青蒿琥酯逆转Eca109/ABCG2细胞对阿霉素耐药的作用及机制

目的研究青蒿琥酯(Art)逆转食管癌耐药细胞Eca109/ABCG2对阿霉素(ADM)耐药的作用及其机制。方法采用不同浓度的青蒿琥酯(Art,0、0.01、0.1、1μmol/L),阿霉素(ADM,0、0.02、0.2、2、20mg/L),Art(0.01、0.1、1μmol/L)+ADM(0.02、0.2、2、20mg/L)处理Eca109/ABCG2细胞48h,然后以MTT法检测细胞生长抑制率。采用ADM(0、0.02、0.2、2mg/L),Art(0、0.01、0.1、1μmol/L)和ADM(0.2mg/L)+Art(0.01、0.1、1μmol/L)处理细胞,48h后以流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率及细胞内ADM含量,72h后检测细胞内ABCG2蛋白的表达。结果与单独应用Art或ADM相比,Art+ADM处理后,Eca109/ABCG2细胞的生长抑制率、凋亡率和细胞内ADM含量均显著增加(P<0.05),而细胞内ABCG2蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 Art可通过下调Eca109/ABCG2细胞ABCG2蛋白表达,增加细胞内ADM的药物浓度,从而增强疗效、逆转耐药。     

胃腺癌CDC25A表达及青蒿琥酯干预的实验研究

目的 初步探讨细胞分裂周期素25A(CDC25A)与胃腺癌发生、发展的关系,以及青蒿琥酯对其的干预作用.方法 利用流式细胞术检测胃腺癌组织中CDC25A蛋白表达水平.细胞水平实验分为4组:对照组及30、60、120μmol/L青蒿琥酯组,即以不同浓度(30、60、120μmol/L)青蒿琥酯(Art)干预胃腺癌SGC-7901细胞24h,并以生理盐水代替药物作为对照组,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期及CDC25A蛋白表达水平.结果 胃腺癌组织中CDC25A蛋白表达水平(419.69±21.91)明显高于正常胃组织中的表达水平(316.11±24.23,P<0.01).30、60、120μmol/L青蒿琥酯组细胞凋亡率(分别为5.48%±0.67%、12.55%±1.17%、23.43%±2.18%)明显高于对照组(0.87%±0.14%,P<0.05),且具有Art剂量依赖性.30、60、120μmol/L青蒿琥酯组细胞增殖指数(分别为39.18%±0.53%、35.71%±0.99%、31.73%±1.02%)明显低于对照组(44.12%±2.51%,P<0.01);30、60、120μmol/L青蒿琥酯组细胞中CDC25A蛋白表达水平(分别为414.80±4.06、397.86±3.61、345.68±7.11)明显低于对照组(433.99±1.56,P<0.01).结论 CDC25A在胃腺癌组织中的高表达可能参与了胃腺癌的发生、发展,Art具有抑制胃腺癌SGC-7901的细胞生长作用,且可以下调细胞CDC25A的蛋白表达水平.     

IL-34对食管鳞癌细胞增殖、凋亡和迁移的作用研究

目的 研究白细胞介素-34(interleukin 34, IL-34)在食管鳞癌中的表达及其对食管鳞癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 采用免疫组织化学染色检测IL-34在食管鳞癌组织标本中的表达情况,采用qRT-PCR法探究IL-34在不同食管鳞癌细胞系中mRNA表达水平。利用慢病毒感染,过表达食管鳞癌细胞系ECA-109中IL-34,高内涵筛选后通过Celigo细胞计数检测细胞增殖能力,通过流式细胞术检测细胞凋亡能力,通过划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力。结果 癌组织中IL-34水平高于正常组织,但由于临床样本过少差异无统计学意义(P>0.05);食管鳞癌细胞系中IL-34的mRNA水平显著高于正常食管上皮细胞(P<0.01)。IL-34过表达可显著减少ECA-109细胞凋亡,促进其增殖和迁移(P<0.01)。结论 IL-34在食管鳞癌中过表达,并与食管鳞癌细胞的增殖、迁移和凋亡显著相关,可能成为食管鳞癌新的标志物。     

