RNA干扰对宫颈癌细胞中E6AP基因的影响及其意义

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对宫颈癌细胞系HeLa细胞E6AP基因表达及细胞增殖和凋亡的影响.方法 实验分为3组:空白对照组(未经转染的HeLa细胞)、转染阴性对照的小干扰RNA(siRNA)组及转染特异性E6AP siRNA组.采用半定量RT-PCR技术、Western blot方法 检测E6AP mRNA、蛋白表达水平,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖状况,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染E6AP siRNA 24、48、72 h后,E6AP siRNA组E6AP mRNA表达水平与对照siRNA组比较下降33%、72%、70%.Western blot结果 显示,在转染48及72 h,E6AP蛋白表达下降38%、59%.MTT法检测显示,转染HeLa细胞24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低,E6AP siRNA组与空白对照组(F=101.38,P＜0.05)、对照siRNA组(F=38.64,P＜0.05)比较,差异均有统计学意义.E6AP siRNA作用24、48、72 h后E6AP siRNA组凋亡率明显高于对照siRNA组(F=41.48,P＜0.05)和空白对照组(F=86.36,P＜0.05),差异有统计学意义.结论 体外合成的siRNA能有效封闭宫颈癌细胞中E6AP基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据.     

慢病毒介导的GATA6基因沉默对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响

目的:研究GATA6基因沉默对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响,同时探讨可能的作用机制。方法:构建靶向GATA6基因的慢病毒干扰载体,用流式细胞术确定转染效率,用RT-PCR和Western blotting法检测其对人类肝细胞癌细胞株Huh-7的干扰效果,流式细胞术检测细胞凋亡比例,Western blotting法检测各转染组Huh-7细胞NF-κB及Bcl-2蛋白表达。结果:靶向GATA6基因的慢病毒干扰载体感染肝癌Huh-7细胞后,转染效率为57.4%。GATA6在mRNA和蛋白水平的表达明显下降。GATA6沉默的肝癌Huh-7细胞凋亡比例增加(P0.05),NF-κB和Bcl-2蛋白水平表达降低。结论:利用慢病毒载体干扰技术沉默GATA6基因的表达可以明显促进Huh-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节凋亡相关蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡。靶向GATA6的RNA干扰技术在肝癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

NUCB2 siRNA对肝细胞胰岛素信号通路及细胞凋亡的影响

目的探讨靶向NUCB2基因特异性siRNA对大鼠肝细胞IAR20 NUCB2基因沉默效应、对大鼠肝细胞胰岛素信号通路及细胞凋亡的影响。方法构建合成靶向NUCB2基因的siRNA,转染IAR20细胞。Western blot检测PEPCK、G-6-Pase、InsR、IRS-1、Akt的蛋白含量及其磷酸化水平。采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,使用RT-PCR检测p53及caspase3 mRNA水平。结果转染siRNA 48 h后,IAR20细胞NUCB2表达明显降低(P均0.05)。PEPCK、G-6-Pase蛋白及mRNA表达量明显增加,同时IR、IRS-1、AKT的磷酸化表达降低(P0.01或P0.05)。IAR20细胞凋亡明显增加,p53及caspase 3 mRNA表达及cleaved caspase 3明显增加(P0.01或P0.05)。结论 NUCB2特异性siRNA能通过下调IR/IRS-1/Akt信号通路加重大鼠肝细胞胰岛素抵抗,并能够通过上调caspase 3及p53表达增加细胞凋亡。     

膜联蛋白A7低表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的 探讨膜联蛋白A7低表达对人肝癌HepG2细胞的增殖产生的影响。方法 采用Western blotting法鉴定siRNA可有效抑制膜联蛋白A7表达,然后用脂质体转染法将siRNA转染入HepG2细胞,将细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,在转染后24h、48h、72h进行细胞计数以绘制细胞增殖曲线,转染后48h进行MTT实验以检测细胞增殖活力;免疫组织化学法检测cyclinD1和Ki67的表达,Western blotting法检测cyclinD1的表达情况。结果 转染了靶向膜联蛋白A7的siRNA后48h的HepG2细胞,细胞计数和MTT实验可见siRNA干扰组细胞增殖活力较阴性对照组和空白对照组显著降低（P<0.05）;cyclinD1和Ki67蛋白表达均为siRNA干扰组细胞表达显著低于两对照组（P<0.05）。 结论 膜联蛋白A7低表达可能对HepG2细胞的增殖具有一定的抑制作用。     

