双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株

目的选育高产阿维菌素产生菌。方法分别以紫外线和加热灭活阿维菌素产生菌Strepto-myces avermitilis620和Streptomyces avermitilis632原生质体,并将2种灭活的原生质体用PEG4000融合,从融合株中筛选阿维菌素高产菌种。结果获得高产阿维菌素融合株StreptomycesavermitilisF32,总发酵单位达3 904 mg.L-1,其中B1a组分产量较高,达1 016 mg.L-1,分别较出发菌株S.avermitilis 620、S.avermitilis 632提高117.1%和103.6%。结论双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株是值得推广的一种选育方法。     

青霉素产生菌的原生质体融合

将细菌血红蛋白基因引入青霉素产生菌产黄青霉H－106中而获得了产黄青霉基因工程菌1M5。产黄青霉20^#是一个青霉素产量高但产孢子能力偏低的生产菌。为提高产黄青霉的产量及产孢子能力，降低产黄青霉对氧的需求，我们采用原生质体融合技术，将通过UV诱变处理的检出的产黄青霉基因工程菌1M5 Met^-缺陷型菌株和产黄青霉20^#Arg^-缺陷型菌株分别用Novozyme 234和Cellulase R-10(1∶1）混合酶处理所得原生质体按1∶1混合后加入30％聚乙醇6000融合，产物分离纯化，得到融合株C－396^#菌株，其青霉素产量和产孢子能力都有所提高，对氧的需求有所降低。     

应用双亲株灭活原生质体融合法选育林可霉素高产菌株

目的：选育高产优质林可霉素产生菌。方法：将林可霉素产生菌S78－1^#,N65-2^#的原生质体分别热灭活和紫外灭活，并将两种灭活原生质体用PEG融合，从融合株中筛选高产优质菌种。结果：获得82－201^#融合株，其摇瓶效价分别较N65－2^#,S78-2^#提高17％和52％，且色素分泌少，传代稳定性强。结论：双亲株灭活原生质体融合选育林可霉素高产菌株是值得推广的一种选育方法。     

非对称灭活原生质体融合法选育头孢菌素C高产菌株

目的选育高产头孢菌素C产生菌。方法分别以紫外线和加热灭活头孢菌素C产生菌Cephalosporium acremonium 18-U5和Cephalosporium acremonium 18-M6原生质体,并将两种灭活的原生质体经PEG4000融合,从融合株中筛选头孢菌素C高产菌株。结果获得高产头孢菌素C的顶头孢霉融合株Cephalosporium acremonium F20,发酵单位达4 655 mg.L-1。与双亲菌株相比分别提高了42.4%和34.9%。结论非对称灭活原生质体融合法选育头孢菌素C高产菌株的方法值得推广。     

酵母菌的原生质体融合

本文报道用葡萄糖为原料,以酿酒酵母 S—6和酒裂殖酵母 SP 为出发菌株,经单孢诱变选出稳定高产的 S—16及 SP—72菌株做为亲株,进行属间原生质体融合,获得的融合子 F—82耐高温产量高,40℃以下15%葡萄糖发酵产量达9.2%,比原始菌株提高12%。经鉴定该菌株为酿酒酵母变异株。     

应用原生质体融合法选育林可霉素高产菌株

将林可霉素产生菌N65—2^#、S78—1^#的原生质体分别热灭活和紫外灭活，并将灭活原生质体用PEG融合，从中获得92-201^#融合株，其摇瓶效价分别较N65—2^#、S78—1^#提高17％、52％，且色素分泌少，传代稳定性强。     

玉米赤霉原生质体融合的研究

应用0.8％纤维素酶(来自Trichoderma.Pseudokoningii)及1.0％蜗牛酶(来自Achatina fulica Ferussac)的混合酶液制备玉米赤霉(Gibberella zeae)原生质体,以30％聚乙二醇(分子量4000)0.01mol/L CaCl_2溶液(pH7.0)作融合剂,进行了原生质体的营养互补融合及双亲紫外灭活融合。在四个菌株组成的两组配对体系中(701×801,7~(AT)×8~(BT))获得了稳定的二倍体及一株四倍体。融合体HL-5及Gl-1较其直接亲本具有良好的生理及遗传性状,二者的赤霉烯酮合成能力均接近高产亲本。     

