梅毒螺旋体Tpp17基因的扩增,克隆重及表达

梅毒螺旋体 (Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍｓｕｂｓｐ .ｐａｌｌｉｄｕｍ ,Ｔｐ)脂蛋白 [相对分子质量 (Ｍｒ)为 17× 10 3]是一种很强的免疫原 ,感染后 1周内即可产生Ｍｒ 为 17× 10 3的抗体〔1〕。因此 ,我们用ＰＣＲ扩增Ｔｐ 17× 10 3脂蛋白基因 (Ｔｐｐ17) ,进行克隆 ,并对重组体ｐＭＡＬ Ｔｐｐ17进行了表达。材料和方法主要试剂 :ＰＣＲｍａｒｋｅｒ、蛋白质相对分子质量标准、λＤＮＡ/ＨｉｎｄⅢ ＥｃｏＲⅠ ,购自华美生物工程公司 ;溴化乙锭 (ＥＢ)、溴酚蓝、十六烷基 三甲基溴化胺(ＣＡＴＢ)、氨苄青霉素 ,购自Ｓｉｇ…     

梅毒螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫活性研究

目的 表达梅毒螺旋体黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫活性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot检测其免疫反应性,用重组蛋白免疫新西兰家兔,评价其免疫原性.结果 成功构建了pET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子质量约为26×103的融合蛋白;Western blot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;利用纯化的Tp0751重组蛋白免疫新西兰家兔,能诱导家兔产生特异性免疫应答,ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1∶10 240以上.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒致病过程中的作用和生物学功能奠定了基础.     

梅毒螺旋体抗原基因的克隆、表达及其在临床检验中的应用

目的　克隆、表达并纯化梅毒螺旋体相对分子质量为 47× 10 3 抗原 ,并检测梅毒患者的血清标本。方法　应用基因扩增技术分离此蛋白的全长基因 ,采用基因工程的方法 ,应用融合表达载体pGEX 2T ,重组、克隆得到带有梅毒螺旋体 47× 10 3 特异性抗原基因的重组菌株 ,经大肠杆菌表达系统获得重组融合蛋白。再经亲和层析获得纯品 ,并联合应用ELISA检测梅毒患者的血清标本 30份 ,同时检测非梅毒患者的血清标本 30份。结果　纯化后获得了梅毒螺旋体相对分子质量为 47× 10 3 的特异性抗原。ELISA检测梅毒患者血清结果均阳性。非梅毒患者血清均阴性 ,无非特异性交叉反应。结论　此项方法具有操作简便、准确的特点 ,为临床检测梅毒开辟了新的领域     

梅毒螺旋体黏附素Tp0751 核酸菌影的构建及免疫原性研究

目的:构建梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0751 的重组真核大肠埃希菌菌影(EBG)并检测其在免疫鼠中的免疫原性,为探讨新型梅毒疫苗奠定基础。方法:构建pcDNA3.1(+) / Tp0751 真核表达载体,将其装载入已构建的空EBG 中,形成重组核酸菌影pcD/ Tp0751-BG,计算装载率;将核酸菌影转染鼠源性巨噬细胞RAW264.7,Western blot(WB)鉴定目的蛋白表达。将雌性BALB/ c 鼠随机分为A(PBS)、B(空EBG)、C(空pcDNA3.1)三个对照组和D(pcD/ Tp0751)、E(pcD/ Tp0751-BG)、F(pcD/ Tp0751-BG+rTp0751)三个实验组,各组间隔两周肌注免疫共三次,检测特异性血清IgG 及生殖道黏膜SIgA、小鼠脾细胞增殖水平和分泌IFN-γ水平。结果:重组真核质粒对菌影的装载率为76.1%;WB 显示此转染细胞能有效表达重组目的蛋白。D、E、F 实验组小鼠特异性血清IgG 与生殖道SIgA 效价均随免疫次数增加而增加,各时间点均显著高于三个对照组(P<0.01),于末次加免后第8 周达到峰值,此时F 组IgG 与SIgA 效价分别为1 :102 400 与1 :12 800;首次加免2 周后,E、F 组均显著高于D 组(P<0.01);末次加免2 周后,F 组显著高于E 组(P<0.01)。末次加免后第8 周,D、E、F 组的刺激指数(SI)值与IFN-γ水平均分别显著高于三个对照组(P<0.01);E、F 组均分别显著高于D 组(P<0.01);F 组分别均高于E 组(P<0.05)。结论:Tp0751 真核质粒菌影具有良好的免疫原性,在小鼠体内诱生了有效的系统和黏膜的体液应答以及系统细胞免疫应答;异源加免较同源加免免疫效果更好。     

梅毒螺旋体TpN15抗原基因的扩增、克隆及表达

目的用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原,为进一步研制梅毒预防性疫苗和诊断试剂盒打下基础.方法采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因,然后克隆到原核表达载体pET28b中表达TpN15重组抗原蛋白.结果成功的构建了pET28b-TpN15重组表达载体,重组的TpN15蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达.结论梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为建立梅毒血清学诊断的新方法奠定了基础.     

