抗氧化剂对热打击人脐动脉血管平滑肌细胞收缩反应的影响

目的 研究抗氧化剂对热打击过程中人脐动脉血管平滑肌细胞(HUASMCs)收缩反应的影响.方法 将HUASMCs分为对照组、热打击组(HS组)和热打击前超氧化物歧化酶(SOD)预处理组(SOD+HS组),每组分别用低浓度NE(0.05mg/L)及常规浓度NE(1.0mg/L)刺激.各组细胞于41℃恒温水箱中分别培养0.5、1、1.5、2h后添加NE刺激,采用细胞表面积收缩比(%)反映细胞对NE的反应性.结果 与对照组比较,无论是给予低浓度或常规浓度NE刺激,HS组细胞热打击1h时对于NE的反应性均明显增高,2h时对于NE的反应性则明显降低(P<0.05或P<0.01);SOD+HS组细胞对NE的反应性在热打击至2h后均出现明显下降(P<0.05或P<0.01).对照组及HS组细胞对不同浓度NE刺激的反应性差异无统计学意义(P>0.05),SOD+HS组细胞在热打击过程中对常规浓度NE的反应性明显高于对低剂量NE的反应性(P<0.05或P<0.01).无论给予常规浓度或低浓度NE刺激,SOD+HS组细胞对NE的反应性均低于HS组(P<0.05或P<0.01).结论 热打击过程中,HUASMCs对NE的反应性呈时相性变化.抗氧化剂在中暑早期可能可以纠正HUASMCs对NE的过反应现象,但在热打击中后期,抗氧化剂并不能改善其反应性的下降.     

谷氨酰胺对热打击下单层肠上皮Caco-2细胞屏障功能的影响

目的 探讨谷氨酰胺(Gln)对热打击后肠黏膜单层上皮细胞屏障通透性改变的影响及可能机制.方法 应用Caco-2细胞株建立肠上皮机械屏障模型,加入Gln培养24h,43℃持续1h热打击.以CCK-8法检测不同浓度Gln(0.4、0.7、1.4、2.1、2.8mmol/L)对细胞增殖的影响,为后续实验选择最适合浓度;Transwell法测定单层跨膜电阻抗(TEER)值和对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性;Western blotting检测紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达;采用考马斯亮蓝对细胞骨架进行染色观察.结果 0.7mmol/L的Gln促进细胞增殖的效果最强,与其他浓度相比,差异均有统计学意义(P<0.05).相较于单纯43℃热打击组,0.7mmol/L的Gln可抑制单层上皮细胞TEER的下降和HRP通过率的升高(P<0.01),增加occludin和ZO-1的表达,有益于维持细胞骨架的正常结构.结论 0.7mmol/L的Gln可减轻热打击对单层肠上皮细胞结构的破坏,保护屏障功能.     

热打击致大鼠肠上皮IEC-6细胞钙超载损伤的初步研究

目的 研究不同程度热打击对体外培养大鼠肠黏膜上皮细胞IEC-6的钙超载及钙超载相关的损伤.方法 设置培养IEC-6细胞的温度梯度,Fluo-3Am探针加荧光显微镜及流式细胞术观察细胞内钙离子水平的改变,相差显微镜观察细胞形态学改变,考马斯亮蓝染色法观察细胞骨架变化,CCK-8法观察细胞活性改变,黏附实验观察基底膜黏附性改变.结果 与正常对照组比较,热打击组细胞内钙水平上升(P＜0.01),呈温度依赖性.热打击组细胞形态变圆,伪足变短,细胞间隙增大,45℃较43℃改变更为明显.考马斯亮蓝染色显示,热打击组细胞骨架增粗、紊乱,出现应力性纤维,45℃较43℃改变更为明显.CCK-8法显示,热打击组细胞活性下降(p＜0.01),呈温度依赖性.基底膜黏附实验显示,热打击组基底膜黏附性显著下降(P＜0.01),呈温度依赖性.结论 热打击可造成IEC-6细胞钙超载,并造成与钙超载相关的一系列细胞损伤,热打击对于肠黏膜上皮钙超载的影响及其机制的进一步研究将有助于了解热射病的发病机制.     

