人GDDR基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆人GDDR基因的启动子;构建GDDR启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法:设计合成GD-DR启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增GD-DR启动子;将扩增片段插入T载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至pGL3-Basic荧光报告基因载体;瞬时转染细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:PCR扩增得到人GDDR基因启动子;成功构建pGL3-GDDR-promoter 报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.结论:成功地构建人GDDR基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究GDDR转录表达的调控机制提供基础.     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的 构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达.方法 采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的 片段(-298～﹢283),双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制.将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL-CMV(表达海肾荧光素酶)共转染原代培养皮质神经元,24 h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性.结果 重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶.结论 成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达.     

NLRP1基因启动子区荧光素酶报告载体的构建与鉴定

目的构建人NLRP1(nucleotide-binding,leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1)基因启动子区SNPrs878329位点两种单倍体荧光素酶报告基因载体。方法分别以SNP rs878329的GG和CC基因型的人基因组DNA为模板,用PCR法扩增出包含该位点的长476 bp的NLRP1基因启动子区目的片段,用KpnⅠ/BglⅡ双酶切,切胶回收后分别与同样双酶切的荧光素酶报告基因载体PGL3-promoter相连接,构建pGL3-promoter-G和pGL3-promoter-C两个表达质粒,并测序验证其DNA序列。结果成功构建了人类NLRP1基因启动子SNP rs878329的两种纯合子基因型(GG型和CC型)的荧光素酶报告载体,且测序得以证实。结论成功构建出的荧光素酶报告载体,为研究NLRP1基因启动子SNP rs878329能否调控NLRP1基因表达提供了基本实验条件。     

KIR3DL1基因启动子亚克隆及表达调控载体的构建

为研究KIR3DL1基因的表达调控机制,亚克隆KIR3DL1基因的核心启动子序列,并构建KIR3DL1基因启动子-荧光素酶报告载体,采用PCR法从含有KIR3DL1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增KIR3DL1基因核心启动子序列,产物纯化回收后与pGEM-T easy载体连接,测序鉴定正确的重组子经限制性内切酶BglⅡ和NcoⅠ双酶切后,插入同样经BglⅡ和NcoⅠ双酶切的用于基因表达调控研究的pGL3-Basic报告载体,最终获得了长度为254bp的KIR3DL1基因启动子克隆,构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体.通过酶切及基因测序的方法证实所构建的重组子是正确的,说明KIR3DL1基因启动子表达调控载体的构建是成功的.     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

人B7H4启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析

为构建人B7H4基因启动子荧光素酶报告基因载体,以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板,PCR扩增3条不同长度人B7H4启动子序列,并插入PGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中;待测序验证后,将3个重组质粒及pRL-TK内参质粒分别共转染HEK-293T细胞,采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。测序结果显示构建的3个人B7H4基因启动子重组载体序列正确;重组载体转染HEK-293T细胞,经双荧光素酶报告基因检测确定重组载体有启动子活性,其中PGL3-hB7H4-0.5kb重组载体的转录活性较高。本研究成功构建了3条含不同长度的B7H4启动子序列的荧光素酶报告基因系统,为后续分析人B7H4启动子的转录调控元件及肿瘤微环境中调控B7H4表达的作用因素等研究奠定了实验基础。     

脆性X智力低下一号基因启动子双荧光素酶报告基因的构建及活性测定

目的构建脆性X智力低下一号基因启动子双荧光素酶报告基因,并检测启动子活性。方法从K562细胞中钓取启动子片段MSE,然后与pGL-4载体连接,鉴定后转染hela细胞,检测其启动子的活性。结果从K562细胞中成功钓取了启动子片段MSE,将MSE与PGL4载体连接成重组质粒pGL-4/MSE位,重组质粒经过PCR、酶切鉴定后测序,测序结果与GeneBank报道序列一致。重组质粒pGL-4/MSE位转染hela细胞的相对荧光素酶值与阴性对照组相比有明显区别（P〈0.05）。结论成功构建了脆性X智力低下一号基因启动子双荧光素酶报告基因,并具有满意的活性,为后续研究发病机制及作用位点提供依据。     

人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1基因P7启动子调控的报告基因载体的构建及鉴定

应用PCR方法从人单核细胞系THP-1基因组DNA扩增人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase1, ACAT1)基因 P7启动子全长片段,进行TA克隆,经双酶切、测序鉴定阳性克隆.将该基因亚克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer,用DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)法将重组质粒pGL3E-P7瞬时转染入单核细胞THP-1,检测其活性,证明pGL3E-P7能在体外表达荧光素酶.人ACAT1基因P7启动子调控的荧光素酶报告基因表达载体的成功构建,为研究动脉粥样硬化过程中ACAT1基因的转录调控机制提供新手段.     