Bcl-2基因特异性小干涉RNA增强食管癌细胞辐射敏感性的实验研究

目的 探讨Bcl-2基因特异性的小干涉RNA (siRNA)对食管癌细胞的辐射增敏作用。方法 构建表达Bcl-2基因特异性siRNA的真核表达载体,并借助脂质体将其转入食管癌细胞EC109。Western blot检测Bcl-2蛋白在食管癌细胞的表达,流式细胞仪检测食管癌细胞的凋亡,克隆形成实验和裸鼠移植瘤生长抑制实验检测Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体联合X射线照射对食管癌的生长抑制作用。结果 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可抑制Bcl-2蛋白在EC109细胞中的表达,诱导EC109细胞凋亡,增强X射线照射对EC109细胞克隆形成的抑制能力,增强X射线照射对EC109裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结论 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可显著增强食管癌细胞对X射线照射的敏感性,具有良好的临床应用前景。     

ABCG_2食管癌耐药细胞系Eca109/ABCG_2的建立

目的 探讨腺苷三磷酸结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG_2)在介导食管癌多药耐药中的作用.方法 扩增ABCG_2基因,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNNA3.1-ABCG_2重组质粒,转染Eca109细胞后用G418筛选稳定转染细胞.采用流式细胞术检测细胞内阿霉素的含量,评价细胞对药物的外排作用.MTT法检测阿霉素对Eca109/ABCG_2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞生长的抑制作用,并计算半数抑制浓度(IC_(50))和细胞的耐药指数.采用Western blotting和RT-PCR法检测细胞中ABCG_2蛋白及mRNA的表达量.结果 成功建立转染ABCG_2基因的Eca109/ABCG_2细胞.Eca109/ABCG_2细胞中ABCG_2的mRNA和蛋白表达量升高.阿霉素对Eca109/ABCG_2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞的IC_(50)值分别为18.61±3.94、4.18±0.14、4.69±0.88μg/ml.Eca109/ABCG_2细胞对阿霉素的耐药指数为3.97,且外排阿霉素的作用增强.结论 Eca109/ABCG_2细胞具有ABCG_2的耐药表型,能够稳定表达ABCG_2蛋白,可作为研究ABCG_2介导的多药耐药相关机制的细胞模型.     

Podoplanin、β-catenin及血管内皮生长因子受体3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及意义

目的 观察Podoplanin、β-catenin及血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)在人食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌)组织及癌周边区正常食管组织淋巴管的表达,寻找可用于食管鳞癌组织淋巴管研究的标记物.方法 取食管鳞癌患者手术切除组织63份,癌周正常食管组织20份.用免疫组化法检测食管癌组织及癌周边区Podoplanin、β-catenin及VEGFR-3的表达情况.区分有淋巴结转移和无淋巴结转移的食管癌组织标本,比较VEGFR-3表达阳性率的差异.选取正常食管组织和食管癌组织中微脉管丰富的区域,在镜下(×200)计数Podoplanin标记为阳性的淋巴管数量,计算微淋巴管密度(LMVD).结果 结合镜下淋巴管和血管的典型形态学特征,可以确定Podoplanin(m性表达呈棕黄色间断线状)只表达于淋巴管和毛细淋巴管内皮细胞膜上.VEGFR-3呈棕黄色表达于淋巴管内皮细胞上,在癌细胞胞质和血管壁也可呈阳性表达VEGFR-3在有淋巴结转移的食管癌标本中淋巴管的表达阳性率明显高于无淋巴结转移标本(分别为68.57%、28.00%,P<0.001).β-catenin在正常食管及食管癌组织的淋巴管均可呈阳性表达(棕褐色、均匀的线状染色),但在癌组织淋巴管的表达(47.62%)显著高于正常组织和(20.00%,P<0.05).正常食管组织LMVD(1.46±0.47)明显低于食管癌组织(4.29±1.05,P<0.01).结论 Podoplanin可作为食管癌组织内淋巴管的特异性标记物,VEGFR-3和βcatenin可作为非特异性标记物.VEGFR-3在淋巴管的表达与淋巴结转移密切相关.     