STIM1 对乳腺癌细胞存活与增殖的影响及初步机制分析

目的：探讨STIM1对乳腺癌细胞存活与增殖的影响及初步机制分析。方法：以正常乳腺上皮细胞MCF-10A作为对照,Western blot检测乳腺癌 MCF7、HCC1569、MDA-MB-231、BT549细胞中STIM1的蛋白表达;将STIM1的靶向siRNA序列（STIM1-siRNA组）转染MDA-MB-231细胞,并设置阴性对照组和空白对照组,转染48 h后检测各组细胞STIM1的蛋白表达;MTT法检测转染24、48和72 h的细胞活力;流式细胞术检测转染48 h的细胞凋亡率;RT-PCR检测IL-6 和TNF-α 的mRNA表达;Western blot检测增殖相关蛋白细胞增殖核抗原（PCNA）、凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase3）及STAT3和磷酸化的信号转导与转录因子3(p-STAT3)的蛋白表达。结果：乳腺癌细胞中STIM1的蛋白表达均显著高于在MCF-10A细胞表达（P<0.05）;转染STIM1的siRNA后MDA-MB-231细胞中STIM1的蛋白表达显著低于空白对照组（P<0.05）;与空白对照组比较,STIM1-siRNA 组细胞在48 h和72 h的细胞活力显著降低,在48 h的细胞凋亡率显著升高,IL-6 和TNF-α 的mRNA表达显著降低,PCNA、Bcl-2和p-STAT3的蛋白表达显著降低,Bax和Caspase3蛋白表达显著升高。结论：STIM1基因在乳腺癌细胞高表达,通过RNA干扰抑制其表达可降低癌细胞活力,诱导细胞凋亡、提高免疫及下调STAT3信号。     

敲低膜联蛋白A7对人肝癌HepG2细胞Bcl-2和Bax表达的影响

目的 探讨敲低膜联蛋白A7表达对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法 将HepG2细胞接种于6孔板,分为3组：siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,其中干扰组只转染靶向膜联蛋白A7的siRNA,阴性对照组只转染阴性对照siRNA,空白对照组只加转染试剂。通过Western blotting鉴定膜联蛋白A7在转染后48h可被最大程度的抑制,于是在转染后48h采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,通过免疫组织化学、Western blotting和RT PCR检测Bcl-2和Bax蛋白及mRNA的表达。 结果 与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA干扰组细胞凋亡率显著增高（P<0.05）,Bcl-2蛋白和mRNA的表达均显著降低（P<0.05）,而Bax蛋白和mRNA均未发生显著变化（P>0.05）。结论 敲低膜联蛋白A7可促进HepG2细胞的凋亡,降低Bcl-2和Bax的比值。     

受翻译调节的肿瘤蛋白在PRL-3促进结肠癌转移中的作用

目的: 研究受翻译调节的肿瘤蛋白(TCTP)在肝再生磷酸酶-3(PRL-3)促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。方法: 构建载体pAcGFP-C3-PRL-3及pAcGFP-C3并分别转染至结肠癌LoVo细胞中,获得稳定表达PRL-3的LoVo-PRL-3细胞及对照细胞LoVo-control。Western blotting及real-time PCR 检测2种细胞PRL-3及TCTP表达。设计并合成特异性干扰TCTP mRNA的siRNA序列(TCTP-siRNA)和阴性对照序列(control-siRNA),并将siRNA瞬时转染至LoVo-PRL-3细胞。 在转染siRNA后24 h、48 h和72 h,Western blotting及real-time PCR 检测LoVo-PRL-3细胞TCTP表达。 CCK8-8和Transwell方法检测LoVo-control、LoVo-PRL-3及转染TCTP-siRNA和转染control-siRNA的LoVo-PRL-3细胞间增殖、迁移和侵袭能力差异。结果: 转染PRL-3可以显著上调LoVo细胞TCTP mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)。TCTP-siRNA在转染后的24 h、48 h和72 h可以有效抑制LoVo-PRL-3细胞TCTP mRNA表达(P＜0.01),同样TCTP蛋白在转染后的48 h和72 h也显著受到抑制(P＜0.01)。转染PRL-3能显著促进LoVo细胞增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.05),然而siRNA干扰抑制上调的TCTP表达后又能显著抑制LoVo-PRL-3细胞增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.05)。结论: PRL-3通过上调TCTP表达促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。用siRNA靶向抑制TCTP表达可能是预防和治疗结肠癌转移的有效手段。     

