人增生肝外胆管上皮细胞的原代培养及组织学特点

目的 建立人增生胆管上皮细胞(BECs)的原代培养.方法 通过胶原酶消化、机械分离对不同原因引起的扩张人肝外胆管上皮细胞进行分离纯化,建立原代培养;利用免疫细胞化学和免疫荧光染色,对培养的胆管上皮细胞表达CK-19、E-cadherin、Vimentin、α-SMA和S100A4进行特性鉴定.结果 BECs的贴壁成活率高,原代培养细胞生长速度快;免疫细胞化学和免疫荧光染色显示,上皮细胞特异性标志CK-19和E-cadherin表达阳性,间质细胞标志Vimentin表达弱阳性或阴性,α-SMA表达阴性,但上皮间质表型转变标志蛋白S100A4呈阳性表达.结论 本方法经济、简便、易行,在体外成功分离培养增生的人肝外胆管上皮细胞,获得了高纯度的BECs(>98%);发现增生的胆管上皮细胞发生了上皮间质表型转变,可能是参与胆汁性肝纤维化的机制之一.     

改良的大鼠近端肾小管上皮细胞分离纯化方法

目的　建立纯度高、操作简便的大鼠近端肾小管上皮细胞分离纯化方法。 方法 Wistar大鼠无菌取肾前先心脏抽血替代原位肾脏灌注，分离肾皮质，经Ⅰ型胶原酶消化后用45% Percoll分离液制备细胞悬液直接连续密度梯度离心。所得细胞用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基原代培养并传代，根据细胞形态、细胞角蛋白18（CK18）和水通道蛋白1（AQP1）免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶化学染色进行鉴定。 结果 此简化方法获得的肾小管细胞中肾小球掺杂明显减少，培养4～5 d后细胞融合长满，呈典型上皮样细胞的鹅卵石状，其CK18、AQP1免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶化学染色几乎均呈阳性，证实所培养细胞为近端肾小管上皮细胞。 结论 改良后的分离纯化方法可获得大量高纯度近端肾小管上皮细胞，操作简便。     

定向诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的建立一套系统的体外分离、培养及诱导人骨髓基质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞的方法。方法采用人淋巴细胞分离液从骨髓中分离出BMSCs，体外培养、扩增后，加以复合神经诱导剂进行诱导，诱导期间观察细胞形态的变化，并通过免疫细胞化学鉴定诱导细胞表面标志物的表达情况。结果人BMSCs在体外分离、培养、扩增后，经复合神经诱导剂诱导48h后，部分细胞出现胞体收缩和突起伸出，呈现神经元细胞样改变。免疫细胞化学染色显示巢蛋白或鼠抗人神经丝单克隆抗体阳性，兔抗人胶质纤维酸性蛋白阴性。结论本实验成功培养并诱导人BMSCs分化为神经元样细胞，并建立了一套系统的实验方法。     

大鼠胰腺导管上皮细胞体外分离与定向分化

目的分离和纯化大鼠的胰腺导管上皮细胞，在体外培养并诱导其向胰岛细胞定向分化。方法采用胶原酶逆行灌注法消化、密度梯度离心结合不同细胞贴壁差异性分离和纯化胰腺导管上皮细胞；以角蛋白-19（CK-19）免疫细胞化学染色进行鉴定；用RMPI1640＋含体积分数为10％的胎牛血清（FBS）培养基培养促进胰导管上皮细胞增殖，1周后，更换无血清培养基DMEM／F12并加入角朊细胞生长因子等进一步促进其增殖，细胞达80％汇合时传代，加入高糖及尼克酰胺促进胰导管上皮细胞向胰岛细胞定向分化；对胰岛样结构行双硫腙染色。结果CK-19染色结果证实所获细胞绝大多为导管上皮细胞。体外培养中导管上皮细胞24h开始贴壁，14-21d达80％融合并形成细胞克隆，第28d胰岛细胞样结构形成，且被双硫腙染成猩红色。结论采用密度梯度离心结合差异贴壁法可获得纯化的大鼠胰腺导管上皮细胞，在体外培养与诱导分化条件下可生成胰岛样结构。     

兔包皮上皮细胞的分离培养和鉴定

目的:收集兔的小块包皮组织,分离培养上皮细胞,并传代增殖,为组织工程化尿道构建提供细胞来源.方法:取雄性家兔包皮小块组织,酶消化成单细胞悬液,接种后静置培养、传代.并定期观察细胞形态变化及生长增殖情况,免疫组化染色,细胞计数及MTT测定以判断细胞增殖能力.结果:分离消化后的上皮细胞生长良好,经免疫组化测定为正常上皮细胞,并传代3代,细胞数量达到植入生物支架并生长的需要.结论:家兔的包皮上皮细胞可在体外培养增殖并传代,并达到相应细胞数量.     