fas基因修饰食管癌细胞的体外抑瘤效应

为研究fas基因转导对食管癌细胞的体外抑制作用，构建fas基因真核表达3载体fas-pBK并将其转导入食管癌细胞EC109.Western blot结果证实fas基因转导株Fas-EC109表达高水平的Fas蛋白；细胞生长曲线和软琼脂集落形成实验结果显示，与对照细胞相比，Fas-EC109的群体倍增时间延长，克隆形成能力降低，MTT比色法表明Fas-EC109对CDDP、VCR、5－FU的敏感性明显增加。本研究结果提示，转导fas基因能有效抑制体外培养的食管癌细胞的生长，增强癌细胞对化疗药物的敏感性。     

MMP-7在食管癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨MMP7表达与食管癌生物学行为的关系。方法采用免疫组化SABC法检测MMP7在食管鳞癌中的表达。结果在正常食管癌鳞状细胞MMP7呈阴性表达;在食管癌组织中主要表达于癌细胞膜和胞质中;间质细胞中无表达。在食管癌中阳性表达率为42.1%(32/74);MMP7表达与食管癌淋巴结转移、临床分期、静脉侵犯和浸润深度有关(P<0.05);与性别、年龄、病理类型、病理分化无关(P>0.05)。结论MMP7在食管癌进展中有重要作用,可能是一个独立预后指标。常规检测其在食管癌中的表达,有助于食管癌治疗和预后的判断。     

乙酰肝素酶、缺氧诱导因子-1α的表达与食管鳞癌浸润转移的关系

目的:探讨乙酰肝素酶(heparanase,HPA)及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factors-1α,HIF-1α)在食管鳞癌中的表达及其与食管鳞癌浸润转移的关系.方法:应用原位杂交技术检测70例食管鳞癌组织和23例切缘正常组织中HPA mRNA表达,同时应用免疫组化法检测HIF-1α蛋白在全部标本中的表达.结果:癌组织中HPA mRNA和HIF-1α的阳性表达率分别为65.7%(46/70)和55.7%(39/70),显著高于切缘正常组织(P＜0.05);HPA mRNA和HIF-1α的表达与食管鳞癌组织浸润深度、淋巴结转移有关(P＜0.05);在食管鳞癌组织中HPA mRNA的表达与HIF-1α的表达关系密切(Kappa=0.615,P＜0.05).结论:HPA和HIF-1α阳性表达与食管鳞癌的生长及浸润转移有关,两者在食管鳞癌的发生、发展过程中可能存在着一定的协同作用;检测HPA与HIF-1α表达有助于食管鳞癌生物学性能的判断.     

食管癌患者明胶酶B基因表达增强

目的　了解明胶酶B在食管癌浸润、转移中的作用。方法　 36例食管癌患者术中取癌组织及正常组织 ;提取组织总RNA :用共扩增逆转录定量PCR方法测定其明胶酶B基因表达水平。结果　食管癌组织明胶酶B(MMP9)的基因表达明显高于正常食管组织 ;发生局部淋巴结转移者其MMP9基因表达水平明显高于无转移者。结论　明胶酶B在食管癌的浸润、转移中可能起重要作用     

青蒿琥酯逆转裸鼠种植食管癌耐药作用研究

目的 探讨三磷酸腺苷结合转运蛋白G2(ABCG2)与食管癌多药耐药的关系以及青蒿琥酯(Art)逆转食管癌多药耐药的作用机制.方法 将食管癌多药耐药细胞Eta109/ABCG2接种于裸鼠皮下,建立荷瘤裸鼠动物模型.裸鼠皮下成瘤后用药,经腹腔给予Art和(或)阿霉素(ADM),分为Art高、低剂量组(50、25mg/kg ...     

