Construction of eukaryotic co-expression plasmid pBud-TRAIL-IL-24and its expression in cervical cancer cells

目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因和白细胞介素24( Interleutin-24,IL-24)基因的真核双基因表达载体,并观察其对宫颈癌细胞生长的影响情况.方法:采用分子克隆技术,将IL-24基因插入真核表达载体pBud-TRAIL中,构建双表达质粒pBud-TRAIL-IL-24,经酶切和测序鉴定后,转染宫颈癌HeLa细胞.荧光显微镜和免疫荧光双标技术检测TRAIL和IL-24在HeLa细胞中的表达.MTr法检测重组质粒对HeLa细胞生长状况的影响.结果:成功构建了真核双基因表达载体pBud-TRAIL-IL-24,并在宫颈癌细胞中表达;转染48 h后可见重组质粒对宫颈癌细胞生长有明显抑制作用(P＜0.05).结论:构建的双表达载体pBud-TRAIL-IL-24能在宫颈癌细胞中表达,并可有效抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,为进一步研究TRAIL和IL-24联合应用于宫颈癌的基因治疗奠定了基础.     

真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES的构建与鉴定

目的    构建白介素24（IL-24）与内皮抑素(ES)的真核双基因表达载体,检测它们在体外的表达。方法    从外周血和人胎肝组织中经 RT-PCR分别扩增IL-24与ES cDNA序列,并将其定向克隆至真核双基因表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-IL-24-ES,经酶切及测序鉴定后,转染NIH3T3 成纤维细胞。经RT-PCR及ELISA法检测IL-24和ES在NIH3T3中的表达。结果    重组真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES构建成功,IL-24与ES可在NIH3T3细胞中有效表达。结论    真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES成功构建为研究肿瘤的基因治疗提供了一定线索。     

减毒沙门菌介导的TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长抑制作用及其机制

目的:利用沙门菌作为真核质粒携带载体,在体内外观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和鸡贫血病毒VP3基因对胃癌细胞的生长抑制作用.方法:将重组质粒pBud-TRAIL、pBud-VP3、pBud-TRAIL-VP3电转化减毒沙门菌SL7207,经稳定性鉴定后直接转杂胃癌细胞株SGC-7901,24 h后利用荧光显微镜观察有无融合绿色荧光蛋白表达,MTT法检测表达载体对胃癌细胞的生长作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期变化,并用免疫组织化学方法检测该载体对胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9表达的影响.荷瘤小鼠口服携带重组质粒的减毒沙门菌,8周后通过RT-PCR检测肿瘤组织内真核载体的表达状况,并测量荷瘤瘤体大小.结果:重组质粒能够在减毒沙门菌中稳定存在,经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后能够较好的表达,转染48 h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有抑制作用,流式细胞仪观察到pBud-TRAIL-VP3能使胃癌细胞的凋亡率明显增高,TRAIL和VP3能够协同促进胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9的表达.体内实验提示pBud-TRAIL-VP3沙门菌载体能够在肿瘤组织中表达并能抑制肿瘤生长(P<0.05).结论:减毒沙门菌将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞后,体内外实验证实该载体对胃癌细胞的生长起明显抑制作用,TRAIL和VP3联合作用机制与促进Caspase-3、Caspase-9的表达有关.     

人乳头瘤病毒E6蛋白通过上调氯离子蛋白通道5的表达促进宫颈癌细胞迁移

目的: 探讨人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）E6蛋白与氯离子通道蛋白5（chloride voltage gated channel 5,CLCN5）之间的关系以及CLCN5对宫颈癌细胞迁移的影响。方法: 采用RNA干扰技术敲低HPV E6基因,实时荧光定量PCR（RT qPCR）和蛋白质印迹法检测敲低HPV E6后宫颈癌HeLa细胞中CLCN5 mRNA及蛋白的表达水平。通过PCR扩增CLCN5基因片段,并将其克隆至表达载体pCDNA3.1 3×Flag（简称pCDNA3.1）质粒中,构建重组质粒pCDNA3.1 CLCN5。将目的质粒pCDNA3.1 CLCN5及其对照pCDNA3.1质粒分别转染宫颈癌HeLa细胞,蛋白质印迹法检测CLCN5蛋白的表达。Transwell迁移实验检测过表达CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。同时,将CLCN5的小干扰RNA及其阴性对照分别转染宫颈癌HeLa细胞,Transwell迁移实验检测敲低CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。结果： RT qPCR和蛋白质印迹检测结果显示,敲低HPV E6可显著降低CLCN5的mRNA和蛋白表达水平。质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pCDNA3.1 CLCN5构建成功。蛋白质印迹检测结果显示CLCN5蛋白在宫颈癌HeLa细胞中被有效过表达或敲低。Transwell迁移实验结果表明,过表达CLCN5可促进宫颈癌细胞的迁移,敲低CLCN5可抑制宫颈癌细胞的迁移。 结论： HPV E6蛋白通过上调CLCN5的表达促进宫颈癌细胞迁移。     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