应用Gibson Assembly法快速构建人组蛋白甲基化转移酶启动子荧光素酶报告载体

目的：快速构建人组蛋白甲基转移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)启动子荧光素酶报告载体并验证其活性。方法：因EZH2启动子富含GC,故应用Gibson Assembly方法设计分两段扩增,然后将片段一步法连入pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告载体,进行酶切鉴定。与pRL-TK内参照质粒共转染C4-2细胞,双荧光素酶分析法检测启动子的活性。结果：经酶切鉴定证实成功构建了EZH2启动子报告载体,双荧光索酶报告基因检测结果显示构建的报告载体具有启动子活性。结论：快速成功构建了具有启动子活性的EZH2启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌中EZH2表达调控机制提供必要的实验材料。     

哺乳动物shRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建带有绿色荧光蛋白报告基因的哺乳动物shRNA表达载体。方法:用PCR方法从含有人U6启动子的载体PTZU6 1中扩增U6启动子,将其克隆到pEGFP-C1载体中,通过限制性内切酶、PCR及测序对构建的载体进行鉴定,以其转染HepG2细胞后,在倒置荧光显微镜下初步观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经限制性内切酶、PCR及测序证实,成功地构建哺乳动物shRNA表达载体。以其转染HepG2细胞后可以表达绿色荧光蛋白。结论:构建了带有绿色荧光蛋白报告基因的哺乳动物shRNA表达载体,为以后运用该载体进行RNAi相关研究奠定了一定的基础。     

错配修复基因hMLH1启动子萤光素酶报告基因载体的构建与鉴定

 目的：构建含hMLH1启动子片段的萤光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素诱导下的转录活性。方法：以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增hMLH1启动子片段（-1953/+53）,插入萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic,将重组质粒转入HEK293细胞,检测在有和无雌激素诱导下萤光素酶的活性变化。结果：酶切和测序结果证实重组萤光素酶报告基因载体pGL3-Promoter1-luc构建成功。转染pGL3-Promoter1-luc后,雌激素诱导的萤光素酶活性为7.45±0.81,显著高于无水乙醇组的3.28±0.19 (n=3,P<0.001)。结论：hMLH1启动子片段存在与雌激素相关的调控序列。     

携eGFP及表达人gp100-TCR基因的慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携eGFP的人gp100-TCR基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,从pGCsamgp100APB质粒上扩增出人gp100-TCR片段,将其插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达载体中,同时将其U6启动子替换为EF-1a启动子,形成慢病毒表达载体pLL3.7-gp100TCR-pEf-1a。将其与包装质粒混合,采用磷酸钙转染法转染293FT细胞,包装产生慢病毒,荧光显微镜观察GFP蛋白的表达水平。检测病毒滴度。结果 PCR、酶切及测序表明慢病毒表达载体pLL3.7-gp100TCR-pEf-1a构建成功。转染后的293FT细胞在荧光显微镜观察可见强绿色荧光,形成的慢病毒可感染293FT细胞,包装的慢病毒浓缩后滴度为4.5×106 TU/ml。结论成功构建eGFP和gp100-TCR共同表达的慢病毒表达载体,为gp100-TCR在肿瘤治疗中的功能研究提供了有效平台。     

人Egr-1启动子的克隆及其在肿瘤细胞中的辐射诱导反应

目的:克隆人Egr-1基因的启动子, 插入荧光素酶报告基因载体中, 并检测电离辐射对其活性的影响.方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出Egr-1启动子, 将其克隆到pGL3-basic载体中;将重组质粒转染人肿瘤细胞, 测定Egr-1启动子在不同辐射条件下转录活性的改变.结果:成功构建了Egr-1启动子的荧光素酶报告基因;在不同剂量的γ射线照射后, Egr-1的启动子活性均明显高于未照射组;在同一剂量照射后48 h, Egr-1的启动子活性达峰值.结论:本实验构建的Egr-1启动子具有辐射激活的功能, 为进一步研究放射-基因治疗奠定了基础.     