梅毒螺旋体Tp0136活性肽段的可溶性表达、纯化及鉴定

目的 筛选梅毒螺旋体特异性抗原Tp0136的活性肽段,可溶性表达和纯化该肽段,并鉴定其免疫活性,探索Tp0136活性肽段在早期梅毒诊断中的价值.方法 通过生物信息学方法对Tp0136亲水性、B细胞表位和二级结构等进行分析,筛选出Tp0136活性肽段(Tp0136B)替代全蛋白.将Tp0136B基因插入到pET22b(+)上,在E.coli BL21中表达.镍离子亲和色谱纯化表达产物,Western blot检测其免疫反应性,免疫日本大耳白兔评价其免疫原性,免疫双扩检测其效价,以重组Tp0136B蛋白为包被抗原的间接ELISA检测早期梅毒血清抗体.结果 重组工程菌可溶性表达相对分子质量约为28×103的rTp0136B,表达率为21%,制备得到纯度大于98%的rTp0136B.纯化的rTp0136B能诱导大耳白兔产生特异性免疫应答,免疫双扩测得其效价为1:16.Western blot检测重组蛋白能与兔抗Tp0136多克隆抗体发生特异性反应.间接ELISA检测正常人血清均为阴性,而早期梅毒血清抗体的阳性率为85.5%.结论 重组表达的Tp0136活性肽段具有良好的免疫活性,预示其在早期梅毒血清学诊断中具有良好的前景.

Abstract：

Objective To express and purify recombinant Tp0136 epitope fragment, and study the immunity activity. Methods The Tp0136 selective fragment(Tp0136B) gene was devised by the surface property analysis, solvent-accessible suface calculateions, secondary structure function region analysis, and was inserted between the sites of Nde Ⅰ and Not Ⅰ in pET22b ( + ) . The recombinant plasmid was expressed in E. coli BI21. After nickel ion metal affinity chromatography, the antigenic and immune reactivity of rTp0136B was confirmed. Then indirect ELISA with the rTp0136B as coating antigen was performed to detect the anti-Tp0136 antibody in sera from 100 normal human controls and 131 primary syphilis patients. Results The rTp0136B was soluble expressed with a molecular weight of about 28 000 and was obtained with a purity of ＞98% by chromatography. Western blot proved that the rTp0136B could specifically react with anti-Tp0136 polyclonal antibody. Specific humoral response was elicited by the recombinant protein in Japan negative. The positive detection rate in sera from primary syphilis patients was 85.5%. Conclusion This result suggested that the recombinant Tp0136 epitope fragments have a satisfactory immunocompetence,which may have applications in the serodiagnosis of primary syphilis.     

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.     

梅毒螺旋体TP0772蛋白的原核表达和免疫反应性鉴定

目的 利用原核基因工程技术克隆表达梅毒螺旋体TP0772基因,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用.方法 PCR扩增获得TP0772基因,构建pET-28b-TP0772重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达,经镍柱纯化后通过质谱技术鉴定.采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性.建立基于重组TP0772抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和25份TPP阴性血清进行方法学评价.结果 PCR扩增获得约850 bp的基因片段,成功构建原核表达载体pET-28b-TP0772.目的蛋白分子量约为32kDa,以包涵体的表达形式存在,约占菌体总蛋白的30%.经质谱技术和免疫印迹分析证实重组蛋白为TP0772蛋白,并能够与梅毒患者血清发生特异性结合反应.ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为93%（28/30）和96%（24/25）.结论 通过DNA重组技术成功获得了重组TP0772蛋白,其与梅毒阳性血清具有良好的免疫反应性,为优化梅毒的血清学诊断方法奠定基础.     

金黄色葡萄球菌SPA基因的克隆、表达及纯化

目的:构建携带StaphylococcalproteinA(SPA)基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的SPA。方法:用PCR从金黄色葡萄球菌基因组中扩增SPA基因并克隆入pET32a( )载体中,在大肠杆菌BL21〈DE3〉中表达。表达产物经亲和层析进行纯化。结果:所构建的原核表达载体为高效表达载体,工程菌表达的SPA约占菌体总蛋白的40%,经亲和层析纯化后获得SPA,纯度达到99%。结论:成功地建立了制备及纯化SPA的方法,为SPA大量生产以及构建SPA融合表达体系奠定了基础。     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定