可溶性人TRAIL诱导胃癌细胞BGC-823凋亡的研究

目的 通过构建pBud-EGFP-TRAIL质粒体外观察可溶性人TRAIL蛋白(sTRAIL)对胃癌细胞BGC-823的作用.方法 以EFGP基因为报告基因,sTRAIL为目的基因,构建pBud-EGFP-TRAIL双表达质粒,鉴定酶切和测序重组体.经脂质体转染法转染体外培养的胃癌细胞BGC-823,用荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR及Western blot进一步检测sTRAIL mRNA及其蛋白的表达,MTT法检测转染后对胃癌细胞的生长抑制率,TUNEL法观察细胞的凋亡情况,流式细胞仪分析转染后胃癌细胞的凋亡率.结果 测序结果证实pBud-EGFP-TRAIL载体构建成功,质粒经脂质体转染后,通过表达sTRAIL蛋白对胃癌细胞发挥作用.MTT法显示转染该质粒的细胞的生长抑制率明显高于对照组,TUNEL法显示细胞核固缩,核染色质聚集或断裂,形成凋亡小体.流式细胞仪结果表明转染该质粒的细胞的的凋亡率明显高于对照组.结论 在体外初步证实TRAIL能诱导胃癌细胞BGC-823凋亡.     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

 【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.     

pEGFP-IL-24对B16F0细胞抑制效应的实验研究

目的:构建IL-24真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16F0细胞后,经激光扫描共聚焦显微镜观察其表达,用MTT法检测B16F0细胞的体外增殖能力。用小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤生长的抑制。结果:pEGFP-IL-24转染B16F0细胞后,LSM可观察到其表达。IL-24基因转染的B16F0细胞体外增殖能力明显受到抑制。转染IL-24的B16F0细胞体内致瘤率降低。结论:IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。IL-24基因转染的肿瘤细胞体内生长能力显著降低。     

黑素瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24抑制肺癌细胞增殖

目的：探讨黑素瘤分化相关基因-7／白细胞介素-24（mda-7／IL-24）对非小细胞肺癌细胞系H460增殖的影响。方法：将mda-7／IL-24插入真核表达载体pcDNA3中，构建重组表达载体pcDNA3-mda-7／IL-24。按照DNA和脂质体（Lipofectamine）的不同比例，将重组表达载体瞬时转染H460细胞，用RT—PCR检测mda-7／IL-24在不同转染条件下的表达，用MTT法检测转染重组表达载体后对H460细胞增殖的影响。结果：成功构建了mda-7／IL-24的重组表达载体，用SP6引物和mda-7／IL-24上游引物进行RT—PCR分析，在DNA和Lipofectamine的比例为1μg：2μl—1μg：4μl时有目的基因表达。按照1μg：2μl的比例瞬时转染重组表达质粒72h后进行MTT分析，结果表明，与未转染细胞和转染空质粒细胞相比，重组质粒pcDNA3-mda-7／IL-24对肺癌细胞H460的增殖有明显抑制作用，抑制率为18．4％。结论：mda-7／IL-24对非小细胞肺癌细胞系H460增殖具有明显的抑制作用。     