质粒型甲病毒复制子载体系统的构建及其功能鉴定

目的 构建质粒型甲病毒复制子载体系统,并对其功能进行鉴定.方法 在XJ-160病毒感染性cDNA克隆的基础上,将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增,分步克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游,并用多克隆位点序列替代病毒的结构基因构建XJ-160病毒质粒型复制子载体.将病毒核蛋白基因及包膜糖蛋白基因分别克隆至pVAX1 CMV启动子下游构建载体的两个辅助质粒.通过绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因的表达检验该质粒型载体系统的功能特性.结果 成功构建了包括复制子载体和辅助质粒的质粒型甲病毒复制子载体系统,且该复制子载体系统可成功表达绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因.结论 本研究构建了能够表达外源基因的质粒型甲病毒复制子载体系统,为目标基因表达、重组病毒颗粒制备等奠定了基础.     

以p53为靶点的新型抗肿瘤化合物细胞筛选模型的构建与应用

目的构建含有p53蛋白结合位点的p21或survivin基因启动子区的荧光素酶报告基因重组质粒,并获得稳定转染的细胞模型用于抗肿瘤化合物筛选。方法将含有p53蛋白结合位点的p21或survivin启动子区序列连接到pGL4.17-basic载体上,分别获得报告基因重组质粒pGL4.17-p21和pGL4.17-survivin;将两种重组质粒分别转染A549细胞,经G418筛选获得稳定转染细胞株A549-p21和A549-survivin;对该细胞模型进行条件优化,并将可调节p53蛋白表达的多种抗肿瘤药物作用于稳定转染细胞,通过荧光素酶检测和western blot方法验证细胞模型用于药物筛选的可行性。结果成功建立了分别含有p21或survivin启动子报告基因的A549-p21和A549-survivin稳定细胞模型,多种抗肿瘤药物作用该细胞后能够通过调节p53蛋白表达而影响报告基因荧光素酶活性。结论构建的稳定转染细胞模型可以用于筛选以p53为靶点的抗肿瘤化合物。     

缺氧反应元件启动子表达反义血管内皮生长因子(VEGF)165 cDNA靶向性抑制骨肉瘤细胞VEGF表达

目的以缺氧诱导因子-1/缺氧反应元件(HIF-1/HRE)基因调节系统为载体,构建含HRE启动子的人反义血管内皮生长因子(VEGF)165 cDNA真核表达载体,探讨其对缺氧条件下骨肉瘤细胞VEGF表达的靶向性抑制作用.方法采用聚合酶链反应(PCR)和DNA重组技术构建由HRE启动子驱动的含荧光素酶(Luc)报告基因和人反义VEGF165 cDNA全长的真核表达质粒,将其转染骨肉瘤细胞系MG63,用液闪计数仪测定缺氧对报告基因表达的调节,酶链免疫吸附试验(ELISA)法检测缺氧条件下细胞VEGF表达的变化.结果成功构建了由HRE启动子驱动的含Luc和反义VEGF165 cDNA全长的真核表达质粒pBI-HRE-Luc-AsVEGF165,该质粒转染骨肉瘤细胞系,缺氧条件下可使报告基因在肿瘤细胞中的表达提高3.5×102倍,使肿瘤细胞VEGF分泌下降45%.结论利用肿瘤缺氧,HRE启动子能够实现反义VEGF165的高效表达,为开展靶向性抗肿瘤血管生成治疗提供了实验依据.     

