O139群霍乱弧菌毒力岛区域分子特征分析

目的 比较O139群霍乱弧菌国际标准株M045和O1群E1 Tor型霍乱弧菌国际标准株N16961基因组中毒力岛区域分子特征.方法 从MO45基因组中筛选含有毒力岛上游的VC0815基因及其上游基因片段并克隆到pNEB193中命名为pNEBVC081545,绘制pNEBVC081545的限制性酶切图谱并与N16961同段序列限制性酶切图谱进行比较.在pNEBVC081545中选择VC0815基因上游的一段侧序列进行亚克隆,测序后与N16961同段序列比较.结果 pNEBVC081545限制性酶切图谱中VC0815基因上游序列图谱中第1个碱基位置是限制性内切酶位点为KpnⅠ,第732位为Sal Ⅰ,第819位为Hpa Ⅰ,第1578位为Bgl Ⅱ,第1600位为Hind Ⅱ,第1943位为Xba Ⅰ,第3247位为EcoR Ⅰ,此段序列限制性内切酶图谱与N16961同段序列限制性酶切图谱完全相同.对Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ之间的序列进行亚克隆,并对该段序列测序,测序结果表明该段核酸序列与N16961中同段序列完全相同.结论 O139霍乱弧菌可能是E1 Tor霍乱弧菌O抗原突变而产生的菌群.     

副溶血弧菌RIMD2210633与霍乱弧菌N16961中超级整合子结构差异分析

目的确定副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)RIMD2210633与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)N16961菌株中超级整合子结构特点差异。方法 (1)使用Perl脚本搜寻RIMD2210633和N16961中superintegron(SI)中核心序列(core segment,CS)和反向核心序列(inverted core segment,ICS);(2)配对核心序列和反向核心序列,获得副溶血弧菌重复序列(V.parahaemolyticus repeat,VPR)及霍乱弧菌重复序列(V.cholerae repeat,VCR)基因组位置信息;(3)使用Perl语言脚本获得副溶血弧菌RIMD2210633以及霍乱弧菌N16961的SI中重复序列,并获得基因盒的构成和分布信息;(4)使用全局比对软件Clustal W将上一步获得的所有VPR和VCR序列进行多序列比对,使用Perl语言脚本处理比对结果以获得一致性序列;(5)使用MEGA 4.0查看多序列比对结果,并使用Perl脚本计算各位置的变异频率,据此结果来分析副溶血RIMD2210633和霍乱弧菌N16961中的弧菌重复序列以及基因盒分布的特点。结果在RIMD2210633的超级整合子鉴定了69个VPR,其核苷酸长度在91～125bp之间。在包含128个核苷酸的一致性序列中,15个为保守核苷酸位点,113个为可变核苷酸位点。在副溶血弧菌的SI中,共确定了64个基因盒,基因盒的长度范围是420～1 709bp,中位数是648bp。在霍乱弧菌N16961的超级整合子中鉴定了158个VCR,长度在117～124bp之间。在包含126个核苷酸的一致性序列中,37个为保守核苷酸位点,89个为可变核苷酸位点。N16961的SI中共存在146个基因盒,基因盒的长度范围是390～5924bp,中位数是1 518bp。结论与霍乱弧菌的VCR相比,副溶血弧菌的VPR可变区序列变异更大,与弧菌重复序列之间序列一致性高的特点不相吻合。     