活性氧在热打击诱导肠上皮细胞凋亡中的作用

目的 观察热打击对大鼠肠上皮细胞(IEC-6)氧化应激反应、溶酶体损伤及细胞凋亡的影响,探讨中暑热损伤过程中肠道损伤的机制.方法 将IEC-6细胞分为对照组(细胞仅置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育)、热打击组(细胞置于43℃、5%CO2细胞培养箱中1h,之后分别置于正常细胞培养箱中继续孵育0、1、3、6、12h)、药物干预组(于热打击前分别采用溶酶体抑制剂E-64和活性氧清除剂NAC预处理细胞1h).采用DCFH-DA法检测细胞内活性氧(ROS)的表达,吖啶橙(AO)染色法检测溶酶体膜稳定性,AnnexinⅤFITC/PI双染色法检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活力.结果 与对照组比较,热打击后复温1h即导致IEC-6细胞活力下降,凋亡增加,且在复温后12h时最为明显(P<0.05);热打击后即刻即引起细胞内ROS表达及"苍白细胞"数量增加,且在复温后12h时最为明显(P<0.05).与热打击组比校,采用NAC对细胞进行预处理可明显提高热打击后细胞活力,减轻溶酶体损伤,并降低细胞凋亡率(P<0.05);采用E-64对细胞进行预处理可明显提高热打击后细胞活力,并降低细胞凋亡率(P<0.05).结论 ROS介导了热打击诱导肠上皮细胞凋亡的调控,这可能是中暑导致肠道黏膜屏障功能损伤的重要机制之一.     

内皮素对肝硬化大鼠Kupffer细胞血小板活化因子生成水平的影响

目的 探讨肝硬化时Kupffer细胞与血小板活化因子(PAF)生成的关系及内皮素-1(ET-1)在其中的作用.方法 30只SD大鼠随机分为正常对照组与CCl4诱导的肝硬化模型组,每组15只.分离、培养Kupffer细胞,培养24h后,分别用0、1、10、100和1 000nmol/L ET-1刺激,测定Kupffer细胞产生和释放的PAF水平.通过RT-PCR、受体饱和结合试验分析Kupffer细胞PAF、ET-1受体(ETA、ETB)和内皮素前体原(ppET-1)mRNA表达情况.结果 肝硬化大鼠Kupffer细胞合成与释放PAF明显增加,分别为对照组的1.48倍(1.02±0.06pg/g DNA vs 0.69±0.07pg/g DNA,P＜0.01)和2.15倍(1.42±0.14pg/g DNA vs 0.66±0.04pg/g DNA,P＜0.01).ET-1刺激增强了Kupffer细胞生成与释放PAF的效应,并呈剂量依赖性,在肝硬化组尤为明显.肝硬化组Kupffer细胞PAF及ETB受体mRNA水平及受体密度明显增加,而受体亲和力无变化,无ETA受体和ppET-1 mRNA表达.结论 Kupffer细胞是肝硬化时PAF生成的一个重要来源,ET-1通过表达增加的ETB受体进一步促进Kupffer细胞生成并释放PAF,提示Kupffer细胞参与了肝硬化门脉高压的形成.     