不同浓度过氧化脲对牙龈上皮细胞生长影响的实验研究

目的:评价不同浓度过氧化脲对体外培养的人牙龈上皮细胞生长的影响,获得不同浓度过氧化脲引起人牙龈上皮细胞凋亡的时间范围.方法:体外培养人牙龈上皮细胞并进行鉴定,采用含10％及20％过氧化脲的EpiLife上皮细胞专用无血清培养基进行培养,选取不同时间段计算细胞死亡率.结果:体外培养的人牙龈上皮细胞为多边形并呈铺路石状外观,角蛋白染色阳性,含10％过氧化脲培养基进行培养90s后细胞大量死亡,含20％过氧化脲培养基进行培养60s后细胞大量死亡.结论:过氧化脲对体外培养的人牙龈上皮细胞具有较强的细胞毒性,临床常用过氧化脲污染牙龈时间不能超过1min.     

Ⅰ型神经纤维瘤病肿瘤组织中成纤维细胞的纯化培养和鉴定

目的:探讨Ⅰ型神经纤维瘤病(type 1 neurofibromatosis,NF-1)肿瘤组织中成纤维细胞(fibroblast,FB)体外分离、培养及鉴定的方法。方法:以4例NF-1患者的神经纤维瘤组织为材料,采用组织块法分离培养FB,细胞铺满培养瓶底后传代,差速贴壁法(15min/次)纯化P1、P2代FB。倒置显微镜观察细胞形态学变化,并用免疫细胞化学方法检测成纤维细胞特异蛋白-1、波形蛋白和S-100蛋白表达情况,对培养细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约5d可见大量细胞从组织块周围迁出,20d左右达80%～90%融合。经纯化后P3代FB成纤维细胞特异蛋白-1和波形蛋白免疫组化染色阳性,阳性率分别为99.4%和99.6%;S-100染色阴性。结论:组织块培养法结合差速贴壁法可成功分离出高纯度NF-1肿瘤组织内FB,该培养方法是一种较理想的NF-1肿瘤组织FB培养方法。     

尿道移行上皮细胞与生物可降解尿道支架体外复合培养的研究

目的:研究体外培养的兔尿道上皮细胞在生物可降解性网状尿道支架上的贴附和生长增殖情况,观察其对尿道上皮细胞形态和功能的影响,利用组织工程技术培养种植细胞的尿道内支架.方法:应用机械分离与酶消化法分离培养兔尿道移行上皮细胞,并在体外行原代培养与扩增后制成细胞悬液,接种在网状尿道支架上,形成尿道移行上皮细胞-支架复合物.应用免疫组织化学、荧光染色法鉴定尿道上皮细胞及其活性,并用倒置显微镜、扫描电镜观察尿道上皮细胞在支架表面吸附与生长状态.结果:网状尿道支架具有良好的生物相容性,能使尿道移行上皮细胞增殖,不影响其活性.尿道移行上皮细胞在尿道支架上贴附生长良好,1～2天后完全贴壁,3～7天细胞生长增殖活跃,支架网眼内充满上皮细胞;长期培养仍保持尿道移行上皮细胞特性,扫描电镜可见上皮细胞与网状支架紧密贴附,适度伸展并有基质分泌.结论:网状尿道支架适合尿道移行上皮细胞黏附生长,可作为尿道组织工程的细胞载体,利用组织工程方法可获得适于移植尿道细胞的组织工程化尿道.     

体外培养的骨骼肌卫星细胞生长与分化特性的研究

目的探讨体外培养的骨骼肌卫星细胞的生长与分化特性.方法取大鼠肱三头肌,采用二步消化法分离骨骼肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养.通过生长曲线、细胞融合率研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果二步消化法适用于大鼠骨骼肌卫星细胞的分离,在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管.骨骼肌特异性蛋白α-sarcometric actin和myosin免疫化学染色显示,骨骼肌卫星细胞弱阳性,肌管强阳性.结论体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的生长与分化能力,适用于骨骼肌组织工程的构建与研究.     

阴道粘膜上皮细胞的分离培养和鉴定

目的 初步建立阴道粘膜上皮细胞体外培养方法,为阴道粘膜上皮研究提供实验模型.方法 取雌性新西兰大白兔阴道粘膜组织小块,胶原酶Ⅳ和胰蛋白酶联合消化分离法收集上皮细胞,接种于角朊细胞无血清培养液中静置培养、传代.动态观察细胞生长增殖情况,扫描和透射电镜观察超微结构,流式细胞仪测定细胞增殖周期,并进行免疫组织化学鉴定.结果 体外培养的阴道粘膜上皮细胞为二倍体细胞,增殖状态良好,细胞间可见桥粒连接,免疫组化角蛋白染色阳性.细胞的超微结构和免疫组化染色均具有上皮细胞特征.结论 在本实验条件下,体外培养的阴道粘膜上皮细胞具有较好的增殖能力,可作为阴道粘膜上皮研究的理想实验模型.