食管癌血清标志物的生物信息学筛选及其临床诊断价值验证

目的通过GEO数据库和生物信息学分析,寻找食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)潜在的血清学标志物,并探讨其在ESCC筛查诊断中的应用价值。方法通过GEO数据库（GSE38129）对ESCC患者癌组织和癌旁组织各30例样本进行分析,筛选出表达差异最明显的mRNA-基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1,MMP1）,并进一步通过在线基因表达谱分析工具（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)验证MMP1在癌组织和癌旁组织(para-cancerous tissues,PCT)的表达差异和预后的相关性。随后采用电化学发光免疫分析仪检测食管癌患者（109例）及健康人群（110例）血清样本中鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCC)、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1,CYFRA21-1）的浓度,同时双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清MMP1浓度。结果在GEO数据库（GSE38129）中MMP1的表达差异最为明显（logFC=4.849,P=7.90E-12）。在GEPIA数据库182例癌组织和286例癌旁样本中MMP1表达也有差异（P<0.05）,生存分析显示MMP1与ESCA的总体生存率（Logrank P=0.4）和无瘤生存率（Logrank P=0.73）无关。ESCC患者血清MMP1、CEA、CYFRA21-1和SCC浓度均明显高于对照组的健康体检者（P<0.05）;ESCC患者血清MMP1、CEA、CYFRA21-1和SCC浓度均随肿瘤分期升高而升高,呈正相关;血清MMP1和SCC联合检测ESCC的诊断灵敏度和特异性分别为82.13％和76.80％。结论外周血MMP1和SCC联合检测能显著提高ESCC的灵敏度与特异性,有利于ESCC的筛查诊断。     

Influence and mechanism of 5-aminolevulinic acid-photodynamic therapy on the metastasis of esophageal carcinoma

BackgroudPhotodynamic therapy (PDT) for the treatment of esophageal cancer was more and more popularly used since it was approved for the treatment of advanced esophageal cancer in 1996. It has been reported to influence the tumor growth and metastasis via a variety of signaling pathways, but its mechanism remains to be further studied. This research studied the effects of ALA-PDT on esophageal carcinoma in vitro and in vivo, discovering its molecular regulating mechanism and the way to enhence the PDT effect.MethodsEca-109 cells were incubated with a medium containing EGFR tyrphostin AG1478 or PI3K inhibitor LY294002, then with ALA, and the cells were irradiated with the laser 6 h later. The cell viability was measured with MTT assay, and the migration ability was detected by transwell experiments 24 h post-ALA-PDT. The gene and protein expression on EGFR/PI3K/AKT signaling pathway was analyzed by realtime PCR and Western blotting respectively. Then, RFP-Eca-109 burdened nude mice model was constructed, and were treated with ALA-PDT when the tumor volume reached 150–350 mm³. The gene and protein expression were analyzed 24 h and 50 days post-ALA-PDT.ResultsOur study showed that ALA-PDT respectively combined with AG1478, LY294002 could synergistically reduce the growth and migration ability of the Eca-109 cells in vitro and significantly down-regulate the protein expression of EGFR/PI3K and PI3K/AKT, meanwhile, significantly down-regulate the gene expression of EGFR when combining with AG1478. Forthermore, ALA-PDT could significantly decrease the tumor growth and metastasis and down-regulate the gene expression of EGFR and the protein expression of EGFR and PI3K in the tumor of mice.ConclusionThis study revealed a molecular mechanism of ALA-PDT and developed a new modality application of therapy, by combining ALA-PDT with small molecular inhibitors, for better effect in the clinical practice of esophageal carcinoma.     