热打击对单层肠上皮Caco-2细胞屏障功能的影响

目的 研究热打击对肠黏膜屏障上皮细胞间紧密连接及凋亡的影响.方法 采用肠上皮细胞株Caco-2建立肠屏障模型,检测经37～43℃热打击后细胞的单层跨膜电阻抗(TEER)值及对大分子物质辣根过氧化物酶(HRP)的通透性,采用Western blotting检测occludin蛋白的表达水平,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果 随着热打击温度的升高,TEER值降低,HRP通透性增加,37℃热打击细胞的TEER值和HRP通透性与39、41、43℃热打击细胞差异均有统计学意义(P＜0.01).热打击温度从37℃到41℃,occludin蛋白的表达逐渐增加,于41℃达峰值,此后逐渐下降.43℃时随热打击时间延长,occludin蛋白表达逐渐降低.随热打击温度(37～43℃)升高,细胞凋亡逐渐增加(P＜0.05或P＜0.01).结论 热打击可造成肠上皮紧密连接的明显破坏,细胞凋亡增加,从而破坏肠屏障功能.     

地塞米松抑制U937细胞黏附与吞噬功能的作用机制

目的 探讨地塞米松抑制单核细胞U937黏附和吞噬功能的机制. 方法 检测体外培养的U937在佛波脂(phorbol - 12 - myristate - 13 - acetate,PMA)刺激下分别接受地塞米松和法舒地尔作用后,观察人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)黏附和吞噬能力的变化,并检测ROCK1(rho -associated coiled -coil protein kinase 1,ROCK1)蛋白含量及其活性的变化;同时观察米非司酮和放线菌酮对地塞米松的影响. 结果 地塞米松和法舒地尔均可显著抑制受PMA刺激的U937细胞的黏附率和吞噬效果,并抑制ROCK1活性;米非司酮和放线菌酮并不能影响地塞米松抑制U937细胞的黏附和吞噬作用. 结论 地塞米松能通过抑制U937细胞内ROCK1的活性而干扰其黏附、吞噬功能.     

洛伐他汀对HL-60细胞增殖功能及细胞形态的影响

目的 :探讨胆固醇合成抑制剂洛伐他汀 (Lovastatin ,LOV)对HL - 6 0细胞增殖功能的影响并观察细胞的形态学变化。方法 :以LOV处理HL - 6 0细胞 ,采用MTT、生长曲线、光学显微镜观察等实验方法 ,观察LOV对HL - 6 0细胞增殖的抑制作用及对细胞形态的影响。结果 :4、8、16 μmol·L-1LOV处理HL - 6 0细胞 1～ 4d后 ,可抑制HL - 6 0细胞增殖 ,同时 ,细胞形态发生不同程度的改变。结论 :LOV能显著抑制HL - 6 0细胞增殖并使细胞形态发生明显改变 ,该作用呈剂量 -效应和时间依赖关系     

热打击诱导肝细胞释放的外泌体生物学功能及其致肝损伤作用分析

目的探讨中暑诱导肝细胞释放外泌体的生物学功能及其对重症中暑肝损伤的作用。方法将人肝癌细胞系HepG2细胞分为对照组与热打击组,提取上清经超高速离心法分离外泌体。透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态,纳米颗粒追踪分析法(NTA)检测外泌体直径分布,Western blotting检测外泌体特征性标记物表达。通过等重同位素多标签相对定量蛋白质组学(iTRAQ)方法分析对照组与热打击组肝细胞外泌体中蛋白质的组成差异,采用KEGG通路对差异蛋白质集合进行生物信息学分析。外泌体刺激受体肝细胞实验将受体肝细胞分为对照组、正常刺激组、热打击刺激组(10μg/5 ml,24 h)、热打击组及热打击预处理组,检测各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)水平。外泌体体内回输刺激实验将小鼠分为对照组、正常输注组、热打击输注组(40μg/只)、热打击组及热打击预处理组,9 h后处死,检测其血清ALT、AST、LDH水平,以评价肝组织损伤情况。结果肝细胞分泌的微粒在TEM下呈双层膜状包裹的圆形或椭圆形结构,NTA检测显示其直径为90～150 nm,Western blotting检...     