霍乱弧菌O1血清群El Tor产毒株重组特征分析

目的分析霍乱弧菌O1血清群El Tor产毒株基因组的重组特征。方法在美国国立生物技术信息中心数据库中,选取分离时间从1937—2015年的292株霍乱弧菌O1血清群El Tor菌株完成图序列或草图序列,以菌株N16961的基因组序列为参照,使用snippy软件获得菌株的全基因组比对信息,利用ClonalFrameML软件对数据进行重组分析,比较大小染色体间重组数目及重组区域总长度的差异,以及不同分离地区菌株的基因组重组片段数目和总长度的差异。使用KOBAS分析工具对重组热点基因进行基因本体富集分析。结果292株霍乱弧菌菌株中,发生基因重组163株(55.8%);其中,归一化处理的小染色体重组片段数目M(P25,P75)为4.7×10^-(69.3×10^-7,2.0×10^-5),大于大染色体[2.4×10^-(63.4×10^-7,5.7×10^-6)](P<0.001);小染色体重组区域占小染色体长度的比例M(P25,P75)7.1%×10^-(53.7%×10^-6,4.8%×10^-4),大于大染色体[2.2%×10^-(52.4%×10^-6,8.4%×10^-5)](P<0.001)。分离自非洲、亚洲、欧洲、北美洲和南美洲的菌株重组片段数目M(P25,P75)分别为23(1.0,33.0)、1.0(0.0,34.0)、6.0(2.0,13.0)、0.0(0.0,1.0)和29.5(6.8,56.8)(P<0.001);分离自各大洲的菌株重组区域总长度M(P25,P75)分别为233.0(4.0,461.0)、11.0(0.0,695.5)、56.0(4.0,111.0)、0.0(0.0,9.0)和347.5(132.8,1323.5)bp(P<0.001)。富集分析结果显示,62个重组热点编码基因的功能主要集中在趋化、趋性、对外界刺激的反应、受体活性和分子转导活性。结论霍乱弧菌El Tor大小染色体的重组片段数目及区域长度存在差别,不同大洲菌株重组片段数目及重组区域总长度不同。     

单染色体霍乱弧菌基因组学与生物学特征分析

目的 研究1株罕见的两条染色体融合为单染色体的霍乱弧菌菌株的基因组及其生物学特征，并与典型的具有两个染色体的霍乱弧菌进行比较。方法 通过短读长和长读长测序相结合的方法测定及分析单染色体菌株VC6047的基因组特征，分析融合方式。通过透射电镜观察菌体形态，观察不同培养温度、pH值、盐浓度和M9以及LB培养基下菌株的生长状况，分析生物膜形成能力以及进入活的非可培养状态（viable but non-culturable, VBNC）的生物学特征。结果 菌株VC6047呈现典型的弧菌特征，染色体的融合位置对应于霍乱弧菌大、小染色体的att B位点（染色体附着位点），也是霍乱弧菌丝状溶源性噬菌体CTXΦ整合的位置。该菌株与第七次大流行菌株处于不同进化分支。培养18 h后，25℃LB培养基条件下以及在37℃，4.0%和5.0%盐浓度LB培养基中菌株VC6047生长高于对比菌株。菌株VC6047仍然具有生物膜形成能力，但相比较于其基因组高度同源的，仍为两个染色体的菌株，菌株VC6047进入VBNC的速率加快，冷适应能力有所降低。结论 大小染色体融合菌株仍基本保持应对优劣环境压力的能力，但发生了一些...     

霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析

目的分析广东霍乱弧菌（VC）代表菌株主要毒力基因和管家基因序列。方法PCR扩增霍乱弧菌的主要毒力基因（ctxAB和tcpA）和管家基因（dnaE、hlyA、mdh和recA）、基因测序、对序列进行生物信息学分析。结果不同年代分离的2株埃尔托型（EVC）产毒株和1株0139群VC产毒株的主要毒力基因序列与国内外相关报告比较，ctxA基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为99．7％～100％和98．8％～100％．ctxB基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为98．8％～100％和96．8％～100％，tcpA基因序列与EVC国际标准株N16961 100％同源。3株产毒株的dnaE、hlyA、mdh和recA基因序列同源性分别为99．8％～100％，100％，99．5％～99．8％和100％，氨基酸序列同源性分别为100％．100％，98．5％～99．3％和100％；3株产毒株和O139群VC非产毒株的管家基因序列同源性分别为97．0％～97．2％，91．8％，94．1％～94．4％，96．9％，氨基酸序列同源性分别为100％，94．6％，94．3％～98．5％和99．7％。结论广东省不同年代EVC产毒株和O139群VC产毒株的群体遗传学关系高度密切，而与O139群VC非产毒株较远，O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株。     