远端上游元件结合蛋白1在食管癌中的表达及意义

目的 探讨远端上游元件结合蛋白1 (FUBP1)在食管癌组织中的表达及其与食管癌临床特征的关系.方法 应用免疫组织化学技术检测37例食管癌组织、35例食管癌癌旁组织、12例食管炎组织中FUBP1的表达水平;采用荧光定量反转录聚合酶链反应(FQ:PCR)检测32例食管癌、32例食管癌癌旁组织中FUBP1 mRNA的表达水平.结果 免疫组化结果显示,FUBP1在食管癌的阳性表达率为81.1％,明显高于癌旁组织(31.4％)和食管炎(33.3％,P＜0.05),而癌旁组织与食管炎组织之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).FQ-PCR结果显示,FUBP1 mRNA在食管癌组织中的相对表达量(0.2650±0.1356)明显高于在癌旁组织中的相对表达量(0.1982±0.0263,t=2.638,P=0.013).FUBP1 mRNA 含量在食管癌及癌旁组织中的表达与性别、年龄无关(P＞0.05),与分化程度、淋巴结转移、远处转移有关(P＜0.05).结论 FUBP1在食管癌的发生、发展中起重要作用,其表达升高增强了食管组织癌变的易感性,可能在食管癌的发生、发展、浸润、转移中发挥重要作用.     

食管癌及癌旁组织p53蛋白、VEGF及MVD联合检测的临床意义

目的讨论食管癌及癌旁组织中MVD、VEGF和p53蛋白表达与食管癌临床、病理因素之间的关系,探讨其表达在食管癌患者转移、预后中的作用,并为以食管癌血管生成为靶点的靶向治疗提供理论基础。方法采用免疫组织化学方法,检测30例食管癌患者手术切除标本中癌灶、癌近旁、癌远旁组织的p53蛋白、VEGF的表达,并用FⅧ相关抗原标记、检测MVD。进行统计学分析,探讨其在性别、年龄、临床分期、淋巴结转移、生存率中的关系。结果①癌灶内VEGF阳性染色主要位于癌细胞胞浆内,癌灶p53蛋白阳性染色主要位于癌细胞胞核内,呈棕褐色。肿瘤内血管分布呈明显异质性,在癌组织浸润的边缘较密集,p53蛋白、VEGF、MVD与食管鳞癌关系在性别、年龄、TNM中无显著性差异。但在不同部位、有无淋巴结转移和5年生存率中有显著的统计学差异。②p53蛋白与VEGF表达有显著相关性（P〈0．05）。③p53、VEGF表达与MVD相关性具有显著统计学差异。结论在食管鳞癌组织及癌近旁、癌远旁组织中p53蛋白、VEGF、MVD均有不同程度表达,阳性表达率有显著性差异。联合检测可作为食管鳞癌恶性潜能的重要生物学指标．并为食管癌手术切除长度从一个新的角度提供参考及理论基础,并可作为其判断预后的重要生物学指标,并为以血管生成为靶点的靶向治疗提供参考。     

Omi/HtrA2在食管癌中的表达及其与细胞凋亡的关系

目的探讨Omi/HtrA2蛋白在食管鳞癌中的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系。方法采用免疫组化SP法对95例经病理确诊为食管鳞癌患者的正常组织、癌旁组织及癌组织进行Omi/HtrA2蛋白半定量免疫组化分析,用TUNEL法检测石蜡切片中肿瘤细胞凋亡情况,通过统计学软件SPSS 11.0进行结果分析,确定食管癌中Omi/HtrA2表达对肿瘤细胞凋亡的影响。结果①Omi/HtrA2在食管正常组织、癌旁组织、鳞癌组织的阳性表达率分别为22.50%、27.50%、74.74%。②Omi/HtrA2蛋白在不同组织中的表达情况进行两两比较,发现癌组织的阳性率与正常组织、癌旁组织比较,有显著性差异（P〈0.05）,正常组织与癌旁组织阳性率比较未见有显著性差异,无统计学意义（P〉0.05）。③Omi/HtrA2表达阳性者细胞凋亡指数明显高于Omi/HtrA2表达阴性者（P〈0.01）。结论 Omi/HtrA2参与了食管鳞癌的发生、发展,可以作为判断食管鳞癌预后的指标,Omi/HtrA2在食管癌细胞的凋亡中发挥凋亡促进作用。     