术前区域动脉热化疗对进展期胃癌病理学的影响

目的:评价进展期胃癌行术前区域性动脉热化疗对胃癌组织的病理学的影响。方法:应用原位末端标记法(TUNEL)及免疫组化技术对107例进展期胃癌组织标本进行凋亡和细胞增殖的检测;107例进展期胃癌分3组,A组38例,采用单纯动脉灌注化疗,B组42例,采用动脉热灌注化疗,C组27例,单纯外科手术作对照。结果:A组进展期胃癌的细胞凋亡率为10.6%±4.5%,B组的细胞凋亡率15.9%±2.8%,C组的细胞凋亡率为4.4%±1.5%,两两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。PCNA的阳性率A组为57.9%(22/38),B组为33.3%(14/42),C组为85.2%(23/27)。结论:术前动脉灌注化疗及热化疗均可促进进展期胃癌组织的细胞凋亡并抑制其增殖,可作为进展期胃癌术前辅助化疗重要方法之一。     

库普弗细胞在肝再生调控中的作用机制

目的探讨库普弗细胞(KC)在肝部分切除(PH)后再生调控中的作用及机制。方法制备KC条件培养液(KCCM),用MTT法观察其对大鼠原代肝细胞增殖的作用;建立小鼠PH模型,测定KC灭活对肝再生率的影响;应用免疫组化方法检测KC灭活后再生肝中TNF-α、TGF-α和TGF-β1的表达特点。结果KCCM能明显促进原代肝细胞增殖(A=0·746±0·06),与对照组(A=0·536±0·06)相比有显著性差异(P<0·01);KC灭活伴PH后6天肝再生率为95·10%±4·52%,而单纯PH后6天肝再生率为74·50%±1·90%(P<0·01);免疫组化结果显示,小鼠PH后6h,再生肝细胞TNF-α、TGF-α和TGF-β1表达迅速升高,前两者可持续4~5天,而后者在第3天即转为阴性,但在KC灭活伴PH后第6天,3种因子的表达仍然较强,超过单纯PH组。结论在肝再生过程中,KC和其他间质细胞分泌的TNF-α和TGF-α因受到KC分泌的TGF-β1等因子的拮抗而不能充分发挥促肝再生作用;当KC活性被抑制时,TNF-α和TGF-α的活性不再受到拮抗,进而能够增强肝再生能力和加速再生过程。     

热应激对血管内皮细胞DNA损伤效应的研究

目的：观察血管内皮细胞株ECV304在不同热应激条件下DNA受损情况。方法：实验采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)检测在不同热应激条件(41℃2h、43℃2h、45℃2h)对ECV304细胞DNA的单链损伤情况。结果：在不同的热应激条件下，固定热应激时间，随着热应激温度的逐步增加，采用SCGE法所观察到的受损细胞数显著增多，P＜0．05，相应的慧尾长度显著增加，P＜0．05。结论：热应激对内皮细胞的DNA致伤肯定，可使ECV304细胞DNA发生不同程度的单链断裂。     

Kupffer细胞表达的Fas配体在急性胰腺炎并发肝损伤中的作用

目的 探讨Kupffer细胞表达的Fas配体(FasL)对急性胰腺炎(AP)肝损伤的介导作用以及Kupffer细胞抑制剂氯化钆(GdCl3)对肝损伤的保护作用.方法 ICR小鼠54只,采用随机数字法将其分为对照组(6只)、AP组(24只)和GdCl3预处理 AP组(24只),后两组再分为4个时间点(每个时间点6只).用雨蛙素诱导制作小鼠AP模型;用自动生化仪检测血清ALT、AST、LDH和淀粉酶(AMY)水平;用ELISA试剂盒检测血清FasL水平,用Western blotting法检测肝脏FasL蛋白的表达情况.结果 AP时血清AST、ALT、LDH、AMY水平及肝脏FasL蛋白表达明显升高,AP组4、8、16和24h时血清FasL浓度(505.94±36.21,496.60±33.65,476.64±22.66,450.75±38.21)显著高于对照组(83.60±7.75,P<0.01);用GdCl3预处理后,在AP发生后升高的血清AST、ALT、LDH、AMY水平明显降低,肝脏FasL蛋白表达显著下调.GdCl3预处理组4、8、16h和24h时血清FasL浓度(211.37±24.86,190.41±20.36,200.49±32.03,178.60±7.93)显著低于AP组相应时点的浓度(P<0.01).结论 AP通过上调Kupffer细胞表达的FasL介导肝损伤,GdCl3通过抑制FasL的表达对AP肝损伤发挥保护作用.     