成熟型Smac真核表达载体的构建及其在膀胱癌T24细胞中的表达

目的 构建成熟型Smac基因真核表达载体．探讨成熟型Smac基因促进肿瘤细胞凋亡的可能性。方法 以Xba Ⅰ和Bam HⅠ双酶切质粒pET15b-Smac．回收酶切释放基因片断．定向插入以Xba Ⅰ和BamHⅠ双酶切的真核表达质粒pcDNA3．1（-）中．构建含有成熟型Smac基因的真核表达载体pcDNA-MT Smac．测序鉴定重组的质粒。构建的质粒转染膀胱癌T24细胞．在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导下以原位未端转移酶标记法（TUNEL）检测凋亡率。结果 以T7引物测序证实得组的质粒pcDNA-MT Smac含有成熟型Smac基因。空白对照组、50ng／ml TRAIL处理组、转染Smac组和转染Smac后50ng ml TRAIL处理组的凋亡率分别为1．6％、20．2％、1．7％和35．7％．未经TRAIL诱导．T24细胞及转染了成熟型Smac的T24细胞间凋亡率差异无显著性意义（P〉0．05）．然而作TRAIL的诱导下．转染了成熟型Smac的T24细胞凋亡率明显高于术转染细胞．其差异有级显著性意义（P〈0．01）。结论 成功构建了含有成熟型Smac基因的真核表达载体．并证实该基因可以促进TRAIL诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡．为研究成熟型Smac基因促进肿瘤细胞凋亡提供了实验依据。     

MTA1基因对宫颈癌细胞HeLa侵袭转移的影响

目的 探索MTA1基因与宫颈癌细胞HeLa侵袭迁移能力的关系.方法 以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法将含有MTA1全长基因的质粒pEGFP-C1/MTA1转染HeLa细胞,应用Western blotting检测转染效果,细胞黏附实验检测细胞黏附能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化.结果 MTA1质粒转染的宫颈癌HeLa细胞中,MTA1蛋白的表达、黏附能力、迁移及侵袭能力均明显高于转染空载体组及未转染组(P<0.05).结论 MTA1基因与宫颈癌细胞的侵袭迁移能力有关,MTA1基因可能成为宫颈癌治疗的一个新的靶点.     

沙眼衣原体蛋白激酶CT145的克隆及表达

目的 构建含沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,Ct)基因CT145的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法 利用PCR技术扩增全长CT145基因,并将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,双酶切和测序检测重组质粒正确性.将正确的重组质粒转染HeLa细胞,并用免...     

MTAl基因对宫颈癌细胞HeLa侵袭转移的影响

目的探索MTAl基因与宫颈癌细胞HeLa侵袭迁移能力的关系。方法以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法将含有MTAl全长基因的质粒pEGFP—C1／MTAl转染HeLa细胞,应用Westernblotting检测转染效果,细胞黏附实验检测细胞黏附能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果MTAl质粒转染的宫颈癌HeLa细胞中,MTAl蛋白的表达、黏附能力、迁移及侵袭能力均明显高于转染空载体组及未转染组（P〈0．05）.结论MTAl基因与宫颈癌细胞的侵袭迁移能力有关,MTAl基因可能成为宫颈癌治疗的一个新的靶点。     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-2基因双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B与白细胞介素2(IL-2)双顺反子真核表达质粒。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Ag85B基因。采用亚克隆的技术从pcDNA3.1-IL-2中获得小鼠IL-2基因的cDNA片段。将两者分别定向插入真核双表达载体pIRES,构建表达两个目基因的双顺反子重组质粒,然后用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及IL-2的表达。结果:酶切分析及序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及IL-2 mRNA。结论:成功构建了结核杆菌Ag85B及IL-2基因双顺反子真核表达质粒,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA序列(CDS),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GFP-Pin1蛋白的表达。结果RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌HeLa细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GFP-Pin1蛋白高表达;经G418筛选获得单细胞克隆。结论重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。     

人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法: 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSiRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSiRNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

 目的  构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法  使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果  PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论  成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。     

RNA干扰技术用于survivin基因表达的研究

目的：构建pSUPER-SVV表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证survivin基因表达是否受到抑制。方法：设计特异性以survivin基因为靶序列的寡核苷酸序列,退火后将其连接于pSUPERbasic载体中,经测序鉴定插入序列的正确性。以脂质体转染方法将pSUPER-SVV干扰质粒转染人类宫颈癌（HeLa）细胞,应用流式细胞术和RT-PCR方法检测survivin基因的表达情况。结果：成功构建survivin的RNAi表达载体。该载体可以使HeLa细胞中survivin基因在mRNA转录水平明显降低,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.05）。利用流式细胞术检测蛋白表达水平,转染pSUPER-SVV组抑制率可达31.62%,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.001）。结论：成功构建干扰survivin基因表达的载体,转染HeLa细胞后survivin基因在mRNA转录水平、蛋白表达水平均受到明显抑制。