目的：构建pRSET-SEA重组表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)，进行分离、纯化及western bolt鉴定。方法：采用PCR技术，从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI100基因组DNA中获得SEA全长序列，克隆人pUC19中，进行测序，构建pRSET-SEA表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，分离、纯化及western blot鉴定。结果：PCR获得超抗原SEA基因片段，DNA测序结果与文献报道一致；构建了pRSET-SEA表达质粒，并成功地诱导表达出32000u的蛋白；Western blot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论：本研究成功地克隆了SEA全长，并进行了原核表达和分离、纯化，获得了SEA蛋白。     

人免疫缺陷病毒1(HIV-1)膜蛋白基因片段在酵母中的克隆表达

目的为获得足够量的膜糖蛋白,以便于对不同ＨＩＶ分离株膜糖蛋白的结构与功能进行进一步的研究。方法从人免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ－１）ＨＸＢ２分离株原病毒基因组的重组质粒ｐＨＸＢ２中克隆了两段膜糖蛋白基因（ＥＮＶ）片段。以酵母穿梭诱导表达质粒ｐＹＥＳ２为载体,构建了两个相应的重组表达质粒ｐＹＥＮＶ１和ｐＹＥＮＶ２;进一步利用大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因（β－ｌａｃＺ）构建了ＨＩＶ－１膜外糖蛋白ＤＮＡ片段与β－ｌａｃＺ基因的融合表达质粒。将此３种质粒分别转化单细胞真核生物酿酒酵母ＢＪ１９９１,得到的转化子经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果克隆的基因片段在酿酒酵母中产生了分子质量为５０×１０３的特异性诱导蛋白;对含此融合表达质粒的酵母转化子半乳糖诱导后表达产物的免疫检测表明,与对照菌株相比,融合表达产物具有和ＨＩＶ－１阳性血清抗体反应的抗原性。结论可通过β－半乳糖苷酶活性的测定直接指示抗原片段的表达;为表达的膜糖蛋白片段的进一步分离纯化打下了一定基础     

Eukaryotic expression of outer membrane protein Gpd from Treponema pallidum and preliminary studies on its immune response in rabbits

Treponema pallidum(Tp) ,the causative agent ofsyphilis,causes a chronic ,lifelong infection withpossible serious complications if untreated. Re-cently,the annual incidence of syphilis has beenkeeping high at home and abroad [1 ,2] . Apartfromthe serious nature of the disease itself , anumber of studies suggest that syphilis infectionmayincrease the risk of acquisition and transmis-sionof human immunodeficiency virus(HIV) [3 ,4] ,so syphilis still remains a public health con-cern worldwide . …     

鸡MxA基因的克隆、表达及生物学活性检测

目的：克隆鸡MxA基因，构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从鸡成纤维细胞（CEF）中扩增MxA，将其克隆至克隆载体pMD18-T中，筛选阳性克隆后回收目的片段，将其克隆人原核表达质粒pGEX-6p—1，构建其重组表达质粒pGEX—MxA，以IPTG诱导表达，经SDS—PAGE、鸡胚新城疫病毒干扰试验和VSV-CEF微量细胞抑制试验进行分析、鉴定。结果：经RT—PCR扩增获得的MxA序列与GeneBank报道的序列一致，SDS—PAGE和干扰试验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45000的蛋白，与GST—MxA融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了鸡MxA基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌DIL5ct中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST—MxA，为进一步探讨MxA的生物学活性，探索抗病毒药物的研发奠定了基础。     

幽门螺杆菌Mr 26 000外膜蛋白编码基因的克隆及表达

目的　构建含幽门螺杆菌 (Hp)Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的重组载体 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法　用PCR从Hp染色体中 ,扩增Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经BamHI、HindⅢ双酶切、纯化、连接后 ,构建含有目的基因的重组载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL2 1(DE30 )并表达。表达产物经纯化后 ,用ELISA法检测其抗原性。结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为HpMr 2 6 0 0 0的外膜蛋白编码基因 ,与Tomb等的报道相比较 ,有 1.1%的bp发生变异 ,1.5 1%的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr为 4 6× 10 3 ,可溶性表达产物占细菌总蛋白的 38.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。ELISA法检测显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别 ,具有良好的抗原性。结论成功地克隆并表达Mr为 2 6 0 0 0的Hp外膜蛋白编码基因 ,为Hp蛋白疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究打下了基础     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆与高效表达

目的克隆并表达幽门螺杆菌尿素酶B基因.方法提取幽门螺杆菌染色体DNA,用PCR方法扩增尿素酶B基因.将其克隆至表达载体pQE30,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达.结果分离得到了1.7kb的ureB基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基医的高效表达.在37℃诱导表达4h后,表达产物约占细菌总蛋白的34.0%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的55.8%.结论幽门螺杆菌ureB基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础.