早期肠道营养对严重烧伤大鼠枯否细胞活化状态的影响

目的 了解早期肠道营养对枯否细胞（ＫＣ）的调理作用。方法 ３０％Ⅲ度烧伤大鼠９０只随机分为早期喂养组，延迟喂养组，另设正常对照组１５只。于伤前及伤后１，３，５天观察三否细胞分泌ＴＮＦ，ＰＧＥ２的变化及ＫＣ吞噬胶体颗粒数量的变化。结果 延迟喂养组较早期喂养组ＫＣ分泌ＴＮＦ，ＰＧＥ２及吞噬胶体颗粒量均明显增加。结论 早期肠道营养可下的调理ＫＣ的过度激活，减少其释放活性介质，对严重烧伤后由于炎症反应失控     

锶对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的观察锶(Sr)对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)增殖及成骨分化的影响并探索其最佳作用浓度。方法抽取健康成年志愿者骨髓6ml,体外分离、培养原代hMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型。取第4代细胞进行实验,共分为5组,A组为空白对照,培养液中仅加入骨诱导剂(地塞米松10-8mol/L、抗坏血酸50μg/ml、β-甘油磷酸钠10mmol/L,B、C、D、E组培养液在加入骨诱导剂后分别加入3.75×10-3、3.75×10-2、3.75×10-1、3.75mmol/L的SrCl2。定期测定各组hMSCs的增殖情况(MTT法)、碱性磷酸酶(ALP)活性(酶标法)和骨钙素(OCN)含量(放免法),并观察细胞茜素红钙结节染色情况,分析各组钙结节数量及面积。结果随培养时间延长,各组细胞增殖和成骨分化均明显提高(P<0.01)。组间比较显示,第7天时的细胞增殖水平,第7、14天的ALP活性,第14、21天的OCN含量以及第21天的茜素红钙结节数量和面积测定结果,B-E组均明显优于A组(P<0.05);D、E组第7天时的细胞增殖水平及第14天的ALP活性均明显高于A、B、C组(P<0.05),而D组与E组比较无显著差异(P>0...     

异丙酚对热打击后内皮细胞线粒体氧化应激损伤的保护作用

目的 探讨热损伤过程中异丙酚对内皮细胞的抗氧化作用以及对线粒体的保护效应.方法 采用43℃培养2h后37℃、5%CO2常规培养6h的方法建立人脐静脉内皮细胞(HUVECs)热打击模型;实验分为37℃组、37℃+脂肪乳组(阴性对照组)、37℃+异丙酚组、43℃组、43℃+异丙酚组、H2O2+异丙酚组(阳性对照组)6组,其中异丙酚、脂肪乳均于热打击或H2O2作用前先行与细胞孵育.应用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)、线粒体膜电位(ΔΨm)以及线粒体通透性转换孔(MPTP)的变化;荧光素-荧光素酶法检测ATP含量;Caspase活性试剂盒检测caspase-9和caspase-3活性的变化.结果 热打击后,HUVECs活力明显降低,线粒体功能受损(P<0.05);经异丙酚预处理的HUVECs在热打击后保持了细胞活力,胞内ROS水平较单纯43℃热打击组明显降低(P<0.05),线粒体膜电位下降的细胞占比(JC-1单体所占比例)明显减少(P<0.05),线粒体通透性转换孔开放,细胞内ATP含量明显升高(P<0.05),同时线粒体损伤相关的caspase-9/3所介导的线粒体凋亡通路的激活也被抑制.结论 异丙酚在热损伤过程中具有抗氧化损伤、抗凋亡以及线粒体保护作用.     