重组法国梧桐花粉过敏原2( rPla a2) 对诱导型一氧化氮合酶( NOS2)基因启动子活性及基因表达的影响

目的:构建人诱导型一氧化氮合酶(NOS2)基因启动子区,对NOS2 启动子序列进行鉴定并分析其活性;探索重组法国梧桐花粉过敏原2(rPla a2)对人NOS2 基因启动子活性及基因表达的影响。方法:利用PCR 扩增、限制性内切酶双酶切、DNA 连接酶连接、大肠杆菌转化等方法将NOS2 基因启动子区克隆至pGL3-Basic 载体上,将所构建重组报告质粒转染至人胚肾(HEK293T)细胞中,利用双荧光素酶活性分析检测该重组报告质粒启动子活性及检测rPla a2 对人NOS2 基因启动子活性的影响;用实时荧光定量PCR 法检测rPla a2 对人NOS2 基因mRNA 水平的影响。结果:成功构建含有NOS2 启动子的重组报告质粒,与对照(pGL3-Basic) 组相比,含NOS2 启动子区的重组质粒转染组荧光素酶活性显著增高;与不加刺激(NOS2)组相比,加入rPla a2 刺激后含NOS2 启动子区的重组报告质粒转染组荧光素酶活性显著增高,加入rPla a2 刺激后NOS2 mRNA 相对表达水平显著增高。结论:rPla a2 可增强人NOS2 基因启动子活性,并增加其基因表达。     

SLC2A4基因启动子区rs5418位点变异对基因表达的影响

目的: 研究葡萄糖转运蛋白4(SLC2A4)基因启动子区rs5418多态位点G→A变异对基因表达的影响。方法: PCR法扩增SLC2A4基因核心启动子区序列。采用基因重组、定点突变等技术,构建rs5418位点含有不同等位基因的SLC2A4基因启动子重组表达载体。脂质体转染法将重组质粒转入HEK293T细胞,采用双萤光素酶报告系统,观察携带不同等位基因的重组质粒中下游报告基因的表达活性。结果: PCR扩增获得长度为716 bp的SLC2A4基因核心启动子序列,成功构建pGL3-SLC2A4-prom(A)和pGL3-SLC2A4-prom(G)重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,携带A等位基因的载体启动下游报告基因表达的相对活性(19.49±4.41)比携带G等位基因的载体(13.04±4.45)强,两者存在显著差异(P<0.05)。结论: SLC2A4基因启动子区rs5418位点的G→A突变能显著增强启动子活性,从而影响SLC2A4基因表达活性。     

HRE/CMV启动子的克隆和缺氧调控活性的测定

目的： 将具有缺氧调控作用的多种缺氧反应元件 (HRE)与CMV启动子组合，以获得缺氧应答启动子。将荧光素酶报告基因置于缺氧应答启动子的下游，通过检测荧光素酶活性的方法，方便地研究缺氧应答启动子缺氧诱导的作用。方法: 合成多种HRE核苷酸序列，并设立HRE突变对照，克隆入pCI-neo中，构建HRE/CMV启动子。扩增HRE/CMV序列，定向亚克隆入pGL3-Basic中，获得HRE/CMV荧光素酶报告载体。瞬时转染HeLa细胞，在0.1% O₂ 环境下培养细胞，并设立正常氧分压环境对照。检测荧光素酶的相对活性。结果: 成功构建了HRE/CMV荧光素酶报告载体，其中mPGK-HRE/CMV载体表现出很好的缺氧诱导作用和高水平的表达。结论: mPGK-HRE/CMV启动子能够有效地进行缺氧诱导和调控工作。     

人nestin第二内含子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的构建含有人nestin第二内含子的荧光素酶报告基因并检测其活性。方法从NCBI数据库获得nestin的DNA全长序列（NC），用软件分析找到其第二内含子位置，通过的方法从人血全基因_000001vectorNTIPCR组DNA中钓取nestin的第二内含子全长片段，克隆到报告基因pGL3-promoter载体上，将报告基因载体转染至293T细胞，采用双荧光素酶报告基因系统评估第二内含子的活性。结果成功钓取nestin第二内含子片段，长度为1688bp，测定其DNA序列正确。瞬时转染293T细胞，经双荧光报告实验显示转染了pGL3-nes-promoter载体的细胞其相对荧光素酶活性相比于空载组，大约提高了3．39倍，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论成功构建了含有nestin第二内含子的荧光素酶报告载体，为进一步研究nestin的调控机制奠定基础。