从食物中毒患者标本中分离鉴定海藻和腐败施万菌

目的 对两起食物中毒调查中分离到的施万菌属(Shewanella spp.)菌株进行生化和分子生物学鉴定.方法 对2007年9月29日至10月3日间,马鞍山市的两起食物中毒患者的肛拭、从业人员手拭和剩余食物标本进行采集,按照国标方法(GB/T4789),对所有标本进行增菌和选择性培养基分离培养,疑似菌落用VITEK-32和AP120E系统鉴定,用辅助生化、生长、溶血和药敏实验分析菌株特性,同时扩增16S rDNA并测序,用MEGA 4.0软件建立进化树并进行分群.结果 所有标本经增菌后接种选择性培养基,共有8份标本在TCBS和BP培养基上长出单一的菌落,在三糖铁琼脂(TSI)斜面上的主要生长特征为:产硫化氢、不产气,氧化酶阳性.8株菌经VITEK-32鉴定仪鉴定为海藻施万菌(S.algae)或腐败施万菌(S.putrefaciens),经AP120E系统鉴定为腐败施万菌.在WS、SS和EMB培养基均未检测到施万菌生长.比较施万菌的16S rDNA序列表明,其中7株为海藻施万菌,1株为腐败施万菌.没有从这8份标本中检测到其他肠道病原菌,包括霍乱弧菌、沙门菌、副溶血性弧菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌.结论 从食物中毒患者中分离到施万菌,为该菌作为可能的食物中毒病原菌提供了线索.     

1998-2009年浙江省H3N2亚型流行性感冒病毒全序列变异的研究

目的 比较1998-2009年浙江省H3N2亚型流行性感冒(简称流感)流行株HA基因进化与全基因进化状况的一致性,并探讨全基因组序列上可能存在的潜在抗原区域.方法 选择浙江省CDC流感实验室于1998-2009年流感疫情中分离保存的H3N2亚型流感流行代表株19株,采用RT-PCR法进行全基因组序列扩增,并将这些毒株与10株同期H3N2亚型流感疫苗株进行全序列及HA1基因的系统进化比较;通过氨基酸替换比较、熵值计算及正向选择位点的筛选,确定各基因上的氨基酸易变位点.结果 H3N2亚型流感病毒的全序列长度为4466个氨基酸,其中有137个氨基酸位点发生稳定变异.在HA基因上第144和158位氨基酸分别经历了4次和3次替换,NA基因的第93、143、307、370、372位氨基酸和NP基因的第450位氨基酸经历了2次替换,且HA基因和NA基因上分别有29%(12/41)和77%(24/31)的变异位点位于已知抗原决定簇之外的区域.氨基酸位点熵值分析显示,HA基因非抗原决定簇的3、225、361位,NA基因非抗原决定簇的93、143、147、150、372位,PB1基因的113、576、586位,PA基因的101、256、382、421、437位,NP基因的377、450位,M1基因的218位及M2基因的31位氨基酸均为易变位点.结论 浙江省1998-2009年H3N2亚型流感病毒在HA和NA已知抗原决定簇之外的区域与部分内部基因上,可能存在着一些尚未被发现或者新形成的抗原位点.与HA基因的系统进化比较,全序列能更为全面地反映出流感流行株之间的亲缘关系与进化规律.

Abstract：

Objective To analyze the consistency of evolution condition between HA gene and the whole genome of influenza virus subtype A/H3N2 strains isolated in Zhejiang province from 1998 to 2009,and to study the potential antigenic region on the whole genome.Methods The sequences of whole genome of 19 Zhejiang influenza virus isolates circulated from 1998 to 2009,which conserved by influenza laboratory of Zhejiang Provincial Centre for Disease Prevention and Control,were amplified using RT-PCR assays.The obtained sequences were used to conduct phylogenetic analysis with 10 contemporaneous vaccine strains.Three methods,including comparison of the amino acid substitutions,calculation of the entropy value and the filtering of positive selection sites,were used to confirm the mutable sites on each gene.Results The whole genome of influenza virus subtype A/H3N2 was 4466 amino acids in length,with 137 stable mutations.The 144,158 aa of HA gene mutate four and three times respectively; 93,143,307,370,372 aa of NA gene and 450 aa of NP gene mutate twice,and there were 29%(12/41) and 77%(24/31) mutations of HA and NA genes occurred on the non-epitope regions respectively.Analysis of the entropy value suggest that many amino acid sites on the non-epitope regions were prone to mutation,including 3,225,361 aa of HA gene; 93,143,147,150,372 aa of NA gene; 113,576,586 aa of PB1 gene; 101,256,382,421,437 aa of PA; 377,450 aa of NP gene; 218 aa of M1 gene and 31 aa of M2 gene.Conclusion Based on the whole genome of influenza virus subtype A/H3N2 strains isolated in Zhejiang province in 1998 to 2009,there may be several unknown or new antigen sites existing on the non-epitope regions of HA and NA genes and parts of internal genes.The phylogenetic tree constructed based on the complete sequence was more comprehensive than on the HA gene to reflect the genetic relationship and law of evolution among the influenza virus strains.