沉默c-myc基因对Jiyoye细胞增殖与凋亡的影响

目的 运用RNA干扰（RNAi）技术,探讨经慢病毒载体介导的小干扰RNA（siRNA）转染Jiyoye细胞对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以期为靶向c-myc基因的白血病和恶性淋巴瘤基因治疗提供体外实验依据。方法 设计、合成一对针对c-myc基因的c-myc-3寡聚核苷酸链和一对阴性对照c-myc- neg寡聚核苷酸链。退火,然后连接到pLVX干扰载体上,包装,慢病毒介导转染人Jiyoye细胞株。转染后培养72 h,流式细胞术检测各组细胞转染率,pLVX-c-myc-3转染Jiyoye细胞,MTT法检测细胞增殖;Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化吡啶（FITC/PI）双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 ①转染72 h后,流式细胞术鉴定阳性细胞比例,c-myc-neg组与c-myc-3组比较,差异无统计学意义（P 〉 0.05）[（54.3 ± 4.2） % vs（52.8 ± 2.9） %];两组细胞平均荧光强度差异、细胞转染率差异无统计学意义。②转染168 h生长曲线显示,转染pLVX-c-myc实验组细胞生长缓慢,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。转染pLVX-c-myc 72 h后,实验组细胞抑制率为（46.40 ± 1.41） %,阴性对照组细胞抑制率为（17.03 ± 1.32） %,差异均有统计学意义（P 〈 0.05）。③转染pLVX-c-myc 72 h后,实验组早期凋亡细胞比例（25.6 ± 4.2） %,阴性对照组早期凋亡细胞（15.1 ± 4.2） %,空白对照组早期凋亡细胞为（12.7 ± 1.8） %,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。实验组晚期凋亡细胞比例（11.5 ± 4.7） %,阴性对照组为（9.3 ± 4.7） %,空白对照组为（8.14 ± 2.8） %,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。结论 设计合成构建的干扰序列pLVX-c-myc-3,可沉默c-myc基因,抑制Jiyoye细胞增殖,诱导细胞凋亡,为进一步探讨沉默c-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治疗中的作用提供了实验依据。     

ST6Gal Ⅰ基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的：探讨人α-2,6-唾液酸转移酶（ST6GalⅠ）小分子干扰RNA（siRNA）对ST6GalⅠ高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法：设计并合成ST6GalⅠ靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalⅠsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠmRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrix^TM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质（ECM）黏附与侵袭力。结果：与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalⅠ siRNA组细胞中ST6GalⅠ mRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalⅠ siRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组（P〈0.05）。结论：化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalⅠ基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。     

siRNA抑制HPV18 E6 基因对HeLA细胞凋亡的影响

目的 研究特异小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)对宫颈癌HeLa细胞中人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）18型 E6基因的抑制及其对细胞凋亡的影响。方法 针对HPV18 E6 基因设计siRNA序列，经PCR方法体外扩增，得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物，利用LipofectamineTM2000脂质体转染HeLa细胞，在U6启动子的作用下于细胞内转录siRNA。针对转染后不同时间点采用四唑盐（MTT）比色法测定细胞活力，流式细胞仪PI染色法检测细胞凋亡率，RT-PCR测定HPV18 E6 mRNA变化。结果 转染siRNA后细胞活力受到显著抑制（P＜0.05），光镜下出现明显的凋亡形态，72h 的凋亡率达到55.8%。RT-PCR结果显示，细胞转染24、48和72h后HPV18 E6 mRNA分别减少了57％、78％和40%，而siRNA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论 siRNA可特异有效的干扰宫颈癌HeLa 细胞内HPV18 E6基因的表达，从而可诱导肿瘤细胞凋亡。     

