉注射治疗,观察对照组和治疗组之间肝脏生化指标、过氧化损伤指标和肝脏组织学变化。结果8周后对各组大鼠的肝脏生化指标和肝纤维化程度进行评估,SI组和SI-SPIO组明显优于肝纤维化组和SPIO组;过氧化指标检测,与对照组相比,肝纤维化组和SPIO组MDA明显升高（2．45±0．77,2．69±1．01,P＜0．05）,GSH -Px 和SOD明显降低（300．74±16．25,299．18±15．57和409．77±20．46,431．56±19．25,P＜0．05）;与肝纤维化组相比,SI组和SI-SPIO组MDA明显降低（0．85±0．12,0．90±0．02,P＜0．05）,GSH-Px和SOD明显升高（340．25±11．85,366．45±14．83和467．27±16．11,485．75±22．54,P＜0．05）。 SI-SPIO组过氧化指标较SI组改善更为明显（P＜0．05）。结论大豆异黄酮具有抗氧化作用,能够抑制大鼠肝纤维化形成,载药纳米有助于药效的发挥。     

反义Smad4对大鼠纤维化肝脏金属蛋白酶及其抑制剂的调节

目的探讨反义Smad4基因对纤维化肝金属蛋白酶及其抑制剂表达的调节作用.方法通过门静脉灌注将高滴度的反义Smad4的重组腺病毒载体导入大鼠纤维化肝脏.结果RT-PCR证实肝脏内有反义Smad4的转录和表达.同时采用免疫组化检测发现,转基因组肝脏内源性Smad4表达降低,TIMP1、TIMP2的表达减少,MMP2和MMP9的表达下调.结论反义Smad4能调节纤维化肝脏内源性TIMPs和MMPs的表达,反义Smad4可能成为潜在的慢性肝病的抗纤维化工具.     

TGFβ1反义RNA对腹膜间皮细胞分泌细胞外基质的影响

目的：研究转化生长因子β1（TGFβ1）反义RNA对体外培养的人腹膜间皮细胞（HPMC）细胞外基质合成与分泌的影响。 方法：将反义TGFβ1基因真核表达载体转染HPMC，用ELISA法检测转染细胞上清液中纤维连接蛋白（FN）和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）的蛋白质水平；用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测转染细胞内FN，PAI-1和胶原Ⅰ（ColⅠ）的mRNA表达，并与未转染HPMC对照组和转染空载体组比较其变化。 结果：TGFβ1反义RNA转染HPMC后，与对照组相比，转染24 h后，FN，ColⅠ，PAI-1 mRNA分别下调17％，26％，9.6％；转染48ｈ后 FN，PAI-1蛋白含量亦明显下降（P<0.05）。 结论：人反义TGFβ1基因真核表达载体可抑制HPMC合成细胞外基质，在腹膜纤维化的研究及防治中有潜在的应用价值。     

肝纤维化时Ⅳ型胶原酶与金属蛋白酶组织抑制因子-1的表达

目的 研究肝纤维化时Ⅳ型胶原酶（ＭＭＰ－２）和金属蛋白酶组织抑制因子－１（ＴＩＭＰ－１）在肝组织与贮脂细胞（ＦＳＣ）中的表达,探讨其对肝纤维化的作用。方法 分别从正常和ＣＣｌ４肝纤维化大鼠的肝组织及ＦＳＣ中提取ＲＮＡ,应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测ＭＭＰ－２与ＴＩＭＰ－１ ｍＲＮＡ水平。结果 正常肝脏ＦＳＣ不表达ＭＭＰ－２,仅肝纤维化时才转录;肝组织中无论量中肝纤维化时均存在ＭＭ     

抗纤抑癌方对肝纤维化大鼠细胞外基质代谢的影响

目的研究抗纤抑癌方对肝纤维化大鼠细胞外基质代谢的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法以二乙基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化模型,设复方鳖甲软肝片和秋水仙碱为对照药,观察抗纤抑癌方对该模型大鼠肝脏组织病理的影响,并通过免疫组化方法测定各组大鼠肝脏Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅳ型胶原（CollagenⅣ）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP—1）的表达．、结果抗纤抑癌方组MMP-1表达明显高于模型对照组和鳖甲软肝片组,CollagenI、TIMP-1表达明显低于模型对照组,CollagenⅣ表达明显低于模型对照组和鳖甲软肝片组。结论抗纤抑癌方具有明显的抗肝纤维化作用,其作用机制可能与增加MMP—1表达．降低TIMP-1表达．促进细胞外基质降解,减少胶原沉积等有关。     

TBM介导的肾间质纤维化中细胞外基质和金属蛋白酶的动态变化

目的　探讨实验性肾间质纤维化过程中 ,细胞外基质的变化规律以及金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制剂的表达。方法　用TBM抗原、福氏完全佐剂和百白破疫苗免疫Wistar大鼠 ,诱导出自身免疫性肾小管间质性肾炎 (TIN)和肾间质纤维化 ,采用免疫组织化学方法观察不同时相细胞外基质 (fibronectin ,CollagenⅠ ,Ⅲ ,Ⅳ )的变化。结果　collagenⅣ和laminin沿着增厚的TBM增加 ,collagenⅠ和collagenⅢ在肾小管间质内 ,而fibronectin不仅存在于TBM上 ,而且存在于肾小管间质内。TIMP1从免疫后第 14d到第 2 1d逐渐在小管周的内皮和浸润的白细胞中表达增强 ;而MMP3 则表达减弱。结论　TBM介导的肾间质纤维化中细胞外基质逐渐增加 ,伴有TIMP的增加。