食管癌组织中PR-SET7的表达及其与临床特征、增殖细胞核抗原的相关性

 目的 探讨赖氨酸甲基转移酶(Lysine methyltransferase, KMT) PR-SET7在食管癌组织中的表达及其与临床特征、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)之间的相关性。方法 选择2010-06至2011-02住院的食管癌患者32例,应用免疫组织化学法检测食管癌组织和癌旁组织中PR-SET7和PCNA的表达,并分析PR-SET7表达量与患者性别、年龄、细胞分化程度、TNM分期和淋巴结转移等临床特征的相关性,以及PR-SET7的表达情况和PCNA指数之间的相关性。结果 PR-SET7及PCNA均以核表达为主,癌组织中PR-SET7及PCNA的表达明显强于癌旁组织,其中PR-SET7高表达率为81.25%,癌旁组织中以低表达为主,高表达率为15.62%(P<0.01);PCNA指数癌组织中为68.12±16.03,癌旁组织38.22±20.56,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。PR-SET7在食管癌中的表达与肿瘤细胞分化程度、TNM分期和淋巴结转移有相关性(P<0.05),与患者的性别、年龄无相关性(P>0.05)。PR-SET7的表达程度和PCNA指数有相关性(r_s=0.551,P=0.001)。结论 食管癌组织中PR-SET7异常表达,其表达水平可能与肿瘤的进展、转移及预后密切相关;PR-SET7的表达与PCNA指数有显著相关性,对探讨其作用机制有一定意义。     

S100钙结合蛋白A6在胃癌组织中表达的意义

目的探讨S100钙结合蛋白A6(S100A6)在胃癌旁正常组织、慢性胃炎、肠上皮化生和胃癌的组织标本中的表达,以及其与胃癌临床病理特征及预后的关系。方法收集中国医科大学附属盛京医院2005年6月至2015年6月胃组织标本,其中胃黏膜肠上皮化生组织(24例)、胃癌(42例)及癌旁正常组织标本(42例)。qRT-PCR法检测S100A6 mRNA在不同组织中表达;Western blot法检测S100A6蛋白的表达;采用Kaplan-Meier生存曲线用于区分和比较生存率;Cox比例风险模型用于多因素分析。结果 S100A6蛋白的表达按以下顺序逐渐增加:癌旁正常组织<慢性胃炎<肠上皮化生<胃癌。S100A6蛋白的表达与胃癌肿瘤大小、浸润深度、淋巴管和静脉侵犯、淋巴结转移、肿瘤TNM分期呈正相关。Kaplan-Meier生存曲线提示,高中度S100A6基因表达的患者累积生存率明显低于不表达的患者。Cox比例风险模型提示肿瘤的浸润深度、淋巴管及静脉浸润、淋巴结转移、TNM分期以及S100A6高表达均为胃癌患者预后的独立因素。结论在胃炎、肠上皮化生、胃癌中S100A6蛋白的表达逐渐升高;S100A6高阳性表达是胃癌预后的独立影响因素。     

乳腺癌P~(53)蛋白表达和微血管密度计数的临床意义

目的　探讨乳腺癌中P53蛋白表达和微血管密度 (MVD)计数间的关系及其临床意义。方法　应用S P免疫组织化学方法检测乳腺癌中P53蛋白的表达并对微血管密度进行计数 ,同时对结果进行分析。结果　乳腺癌和癌旁不典型增生组织P53蛋白的阳性率分别为 3 9 6% (3 8/96)和 8.9% (6/5 6)。组织学Ⅲ级癌P53蛋白阳性率 (5 5 .3 % ,2 1 /3 8)高于Ⅰ级癌 (2 0 .8% ,5 /2 4) (P <0 .0 5 )。乳腺癌P53蛋白的阳性率与淋巴结转移和ER状态相关 (P <0 .0 5 ) )。 96例乳腺癌平均MVD(5 1 .3± 1 7.0 )明显高于癌旁不典型增生组织 (2 9.3± 9.5 ) (P <0 .0 1 )。MVD计数与组织学分级 (P <0 .0 1 )和淋巴结转移 (P <0 .0 1 )密切相关 ,但与ER状态无关 (P >0 .0 5 )。MVD计数与P53蛋白表达呈正相关 ,与 5年生存率呈负相关。结论　联合检测P53蛋白表达和MVD计数不但可以作为乳癌患者的预后指标 ,而且对揭示早期乳腺癌是有帮助的。