膜联蛋白A7低表达对人宫颈癌HeLa细胞系增殖与凋亡的影响

目的 探讨膜联蛋白A7表达减少是否对人宫颈癌HeLa细胞系的增殖和凋亡产生影响. 方法 采用Western blotting鉴定siRNA可否有效抑制膜联蛋白A7表达,然后用脂质体转染法将siRNA转染入HeLa细胞,将细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,分别在转染后48h进行刃天青实验以观察细胞增殖状况的改变;流式细胞术检测3组细胞凋亡情况. 结果 在转染膜联蛋白A7的siRNA后48h的HeLa细胞, 刃天青实验可见siRNA干扰组细胞增殖较阴性对照组和空白对照组显著降低(P<0.05);流式细胞术实验可见siRNA干扰组细胞凋亡显著增多(P<0.05). 结论 膜联蛋白A7的低表达可能影响HeLa细胞的增殖和凋亡.     

siRNA特异性抑制卵巢癌细胞葡萄糖调节蛋白78表达及其意义的研究

目的研究利用小分子干扰技术（RNAi）,构建Grp78靶向RNA干扰质粒载体,观察其对人类卵巢癌细胞SKOV3Grp78基因表达的抑制作用。初步探讨RNA干扰技术抑制Grp78的表达作为卵巢癌基因治疗的可行性。方法从GeneBank中选取人类卵巢癌细胞Grp78基因序列,采用siRNA Target Designer-Version 1.51设计软件设计Grp78基因发卡寡核苷酸,序列符合siRNA表达载体psiSTRIKETMU6的要求并与psiSTRIKETM质粒载体连接,采用脂质体转染法将含有特异性小分子干扰Grp78 mRNA的重组载体psiSTRIKETM/Grp78导入卵巢癌细胞系SKOV3中,分别在转染前、转染后24h、48h和72h通过RT-PCR和Western blot检测Grp78 mRNA及蛋白水平的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞经梯度浓度紫杉醇处理后的细胞存活率。结果成功构建RNA干扰质粒载体,靶向Grp78 RNA干扰质粒载体命名为psiSTRIKETM/Grp78。将上述质粒转染到卵巢癌细胞后,观察到psiSTRIKETM/Grp78能够有效的抑制Grp78 mRNA及蛋白表达。转染psiSTRIKETM/Grp78基因后的卵巢癌细胞增殖受到抑制,出现凋亡征象,且对化疗药物的敏感性增加。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKETM/Grp78能明显抑制Grp78 mRNA及蛋白的表达,增加卵巢癌细胞的化疗敏感性。RNAi技术抑制Grp78表达为卵巢癌的基因治疗开辟了新的思路。     

携带甲胎蛋白基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对靶基因的沉默效率

目的构建携带甲胎蛋白（AFP）基因小干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体并转染肝癌细胞,评价其对AFP基因的沉默效率。方法设计和构建针对AFP基因的阳性siRNA及不针对任何已知基因的阴性siRNA,将其分别插入携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒载体,然后转染到表达AFP基因的人肝癌细胞HepG2并筛选阳性表达细胞株,分别为慢病毒转染阳性siRNA组和慢病毒转染阴性siRNA组。同时设立脂质体转染阳性siRNA组、脂质体转染阴性siRNA组以及加AFPsiRNA而未用转染试剂的siRNA组、空白对照组。荧光显微镜观察评估转染效率,荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组HepG2细胞APFmRNA及蛋白的相对表达量,比较不同转染方法对AFP基因表达的抑制率。结果慢病毒能够有效地转染siRNA到HepG2细胞内。荧光定量PCR显示慢病毒转染siRNA对AFPmRNA表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（92．1％比74．3％,P〈0．05）。免疫印迹亦显示慢病毒转染siRNA对AFP蛋白表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（88．2％比63．7％,P〈0．05）。结论慢病毒转染AFPsiRNA能够更有效地抑制HepG2细胞内AFP基因表达。     