通过两种糖多孢菌属菌株原生质体融合提高多杀菌素产量研究

多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌产生的一种新型绿色环保杀虫剂，兼具化学农药的高效性与生物农药的安全性。本研究通过将红色糖多孢菌和刺糖多孢菌两种菌株做原生质体融合探究来得到高产多杀菌素的菌株。首先构建了不产红霉素的红色糖多孢菌工程菌株，然后将其与刺糖多孢菌做原生质体融合，经加有抗生素平板培养基及发酵液HPLC分析筛选，得到了产多杀菌素的4株融合菌株。基于4株融合菌株多杀菌素产量都不及起始菌株高，接着采用不加抗生素直接筛选的方法，成功筛选到若干高产多杀菌素的融合菌株，其中菌株B-2多杀菌素产量提高最为明显，较原始菌株增加了331%，并用质谱分析做了进一步的验证。融合菌株B-2后续传代培养多杀菌素产量稳定，表明遗传稳定性较好。本文对红色糖多孢菌和刺糖多孢菌原生质体融合进行了探究并且成功提高了多杀菌素的产量，这为具有优良发酵特性的红色糖多孢菌和刺糖多孢菌融合菌株的构建提供了重要基础。     

利用原生质体诱变筛选L-异亮氨酸高产菌株

在捧杆菌原生质体制备中,以单一甘氨酸代替青霉素与溶菌酶进行细胞脱壁处理,以含0.3M蔗糖的普通肉汤培养基作为再生培养基。L-异亮氨酸产生菌A6在肉汤中培养至对数期,加入0.3M蔗糖和3%甘氨酸,继续培养8h,原生质体的形成率达98%。原生质体经洗涤后的再生率为81.6%,不经离心洗涤直接涂皿的再生率为81.2%。A6菌株的原生质体经紫外线诱变处理后,再生菌株的L-异亮氨酸产量高达14.3mg/ml,比原菌株产量提高30%左右。     

利用原生质体诱变筛选L-亮氨酸高产菌株的研究

本实验以L-亮氨酸产生菌黄色短杆菌CF-435为出发菌株,制备原生质体,在原生质体形成率和再生率最佳的条件下,利用紫外线、利福平、氯化锂对原生质体进行复合处理,获得再生突变株,从中挑取单独菌落进行摇瓶发酵,筛选出高产菌株UV_3-29,在含有葡萄糖10%的培养基中发酵72h可积累L-亮氨酸26.73mg/ml,比原始菌种产酸量提高26%.     

利用亚硝酸诱变原生质体筛选L-亮氨酸高产菌株的研究

本实验以L-亮氨酸产生菌黄色短杆菌CFN-19为出发菌株。我们首先对CFN-19菌株制备原生质体,原生质体制备率为95.1%,再生率为25%,然后对原生质体进行亚硝酸、利福平、氯化锂复合诱变处理,从再生菌株中筛选出一株高产菌株H_(6-66),产酸量由原来的23.1mg/ml提高到32.6mg/ml,提高率达41%.同时又对H_(6-66)菌株进行遗传稳定性考察,考察结果H_(6-66)菌株是高产稳定菌株。     

生米卡链霉菌与北里链霉菌种间原生质体融合重组的研究

生米卡链霉菌和北里链霉菌用42％PEG4000做助融剂进行多配对原生质体种间融合,融合率为10~(-2)。同时,进行了UV灭活亲株的种间融合,融合率也为10~(-2)。采用液体培养基再生,表观融合率达10~(-1)。随机挑选形态各异的一定数量的融合子作产物分析,发现它们产生柱晶白霉素,总效价比直接亲本高5.9倍,比间接亲本高27％。高效液相色谱测定表明A_5组份从9.1％提高到43.4％。     

地中海诺卡氏菌原生质体制备、再生和利福霉素产量变化的研究

在制备地中海诺卡氏菌原生质体时需用较高浓度的溶菌酶处理,原生质体形成的量和溶菌酶的浓度有关.高浓度溶菌酶处理后形成的原生质体在再生时出现高产菌株,但高产性状不够稳定.     