肝硬化大鼠Kupffer细胞血小板活化因子合成水平及其受体表达

目的研究肝硬化时Kupffer细胞血小板活化因子（PAF）生成水平及其受体表达的变化及意义。方法建立CCl4诱导的肝硬化模型,分离、培养Kupffer细胞,快速^3H—PAF液闪检测Kupffer细胞及其培养上清液内PAF水平,免疫组织化学染色检测PAF在Kupffer细胞内的分布情况,受体饱和结合实验和RT-PCR分析Kupffer细胞PAF结合能力及PAF受体mRNA表达水平。结果肝硬化大鼠Kupffer细胞合成与释放PAF明显增加,分别为对照组的1．48倍（P〈0．01）和2倍（P〈0．01）。免疫组化显示Kupffer细胞胞浆内PAF呈阳性表达。肝硬化大鼠的Kupffer细胞PAF结合能力Bmax明显升高（P〈0．01）,而受体亲和力Kd与对照组比较无明显变化。RT-PCR显示PAF受体mRNA表达明显增加（P〈0．05）。结论Kupffer细胞是肝硬化时PAF生成的一个重要来源,通过增加PAF合成和释放并上调PAF受体表达,Kupffer细胞参与肝硬化门脉高压的形成。     

库普弗细胞清道夫受体、CD14表达变化及其与内毒素性肝损伤的关系

目的　从细胞受体水平探讨内毒素性肝损伤过程中肝内库普弗细胞 (KC)由防御性逐步转化为效应性的机制。　方法　经尾静脉注射不同剂量内毒素 (LPS)复制轻、中、重度内毒素血症小鼠模型。肝内KC表面清道夫受体 (SR)、CD14表达测定采用免疫组化法 ,并进行计算机图像分析。　结果　注射LPS后 1h ,高剂量组肝内KC表面SR表达明显减少 ,至 3h ,低剂量和中剂量组KC表面SR表达也开始明显减少 ,并随观察时间延长 ,3组KC表面SR表达均进行性减少 ,3组间SR的吸光度差异有显著性意义。 3组肝内KC表面CD14表达在注射LPS后 1h均明显增多 ,并随时间延长而更加明显 ,但 3组间CD14的吸光度无统计学意义。相关分析显示 ,各剂量组肝内SR与CD14表达变化呈显著负相关。血浆丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、总胆红素 (TB)和肝组织内丙二醛 (MDA)水平变化分别与SR表达下调呈显著负相关 ,与CD14表达上调呈显著正相关。肝组织结构改变及动物死亡率也与肝内KC表面SR、CD14表达变化呈明显的平行关系。　结论　内毒素致肝损伤过程中 ,肝内KC表面SR表达下调、CD14表达上调可能是KC防御功能减弱、致炎作用增强的重要机制。     

土茯苓提取物对消化道肿瘤细胞的体外作用

目的 探讨土茯苓提取物对消化道肿瘤细胞的体外作用.方法 采用MTS法,观察不同浓度的土茯苓提取物对4种消化道肿瘤细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期和细胞调亡率.结果 土茯苓提取物对Eca-109、SGC-7901和COLO205细胞有增殖抑制作用,抑制率与药物浓度呈正比,对JF305细胞无明显增殖抑制作用.其可诱导Eca-109、SGC-7901细胞S期细胞明显增加,细胞凋亡率随药物浓度的增加而增加.结论 土茯苓提取物对Eca-109和SGC-7901细胞具有抑制增殖、诱导S期细胞增加和诱导细胞凋亡的作用;对COLO205细胞增殖也有一定抑制作用,但对JF305无明显增殖抑制作用.