Galecin-3在膜联蛋白A7表达抑制的HeLa细胞中的表达变化

目的探讨膜联蛋白A7(ANXA7)表达抑制的HeLa细胞galectin-3(gal-3)的表达改变。方法将细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组。采用RNA干扰技术将靶向ANXA7的siRNA和阴性对照siRNA脂质体2000转染法分别转染宫颈癌细胞系HeLa细胞,空白对照组不予任何处理。转染48h后采用Western blotting法和RT-PCR法分别在蛋白水平和mRNA水平进行抑制效果的鉴定。Western blotting和实时定量PCR法分别检测ANXA7表达抑制的HeLa细胞中galectin-3的表达改变。结果靶向ANXA7的siRNA可显著抑制ANXA7的表达;当ANXA7表达受抑后,galectin-3在HeLa细胞中的表达显著下降,与阴性对照组和空白对照组相比,差异有显著性(P0.05)。结论 ANXA7表达抑制的宫颈癌细胞系HeLa细胞中galectin-3的表达显著下调,这可能是ANXA7表达受抑的细胞行为学发生改变的机制之一。     

RNAi 结肠癌HOXB7 基因表达对癌细胞增殖及凋亡的机制研究

目的:探讨抑制HOXB7 基因表达对结肠癌细胞增殖凋亡的影响。方法:通LipofectamineTM2000 脂质体介导法将合成的阴性对照siRNA(阴性对照组)及HOXB7-siRNA(HOXB7 转染组)转染人结肠癌SW480 细胞,未经特殊处理的细胞为空白组。收集转染48 h 的细胞,RT-PCR 及Western blot 分别检测细胞中HOXB7 的mRNA 及蛋白表达;分别于转染后的24、48、72、96 h,CCK8 法检测细胞增殖;流式细胞仪检测转染后48 h 细胞的凋亡情况;Western blot 检测凋亡相关蛋白B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2(Bc-2)、Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)及Notch1 信号通路Notch1、Hes1 的蛋白表达。结果:HOXB7 转染组HOXB7 的mRNA 及蛋白表达均显著低于空白组(P<0.05);转染24 h 后三组细胞的OD 值间差异无统计学意义(P>0.05),48、72、96 h 后,与空白组比较,HOXB7 转染组OD 值均显著降低(P<0.05);与空白组比较,HOXB7 转染组细胞凋亡率显著升高,Bcl-2、Notch1、Hes1 蛋白显著下调表达,Bax 蛋白显著上调表达(P<0.05)。结论:RNAi 结肠癌HOXB7 基因表达可通过抑制Notch1 信号通路降低癌细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

新蛋白C7orf42促进大鼠肝细胞BRL-3A增殖

目的探讨未知功能蛋白C7orf42对体外培养的大鼠肝细胞BRL-3A增殖的影响。方法基因干涉下调C7orf42表达后,用MTT、Ed U掺入法检测C7orf42对BRL-3A细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期进程以及Reat-time PCR和Western blotting检测细胞增殖相关基因表达。结果 MTT法检测表明,转染C7orf42干涉片段后48h,干涉组比阴性对照组细胞活力降低11%(P0.05);Ed U掺入法检测表明,实验组的Ed U阳性细胞比率比对照组降低了13%(P0.05);流式细胞术检测表明,干涉组比阴性对照组S+G2/M期的细胞数降低12%(P0.05);Reat-time PCR检测表明,干涉C7orf42表达后细胞增殖相关基因JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达分别下调26%、31%、37%和14%(P0.05);Western blotting检测表明,干涉C7orf42表达后细胞增殖相关蛋白JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达分别下调59%、54%、18%和27%(P0.05)。结论 C7orf42可能通过上调细胞增殖相关蛋白JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达,促进体外培养的大鼠肝细胞BRL-3A增殖。