金色链霉菌原生质体电融合

为了提高去甲基金霉素的发酵效价,将金霉素链霉菌产生去甲基金霉素的变株的原生质体与金霉素高产变株热灭活的原生质体,用非交流电场法和交流电场法进行了电融合。在非交流电场法实验中。先用25％PEG将原生质体聚集,再以BAEKON 2000和SDⅡ型二种基因转移仪,采用几种不同的实验参数(脉冲强度、宽度和个数)进行融合,皆未能提高融合频率。交流电场法融合实验用SD3000细胞融合仪,当原生质体在交流电场(频率0.5MHz,强度800v/cm,作用时间60s)中形成串珠状后,施加直流脉冲(脉冲强度7kv/cm,宽度20μs,间隔0.5s,个数3),融合频率为2×10~(-4)左右,比50％PEG诱导的融合频率(2.5×10~(-5)高约一个数量级。对225株融合子进行了初筛发酵和效价测定。结果表明,其中效价高菌株所占百分数高于对照组(去甲基金霉素产生菌不同营养缺陷型的融合子),而且85％以上的融合子只产生去甲基组分。尽管融合子的发酵效价皆不稳定,但经过几次自然分离后仍获得了产量比出发菌株提高一倍左右并只产生去甲基组分较为稳定的融合子菌株。     

利用原生质体诱变筛选L-亮氨酸产生菌

L-异亮氨酸产生菌钝齿棒状杆菌AS110可产L-异亮氨酸16.4mg/ml,不产生L-亮氨酸。在菌株AS110制备成原生质体再生后,结果发现90%以上的再生菌株可以产生L-亮氨酸。用紫外线诱变处理AS110的原生质体,从再生菌株中筛选出一株L-亮氨酸产生菌AS150,经分离纯化后,可产L-亮氨酸16.4mg/ml,并且不产L-异亮氨酸。     

生米卡链霉菌原生质体电融合重组研究

采用电融合新技术可提高生米卡链霉菌原生质体融合频率,并且在原生质体稳定液中加入2.5mol/L的MgCl_2,比使用PEG助融方法的融合频率高10倍。经过UV灭活高产菌株和另一脯氨酸缺陷型菌株的原生质体的电融合,其融合子的抗生素产量变异幅度大,发酵产物的各组份比例改变,经过选择获得了一新的高产菌株,麦迪霉素产量提高77％,其有效组份A_1比例增加。     

麦角菌与雀稗麦角菌种间灭活原生质体融合

探索了在麦角菌中进行省却营养缺陷型标记的种间灭活原生质体融合。亲株Ⅰ（Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅａ,麦角隐亭产生菌）用紫外线灭活（１５Ｗ,照射距离３０ ｃｍ ）７５ ｍ ｉｎ,存活率约６×１０－ ５;亲株Ⅱ（Ｃ．ｐａｓｐａｌｉ,麦角酰胺产生菌）用热灭活（５０～５２℃）６０ ｍ ｉｎ,存活率为零。融合后的再生菌落均为亲株Ⅰ的形态,其再生频率比灭活的亲株Ⅰ提高约２０ 倍,推测绝大多数为融合子。后者经５ 次传代,大多数的产碱能力与亲株Ⅰ相当或略有提高。     

苏氨酸产生菌原生质体的研究

考察苏氨酸产生菌GSR 8-25的原生质体制备及再生的最佳条件,并用紫外线(uv)诱变处理其原生质体,从再生株中筛选苏氨酸高产菌株。经多次连续诱变处理得一再生株25-20,其苏氨酸产量由出发菌株的15mg/ml提高到21.5mg/ml,提高率达43.3％.